Real-timePCR數(shù)據(jù)分析

1、由于 Real-timeqPCR 的眾多優(yōu)點， 現(xiàn)在已經(jīng)是生命科學(xué)領(lǐng)域的一項常規(guī)技術(shù)。 越來越多的研究文章中涉及 RT-PCR 的實驗，也基本上被 real-timeqPCR 所代替。由于 real-timeaPCR 輸出的數(shù)據(jù)不同于常規(guī)的PCR 電泳檢測，很多沒有做過 real-timeqPCR 的研究者常常感到高深莫測，不知從何入手；甚至一些做過次實驗的研究者也會對數(shù)據(jù)處理分析感到迷惑，不知所措。本文就從 real-timeqPCR 的發(fā)展史說起，包括 real-timeqPCR 的原理，實驗設(shè)計，實際操作，數(shù)據(jù)分析，常見問題解答五個方面，手把手教你從各個方面了解 real-timeqPC

2、R,徹底的從菜鳥到高手！一、Real-timeqPCR 發(fā)展史Real-timeqPCR 就是在 PCR 擴增過程中，通過熒光信號，對 PCR 進(jìn)程進(jìn)行實時檢測。由于在 PCR 擴增的指數(shù)時期， 模板的 Ct 值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系， 所以成為定量的依據(jù)。由于常規(guī)的 PCR 的缺點，real-timeqPCR 由于其操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點發(fā)展非常迅速?，F(xiàn)在已經(jīng)涉及到生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，比如基因的差異表達(dá)分析，SNP 檢測，等位基因的檢測，藥物開發(fā)，臨床診斷，轉(zhuǎn)基因研究等。在 Real-timeqPCR 技術(shù)的發(fā)展過程中，定量 PCR 儀的發(fā)展起了至關(guān)重要的作用。19

3、95年，美國 PE 公司（已經(jīng)并入 Invitrogen 公司）成功研制了 Taqman 技術(shù)，1996 年推出了首臺熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)，通過檢測每個循環(huán)的熒光強度，通過 Ct 值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。從而熒光定量 PCR 獲得廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)在的定量 PCR 儀有 ABI7000、7300、7500,7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISMStepOneTM 系列；BIO-RAD 的 CFX96、iCycle 門 Q5、MyiQ、MJResearchChrom04TMOpticon 系歹 U;StratageneMxTM 系歹 U;RocheLightCy

4、cler系列；EppendorfMasercycler;CorbettRotor-GeneTM;CepheidSmartCycler和 BIOER 的 LineGene 系歹U。隨國內(nèi)生命科學(xué)的快速發(fā)展，科研水平不斷提高，發(fā)高水平文章已不再是新鮮事。與其同時，國內(nèi)公司經(jīng)過長期不懈的努力，也有自主研發(fā)的 real-timePCR 儀器生產(chǎn)比如西安天隆科技公司的 TL 系列儀器。二、Real-timeqPCR 概述1. Real-timeqPCR 原理實時 PCR 就是在 PCR 擴增過程中，通過熒光信號，對 PCR 進(jìn)程進(jìn)行實時檢測。一般來講，定量 PCR 儀包括：實時熒光定量 PCR 儀主要由

5、樣品載臺、基因擴增熱循環(huán)組件、微量熒光檢測光學(xué)系統(tǒng)、微電路控制系統(tǒng)、計算機及應(yīng)用軟件組成。其中基因擴增熱循環(huán)組件工作原理與傳統(tǒng)基因擴增儀大致相同，不同廠家不同型號的產(chǎn)品分別采用空氣加熱、壓縮機制冷、半導(dǎo)體加熱制冷等工作方式。獨特是這個微量熒光檢測系統(tǒng)。有由熒光激發(fā)光學(xué)部件、微量熒光檢測部件、光路、控制系統(tǒng)組成。常用的熒光激發(fā)方式有兩種：鹵鴇燈和 LED;熒光檢測元件常用兩種方式：光電倍增管和冷光 CCD 攝像機，光單色元件有濾光片和光柵。在實時 PCR 擴增過程中，熒光信號被收集，轉(zhuǎn)化為成為擴增和熔解曲線。具體數(shù)據(jù)就是基線，熒光閾值和 Ct 值。2. Real-timeqPCR 的數(shù)學(xué)原理首先

6、來看一個 real-timeqPCR 中的重要參數(shù) Ct 值（Ctvalue） ， 閾值 （threshold） ,和基線 （baseline） 。一般來講，第 3-15 個循環(huán)的熒光值就是基線，是由于測量的偶然誤差引起的。閾值一般是基線的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。在實際操作中也可以手動調(diào)節(jié)，位于指數(shù)期就可以。Ct 值就是熒光值達(dá)到閾值時候的 PCR 循環(huán)次數(shù)。所以是一個沒有單位的參數(shù)。那么為什么說 Ct 值跟初始模板的量成反比呢？我們來看 PCR 的擴增方程：從線性方程上看，斜率（slope）為-1/lg（1+E）,所以 E=10-1/slope-1。如果從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到斜率（-3.3）,就可以

7、算出擴增效率（0.99）。一般來講 PCR 擴增效率在 90%-110%都是可以用于數(shù)據(jù)分析的。效率低于 100%,是由于 PCR 反應(yīng)中存在抑制因素；而高于 100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。3. Real-timeqPCR 的種類根據(jù) real-timeqPCR 的化學(xué)發(fā)光原理可以分為 2 大類：一類為探針類，包括 TaqMan探針和分子信標(biāo)，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加；一類為非探針類，其中包括如SYBRGreenI 或者特殊設(shè)計的引物（如 LUXPrimers）通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。3.1 Taqman 探針法Taqman 探針是最早用于

8、定量的方法。就在 PCR 擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核甘酸：5端標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)，3端標(biāo)記一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，也就是 FRET 反應(yīng)；PCR擴增時，Taq 酶白 5-3外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步。 而新型 TaqMan-MGB 探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP）,有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術(shù)平臺。3.2 分

9、子信標(biāo)法分子信標(biāo)：一種在靶 DNA 不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核甘酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，位于分子一端的熒光基團(tuán)與分子另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為 15-30 個核甘酸長，并與目標(biāo)序列互補；莖一般 5-7 個核甘酸長，并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標(biāo)必須非常仔細(xì)的設(shè)計，以致于在復(fù)性溫度下，模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，模板存在時則與模板配對。與模板配對后，分子信標(biāo)的構(gòu)象改變使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時，它發(fā)出自身波長的光子。3.3 SYBRGreen 法SYBRGreenI 是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈

10、DNA 結(jié)合染料，與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強。這一性質(zhì)使其用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBRGreenI 的最大吸收波長約為 497nm,發(fā)射波長最大約為 520nm。在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過量 SYBRGreen 熒光染料，SYBRGreen 熒光染料特異性地?fù)饺?DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBRGreen 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR產(chǎn)物的增加完全同步。3.4 LUXPrimers 法LUX（lightuponextention）引物是利用熒光標(biāo)記的引物實現(xiàn)定量的一項新技術(shù)。目標(biāo)特異的引物對中的一個引物 3端用熒光

11、報告基團(tuán)標(biāo)記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在有目標(biāo)片斷的時候，引物與模板配對，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生特異的熒光信號。4. Real-timeqPCR 和常規(guī) PCR 的區(qū)別實時檢測（在對數(shù)擴增時期）而不是終點檢測敏感性高需要樣品少特異性高精確定量三、Real-timeqPCR 實驗設(shè)計實驗設(shè)計其實比實驗本身更重要！好的實驗設(shè)計可以事半功倍，節(jié)省時間！尤其做生物實驗，一定要查詢盡可能完全的相關(guān)資料，整理好思路，設(shè)計好實驗路線。當(dāng)然實驗過程中出現(xiàn)各種各樣的變化，但有足夠多的背景知識，就可以分析原因，才有可能創(chuàng)新。對于一個real-timeqPCR 而言，首先就是實

12、驗材料的處理和準(zhǔn)備；然后引物設(shè)計，這步至關(guān)重要，好的引物是實驗本身成功的 50%;進(jìn)行實驗和數(shù)據(jù)分析（這一部分單獨說明）。.實驗材料的處理和準(zhǔn)備以最基本的基因表達(dá)差異分析為例。實驗材料分為對照組（CON）和處理組（TRT）。組內(nèi)要有生物重復(fù)，可以數(shù)據(jù)分析此處理是否有統(tǒng)計意義。在材料收集過程中，盡量避免 RNA 的降解（尤其對于絕對定量的樣品）。一般傳統(tǒng)的收集材料的方法是樣品采集立刻液氮速凍，然后迅速轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱保存，但這種方法攜帶不方便，由于對于異地取材?，F(xiàn)在新技術(shù)的發(fā)展，也有一些非液氮類的樣品儲存液，比如百泰克的 RNAfixer。.引物設(shè)計一般 real-timePCR 引物的設(shè)計遵循

13、下面一些原則：擴增產(chǎn)物長度在 80-150bp。引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。產(chǎn)物長度一般在 15-30 堿基之間。G+C 含量在 40%-60%之間。堿基要隨機分布。引物自身不能有連續(xù) 4 個堿基的互補。引物之間不能有連續(xù) 4 個堿基的互補。引物 5端可以修飾。引物 3端不可修飾。引物 3端要避開密碼子的第 3 位。Taqman探針的設(shè)計稍有不同，一般有公司設(shè)計合成。遵循下面以下原則：盡量靠在上游引物；長度 30-45bp,Tm 比引物高至少 5C；5端不要是 G,G 會有淬滅作用，影響定量四、Real-timeqPCR 操作過程.RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄在抽提

14、 RNA 過程中任一環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導(dǎo)致 RNA 酶的污染。由于 RNA 酶的活性很難完全抑制，預(yù)防其污染是十分必要的。在實際的操作中應(yīng)遵循下面一些原則：.全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌，可能污染 RNA 的抽提并成為 RNA 酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物實驗操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。.使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動吸管抽提 RNA,避免使用公共儀器所導(dǎo)致的 RNA酶交叉污染。例如，使用 RNA 探針的實驗室可能用 RNA 酶 A 或 T1 來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動吸管）可能富含 RNA 酶。.在提取裂解液中，RNA 是隔離在 RNA 酶污染之外的。

15、而對樣品的后續(xù)操作會要求用無 RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在 150C 的烘箱中烘烤 4 小時。塑料器皿可以在 0.5MNaOH 中浸泡 10 分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。當(dāng)然，這些也不是絕對的要求。如果是操作熟練。完全可以用初次開封的離心管和槍頭，新過濾的超純水，進(jìn)行 RNA 的提取。.Mix 配制一般來講，進(jìn)彳 freal-timeqPCRMasterMix 都是 2x 的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于 real-timeqPCR 靈敏度高，所以每個樣品至少要做 3 個平行孔，以防在后面的數(shù)據(jù)分析中，由于 Ct 相差較多或者 SD 太大，無法進(jìn)

16、行統(tǒng)計分析。通常來講，反應(yīng)體系的引物終濃度為100-400mM;模板如果是總RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據(jù)目的基因的表達(dá)豐度進(jìn)行調(diào)整。 當(dāng)然這些都是經(jīng)驗值， 在操作過程中， 還需要根據(jù)所用 MasterMix,模板和引物的不同進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到一個最佳反應(yīng)體系。在反應(yīng)體系配置過程中，有下面幾點需要注意：2af49-Numbered_840a6eaa-01f2-4624-816c-441e75aafcaf-Numbered_80abf49d-d773-4328-b646-f4b47858dbba(.MasterMix 不要反復(fù)凍融，如果

17、經(jīng)常使用，最好溶解后放在 4 度。2af49-Numbered_840a6eaa-01f2-4624-816c-441e75aafcaf-Numbered_80abf49d-d773-4328-b646-f4b47858dbba(.更多的配制 Mix 進(jìn)行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。2af49-Numbered_840a6eaa-01f2-4624-816c-441e75aafcaf-Numbered_80abf49d-d773-4328-b646-f4b47858dbba(.每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個槍頭加樣！2af49-Numbered_840a6eaa-01f2-46

18、24-816c-441e75aafcaf-Numbered_80abf49d-d773-4328-b646-f4b47858dbba(.所有成分加完后，離心去除氣泡。2af49-Numbered_840a6eaa-01f2-4624-816c-441e75aafcaf-Numbered_80abf49d-d773-4328-b646-f4b47858dbba(.每個樣品至少 3 個平行孔。參比或者校正染料(referencedye,passivedye)常用的是 ROXTM(現(xiàn)在已經(jīng)是 ABI的注冊商標(biāo)了！)或者其他染料，只要不影響檢測 PCR 產(chǎn)物的熒光值就可以。參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定

19、量反應(yīng)中的非 PCR 震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩(wěn)定的基線?，F(xiàn)在很多公司已經(jīng)把 ROXTM 配制在 MasterMix 或者 Premixture 里。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系，也可以不加 ROXTM 染料校正。通常來講，real-timeqPCR 的反應(yīng)程序不需要像常規(guī)的 PCR 那樣，要變性、退火、延伸 3 步。由于其產(chǎn)物長度在 80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBRGreen等染料法，最好在 PCR 擴增程序結(jié)束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷 PCR 產(chǎn)物的特異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認(rèn)設(shè)置，或稍有不同，但都是一

20、個在產(chǎn)物進(jìn)行溶解時候，進(jìn)行熒光信號的收集。3.儀器設(shè)置所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時候包括反應(yīng)板設(shè)置(platesetup)和程序設(shè)置(programsetup)。我們以 ABIStepOne 為例，詳細(xì)看一下反應(yīng)設(shè)置：A.首先是實驗?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke,”進(jìn)行定量”實驗。B.實驗方法的選擇：我們選用的比較 Ct 的 SYBRGreen 方法，F(xiàn)ast 程序，以 cDNA 為模板進(jìn)行。C.目的基因的設(shè)置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。D.樣品的設(shè)置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負(fù)對照的設(shè)置和生物重復(fù)的設(shè)置。E.對照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個是為后面的定

21、量做準(zhǔn)備F.反應(yīng)程序的設(shè)置：PCR 反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的 MasterMix。比如 BioTeke 的95c2 分鐘就可以激活 DNA 聚合酶(ABI 的需要 10 分鐘)。循環(huán)反應(yīng)是 95c15 秒， 60c15 秒的 40 個循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。G.反應(yīng)體系的設(shè)置：A-G 這五個步驟簡單設(shè)置好，可以保存，修改反應(yīng)程序或者立刻進(jìn)行反應(yīng)。需要注意一點 ABI 儀器需要加 ROX 參比染料，默認(rèn)的是 ROX。有些公司是把 ROX 或者其他染料配制在 MasteMix 里面；也有的是單獨分開。要根據(jù)不同公司的 MasterMix 進(jìn)行這

22、一個步驟的選擇。BioTeke 的 MasterMix 里沒有參比染料，所以選擇none：設(shè)置好之后，就可以把配置好的 PCR 管放進(jìn)儀器，點擊 RUN!五、Real-timeqPCR 數(shù)據(jù)分析.Real-timeqPCR 常見參數(shù)基線（baseline通常是 3-15 個循環(huán)的熒光信號同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線閾值(threshold)自動設(shè)置是 3-15 個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍手動設(shè)置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。Ct 值:與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系。分析

23、定量時候一般取 Ct:15-35。太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。Rn(Normalizedreporter)是熒光報告基團(tuán)的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。Rn：ARn 是 Rn 扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果(Rn=Rn-基線)。.影響 Ct 值的關(guān)鍵因素模板濃度模板濃度是決定 Ct 的最主要因素?？刂圃谝粋€合適范圍內(nèi)，使 Ct 在 15-35 之間。反應(yīng)液成分的影響任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響-比如溶液的 pH 值和鹽濃度。PCR 反應(yīng)的效率PCR 反應(yīng)的效率也會影響 Ct 值。在 PCR 擴增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴增，與 PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所

24、產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR 效率取決于實驗、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來，反應(yīng)效率在 90-110%之間都是可以接受的。.如何評估實時定量 PCR 反應(yīng)的效果PCR 擴增效率：為了正確地評估 PCR 擴增效率，至少需要做 3 次平行重復(fù)，至少做 5 個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。R2值：另一個評估 PCR 效率的關(guān)鍵參數(shù)是相關(guān)系數(shù) R2,它是說明兩個數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計學(xué)術(shù)語。如果 R2等于 1,那么你可以用 Y 值（Ct）來準(zhǔn)確預(yù)測 X 值（量）。如果 R2等于 0,你就不能通過 Y 值來預(yù)測 X 值。R2值大于 0.99 時，兩個數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。精確

25、度：標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation,偏差的平方根）是最常用的精確度計量方法。如果許多數(shù)據(jù)點都靠近平均值，那么標(biāo)準(zhǔn)偏差就??；如果許多數(shù)據(jù)點都遠(yuǎn)離平均值，則標(biāo)準(zhǔn)偏差就大。實際上，足夠多重復(fù)次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組會形成大致的正態(tài)分布。這經(jīng)常可通過經(jīng)典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機變量在無限多時趨向于正態(tài)分布。如果 PCR 反應(yīng)效率是100%,那么 2 倍稀釋點之間的平均 Ct 間隔應(yīng)該恰為 1 個 Ct 值。要以 99.7%的幾率分辨 2 倍稀釋濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差就必須小于等于 0.167。標(biāo)準(zhǔn)偏差越大，分到 2 倍稀釋的能力就越低。為了能夠在 95%以上的情況下分辨出 2 倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)偏差必須小于等于 0.250。靈敏度：無論 CT 絕對值是多少，任何能夠有效擴增和檢測起始模板拷貝數(shù)為 1 的系統(tǒng)都達(dá)到了靈敏度的極限。 PCR 效率是決定反應(yīng)靈敏度的關(guān)鍵因素。在檢測極低拷貝數(shù)時的另一個重要的考慮因素是，低拷貝時的模板數(shù)量不能按普通情況來預(yù)期。相反，它會遵循泊松分布，即進(jìn)行大量的平行重復(fù)，平均應(yīng)該含有一個拷貝的起始模板，實際上約 37%不含有拷貝，僅有約 37%含有 1 個拷貝，約 18%實際上含有兩個拷貝。因此，為了更可靠