HPV疫苗的制備-馬小艮

1、HPV 疫苗的制備及作用效果HPV 是一類能夠感染皮膚和粘膜的 DNA 病毒。高危型 HPV 是宮頸癌以及癌前病變的要致病因子，99.7%的宮頸癌組織都檢測出高危型 HPV。針對 HPV 感染，人類自身所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答主要分為體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫主要表現(xiàn)為 HPV 刺激機體 B 細(xì)胞產(chǎn)生抗 HPVL1、L2 蛋白的抗體，但是由于產(chǎn)生抗體的量特別少，所以很難檢測到這些特異性抗體，阻礙了人們對體液免疫的相關(guān)研究。細(xì)胞免疫主要表現(xiàn)為 T 細(xì)胞受 HPV 刺激后通過釋放淋巴因子來殺死感染病毒的細(xì)胞1,2。目前預(yù)防和治療 HPV 相關(guān)癌癥最有效的方法是研制其特異性的 HPV 疫苗，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中

2、和抗體，激發(fā)保護性免疫反應(yīng)，以達(dá)到預(yù)防 HPV 相關(guān)癌癥發(fā)生和傳播的目的，既可以降低宮頸癌的發(fā)病率，也可降低與 HPV 感染有關(guān)的其它癌癥的發(fā)病率。人類乳頭瘤病毒（HPV 是一種無包膜的雙鏈閉環(huán)小分子 DNA 病毒，屬乳頭多瘤空病毒科乳頭瘤病毒屬。其基因約 8kb,只有 1 條 DNA 鏈可作為轉(zhuǎn)錄模板，含 8 個開放閱讀框（openreadingframes,ORFS,分 3 個基因區(qū)，即早期區(qū)（earlyregion,E 區(qū)）、晚期區(qū)（lateregion,L 區(qū)）與非編碼區(qū)（uncodingregion,UCR 或上游調(diào)控區(qū)（URR。E 區(qū)編碼 E1,E2,E4,E5,E6,E7 等早期

3、蛋白，參與病毒 DNA 的復(fù)制、 轉(zhuǎn)錄、 翻譯調(diào)控和轉(zhuǎn)化等功能； L 區(qū)編碼主要衣殼蛋白 L1 和次要衣殼蛋白 L2;UCR區(qū)含有 HPV 基因組復(fù)制起點和 HPV 表達(dá)所必需的調(diào)控元件。由 HPV 產(chǎn)生的兩種癌蛋白是 E6 和 E7,可以抑制細(xì)胞周期負(fù)調(diào)節(jié)因子的活性，并可以在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)。而晚期基因則編碼衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白，其中主要衣殼蛋白 L1 結(jié)構(gòu)保守，是 HPV 衣殼的主要成分，約占衣殼蛋白的 80%以上，因此成為理想的預(yù)防免疫靶位?；?HPVW 致病機制和天然的免疫原性，HPVS 苗研究聚焦于 L1、E2、E5E6 和 E7。目前 HPVW 疫苗主要分為預(yù)防性疫苗和治療性疫苗。預(yù)

4、防性疫苗主要誘導(dǎo)機體體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的中和性抗體在 HPV 進入機體前即能與病毒的抗原結(jié)合，從而防止 HPV 的感染。治療性疫苗主要引起機體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的活化效應(yīng)性 T 細(xì)胞能識別和攻擊 HPV 感染的細(xì)胞，其中也包括 HPV 引起的惡性腫瘤細(xì)胞。（一）HPV 預(yù)防性疫苗1 .預(yù)防性疫苗的制備依據(jù)及過程預(yù)防性疫苗一般以 HPV 主要衣殼蛋白 L1 和次要衣殼蛋白 L2 為靶抗原3,其作用在于誘發(fā)肌體產(chǎn)生特異性的中和抗體和有效的局部免疫反應(yīng)，以阻止 HPV 的長期感染和再感染。HPV 的衣殼蛋白在真核以及原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時，能自我裝配或形成病毒樣顆粒（virus-likepartic

5、les,VLPs）,其結(jié)構(gòu)和抗原表位與天然的病毒顆粒十分相似，將其置入機體后可刺激產(chǎn)生中和抗體 IgG 和 IgA4,達(dá)到預(yù)防相應(yīng)型別 HPV 的感染，而且不包括病毒DNA,安全性好，能有效地保護人類和動物免受乳頭瘤病毒的感染以及產(chǎn)生相關(guān)腫瘤的可能性5,6。VLPs顆粒直徑為 50-55nm,分子量為 55-60kDa,VLPs是由純化的 L1蛋白裝配形成 HPV的空衣殼。 VLPs的最小結(jié)構(gòu)單元是 L1 蛋白單體，L1 蛋白主要是由 8 條反向平行的 3 折疊肽鏈段構(gòu)成的，它們之間是由無規(guī)則的環(huán)形區(qū)（loop）連接在一起的，每個環(huán)形區(qū)大約有 1030 個氨基酸（aa）,這些區(qū)域絕大部分延伸到

6、五聚體和病毒顆粒的外表面，是抗原表位的所在區(qū)域7-9;不同型別 HPV 環(huán)形區(qū)的序列和空間結(jié)構(gòu)是不同的，所以 HPV具有高度的型別特異性。因此，目前對于 HPV 抗原表位的研究主要集中在 L1 蛋白的環(huán)形區(qū)上10。國內(nèi)外有多家機構(gòu)在進行 HPV 疫苗的研究及其制備，大部分都是以 L1 和（或）L2蛋白為靶標(biāo)進行制備的（單獨表達(dá) L1 或者聯(lián)合表達(dá) L1+L2,獲得病毒樣顆粒（VLP）。一般步驟都是針對 HPVL1 和（或）L2 蛋白的核酸序列為基礎(chǔ)，對其進行改造優(yōu)化（例如密碼子優(yōu)化，刪除部分序列，替換某個/些堿基，連接其他基因等），擴增或者合成優(yōu)化后的序列，然后將其克隆到表達(dá)載體上，并在原核系

7、統(tǒng)（例如大腸桿菌）或者真核系統(tǒng)（例如昆蟲細(xì)胞，酵母，哺乳動物細(xì)胞等）進行表達(dá)，再將表達(dá)的單個蛋白或者融合蛋白分離純化，添加佐劑后制成疫苗，通過將制成的疫苗免疫小鼠或者其他動物對其免疫原性進行評價，效果較好的進行臨床實驗。2 .已經(jīng)被批準(zhǔn)上市的預(yù)防性疫苗目前已經(jīng)被批準(zhǔn)上市的預(yù)防性 HPV 疫苗有兩種，它們分別是英國葛蘭素（GlaxoSmithKline,GSK）公司的雙價疫苗“Cervarix”和美國默克（Merck&Co.,Inc.）公司生產(chǎn)的四價疫苗“Gardasil”（商品名）11。隨著這兩種疫苗的上市，人們對宮頸癌疫苗的研究主要集中在 HPVVLPs 疫苗上。2006 年，“Ga

8、rdasil”被批準(zhǔn)上市，這是第一個商品化的宮頸癌預(yù)防性疫苗，它是由兩個高危型 HPV16、18 和兩個低危型 HPV6、11 的L1-VLPS 組成的重組混合型疫苗，它們使用釀酒酵母體系產(chǎn)生 VLPs，佐劑為氫氧化鋁（225ug） 。 2007 年， 英國葛蘭素公司的“Cervarix” （商品名） 疫苗上市 12,它是 HPV16、 18 的 L1-VLPs組成的重組混合型疫苗，利用重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞（粉紋夜蛾）產(chǎn)生 VLPs,佐劑為傳統(tǒng)鋁鹽（500ug）加上 AS04（50ug）13,14。這兩種疫苗都是預(yù)防性的，不是治療性的，主要接種于未發(fā)生 HPV 感染的人群，用來預(yù)防 HP

9、V 感染以及相關(guān)疾病的發(fā)生。這兩種疫苗的抗原都是 HPV 主要衣殼蛋白的 L1。臨床試驗結(jié)果證明，上述疫苗均具有良好的耐受性， 且沒有嚴(yán)重的不良反應(yīng)， 抗體效價比自然感染 HPV 的患者高 50 倍。 此外， 最近 Merck公司又研發(fā)出了 Gardasil 九價預(yù)防性疫苗（HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58）。Gardasil 已在 117 個國家或地區(qū)被批準(zhǔn)使用，全球 33 個國家多中心的聯(lián)合試驗結(jié)果表明，疫苗對宮頸癌、癌前病變以及其他生殖道疾病的預(yù)防作用可達(dá) 99%100%;Cervarix 疫苗對 HPV16 和 HPV18 所致 CINn、 出的保護效力達(dá)到 1

10、00%;Merck 公司的九價疫苗已經(jīng)于 2015 年進入三期臨床試驗。二價疫苗針對 HPV1618 產(chǎn)生的保護性抗體均可維持 100%的血清陽性至少 8.4 年15;四價疫苗針對 HPV16 產(chǎn)生的保護性抗體能維持 98.8%的血清陽性至少 5年16。3 .其他處于研究階段的預(yù)防性疫苗（部分）Xie 等17在桿狀病毒昆蟲細(xì)胞中表達(dá)純化了 HPV16,18,58LIVLPs,對各型 VLPs 進行了純度、形態(tài)學(xué)及免疫原性的研究，特別是 HPV58L1VLPs 誘發(fā)長期中和抗體活性及協(xié)同 A1（0H）3佐劑的相關(guān)研究。在此基礎(chǔ)上，表達(dá)及純化了以 HPV16L1VLPs 為載體的嵌合各種 HPV1

11、6L2 保守表位的雜合蛋白，并對影響雜合 L1 組裝能力及其誘發(fā)中和抗體活性的因素進行了研究。HPVLIVLPs 免疫小鼠測定 ED50,將 HPV16,18,58LIVLPs 單獨或混合免疫小鼠誘發(fā)了較高滴度的針對組成型別的中和抗體，表明 HPV16,18,58LIVLPs 免疫原性很強。韓國的金洪珍等 18 通過優(yōu)化16型和18型的HPV序列， 構(gòu)建至pUCminvsMCS載體及YEG-MCS酵母表達(dá)載體，以釀酒酵母為宿主菌進行表達(dá)，通過肝素層析和陽離子交換層析進行表達(dá)蛋白的純化并進行濃縮。純化得到的蛋白添加佐劑后免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)組合佐劑增加了免疫刺激效果，總 IgG 效價增高。該藥物疫苗組

12、合物可比常規(guī)疫苗（包才 CervarixTM及 GardasilTM）誘導(dǎo)更強的針對 HPV 的免疫應(yīng)答，因而具有優(yōu)良的宮頸癌預(yù)防功效。此外，該藥物疫苗組合物由于用作免疫彳劑的脫?；姆嵌拘?LOS 幾乎無細(xì)胞毒性而具有優(yōu)良安全性。該藥物疫苗組合物比施用 CervarixTM 及 GardasilTM 顯著提高與 Th1 型免疫應(yīng)答（細(xì)胞免疫）相關(guān)的干擾素-丫、 IgG2a 及 IgG2b 水平， 以及與 Th2 型免疫應(yīng)答（體液免疫）相關(guān)的 IgG1水平。總體來說，本藥物疫苗組合物可誘導(dǎo)均優(yōu)于 CervarixTM 及 GardasilTM的針對 HPV 的 Th1 型免疫應(yīng)答（細(xì)胞免疫）

13、及 Th2 型免疫應(yīng)答（體液免疫）。廈門大學(xué)的李少偉等19對全長 HPV31L1 基因依照大腸桿菌密碼子偏嗜性進行優(yōu)化（片段全長為 1515bp，終止密碼子為 TAA）,由上海博亞公司合成該基因，酶切后與非融合表達(dá)載體 pTO-T7 連接，轉(zhuǎn)入 ER2566 大腸桿菌，用 50L 的發(fā)酵罐進行大規(guī)模培養(yǎng)，用 IPTG進行誘導(dǎo)表達(dá)，之后分離純化（HPV31Ctag-L1 的陽離子交換色譜）L1 蛋白，對得到的蛋白通過 Western 和質(zhì)譜進行鑒定，用 CENTRASETTE5 切向流系統(tǒng)對 L1 蛋白進行組裝，對 HPV31L1病毒樣顆粒進行透射電鏡觀察和動態(tài)光散射檢測。 將制得的該病毒樣顆粒

14、稀釋至 0.1mg/ml,然后加入等體積的完全弗氏佐劑等體積的不完全弗氏佐劑，免疫小鼠/兔子后進行免疫保護性的評價。發(fā)現(xiàn)通過該方法獲得的 HPV31-L1 病毒樣顆粒具有良好的免疫原性，可在動物體內(nèi)誘導(dǎo)高滴度的中和抗體，從而可用作預(yù)防 HPV31 感染的疫苗。馬潤林等20克隆了 HPV16L1 衣殼蛋白基因，進行修飾（堿基替代）后在大腸桿菌中表達(dá)（表達(dá)質(zhì)粒為 pGEX-6-1,表達(dá)菌株為 BL21）,分離，經(jīng)親和色譜純化重組 HPV16L1 蛋白五聚體（該五聚體與 HPV16L1 蛋白的 VLP 具有相同的免疫原性和抗原性），將所得重組 HPV16L1蛋白五聚體與輔料（佐劑包括呂鹽/3-O-去

15、?；瘑瘟姿犷愔?脂質(zhì) A 衍生物，賦型劑包括生理水以及其它藥物上可接受的賦型劑，穩(wěn)定劑包括基于磷酸鹽的生理緩沖液）混合制劑，得到 16 型重組人乳頭瘤病毒疫苗。具體步驟為將純化的 HPV16L1 的五聚體與 100mMNaCl 的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液混合（pH7.2）,加入 150ug 氫氧化鋁，調(diào)整五聚體濃度至 10ug/支，制成疫苗。動物安全性實驗發(fā)現(xiàn)重組 HPV16 疫苗對供試動物未發(fā)現(xiàn)任何可觀測到的急性毒性和異常毒性，全部毒性檢測指標(biāo)為陰性。動物有效性試驗發(fā)現(xiàn)組 HPV16 疫苗能誘導(dǎo)供試動物產(chǎn)生強烈的抗體保護反應(yīng)，抗體有效中濃度 ED0 在 0.4-2.0 微克，抗原的免疫原性及抗體的滴度

16、水平很高。（二）HPV 治療性疫苗在感染 HPV 所引起的的惡性腫瘤細(xì)胞中，病毒 DNA 整合到宿主細(xì)胞 DNA 中，結(jié)果導(dǎo)致 E6、E7 基因異常過量表達(dá)而使細(xì)胞無限增殖，并最終向惡性轉(zhuǎn)化；同時，晚期蛋白 L1、L2 基因會斷裂丟失，使其不能表達(dá)或僅有部分蛋白被低水平表達(dá)而難以檢測到，因此預(yù)防性疫苗對已經(jīng)感染 HPV 并引起癌前病變的的患者沒有保護能力，不能使他們被治愈。研究表明，HPV 感染引發(fā)的癌前病變以及癌癥的發(fā)生主要是由 HPVE6、E7 的協(xié)同作用所致，因此針對 E6、E7 為靶抗原的 HPV 治療性疫苗成為研究的重點21,22,23,24。1 .治療性疫苗的制備主要依據(jù)由于 HP

17、VE6/E7 蛋白具有致癌性，將這兩種蛋白直接應(yīng)用于治療宮頸癌時會存在疫苗的安全隱患，通常對關(guān)鍵位點進行突變以降低致癌性。通過對 HPVE6 蛋白和 E7 蛋白結(jié)構(gòu)功能和突變體的深入研究，可以有靶向性地對 E6 和 E7 基因進行突變和改造，消除 E6 蛋白和 E7蛋白的致癌能力和轉(zhuǎn)化活性，從而降低了將 HPVE6/E7 蛋白應(yīng)用于治療性疫苗開發(fā)的風(fēng)險，保證安全性。對 HPVE6/E7 基因進行突變，使其失去致癌性，同時保留免疫原性是研制宮頸癌治療性疫苗的主要手段之一25。2 .治療性疫苗的種類及制備HPV 治療性疫苗的類型主要有：多肽/蛋白質(zhì)疫苗26、活病毒載體疫苗、DNA 疫苗、RNA 疫

18、苗27。目前尚無有效的 HPV 治療性疫苗問世。但重組蛋白疫苗、多肽疫苗已進入二期臨床試驗，并顯示出良好的前景。蛋白疫苗：多肽/蛋白疫苗是采用腫瘤特異性的多肽片段或抗原蛋白作為疫苗直接免疫機體，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗原特異性的 CTL 反應(yīng)來殺傷腫瘤細(xì)胞。Chen 等首先證實，HPV16E7免疫動物可獲得特異性 CD8 陽性淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤排斥反應(yīng)。BermudezHumaran 等28通過乳酸乳球菌生產(chǎn) HPV16E7 蛋白。多肽疫苗：多肽疫苗的作用原理與蛋白疫苗類似。Liu 等構(gòu)建了一種新型的疫苗 E7 蛋白 CTL 表位 4462 和熱休克蛋白（Hsp70）的融合多肽疫苗29,使用 rAAV

19、作為載體，動物實驗中顯示出良好的腫瘤保護作用，轉(zhuǎn)染效率高，且使用 rAAV 可使作用延至 l5 年，避免反復(fù)使用及由此產(chǎn)生的中和抗體?；钶d體疫苗：活載體疫苗是將腫瘤特異性抗原蛋白的基因插入活載體(細(xì)菌或病毒等)，高效表達(dá)抗原從而刺激抗原特異性的免疫反應(yīng)?；钶d體疫苗免疫原性高，作為抗原載體的免疫刺激效果好。但是，活載體可能有潛在的安全風(fēng)險，尤其是對于免疫功能不全的患者。常用疫苗的載體主要有病毒(牛痘病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒和 a 病毒等)，細(xì)菌等。Li 等30采用天壇牛痘株構(gòu)建了表達(dá) HPV16 和 18E6/E7 蛋白的重組牛痘病毒疫苗 rVVJ16/18E7E6,在對小鼠和恒河猴的研究中，該

20、疫苗均顯示細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且對小鼠的腫瘤移植保護實驗也顯示出一定的效果。田厚等31,將 HPV16 型早期蛋白 E7、E6 編碼區(qū)基因融合，并將E7、E6 編碼區(qū)基因進行改造修飾去除其轉(zhuǎn)化活性，保留抗原性，再根據(jù)哺乳細(xì)胞使用密碼子的偏嗜性設(shè)計其相應(yīng)的優(yōu)勢密碼子核酸序列交給公司合成。將合成的經(jīng)密碼子優(yōu)化過的 E7E6 融合基因插入到腺病毒重組載體質(zhì)粒 pCD316 中，與 Ad5 病毒載體骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293細(xì)胞，經(jīng)純化并進行 E7E6 融合基因及蛋白的鑒定，篩選出表達(dá)人乳頭瘤病毒 HPV16 型 E7E6融合蛋白的重組腺病毒 rAd5HPV16SmE7E6 擴增重組病毒， 經(jīng)動物免疫實驗評價， 表明所制備出的重組腺病毒 rAd5HPV16SmE7E6M 有免疫活性，其能夠誘發(fā)免疫動物產(chǎn)生針對 HPV16E7的特異性 T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，對腫瘤的生長有明顯抑制作用。DNA 疫苗：Smahel 等使用修飾了的 HPV16E7 基因 DNA 疫苗進行體外實驗32,在 E7 基因 Rb 結(jié)合點加入 3 個突變位點 GGG 實驗對比 4 種疫苗的作用：E7、ETGGGM2 種融合基因 L16cE、Sig/EAMPI。結(jié)果顯