酵母雙雜總結(jié)

1、酵母雙雜原理：酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立。典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二個不同的結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activating domain)。前者可識別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。二個結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當(dāng)部位打開， 仍具有各自的功能。而且不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測

2、蛋白蛋白的相互作用。主要有二類載體: a 含DNA -binding domain的載體; b 含DNA-activating domain的載體。上述二類載體在構(gòu)建融合基因時， 測試蛋白基因與結(jié)構(gòu)域基因必須在閱讀框內(nèi)融合。融合基因在報告株中表達， 其表達產(chǎn)物只有定位于核內(nèi)才能驅(qū)動報告基因的轉(zhuǎn)錄。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad沒有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端應(yīng)克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA

3、(E coli轉(zhuǎn)錄抑制因子)的DNA-bd編碼序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和皰疹病毒VP16的編碼序列等。雙雜交系統(tǒng)的另一個重要的元件是報道株。報道株指經(jīng)改造的、含報道基因(reporter gene)的重組質(zhì)粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞， 酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點: 1 易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴增質(zhì)粒。2具有可直接進行選擇的標(biāo)記基因和特征性報道基因。3酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物(mammal;mammalian)的蛋白結(jié)合。一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如GAL4-bd，

4、 LexA-bd)； 另一個基因融合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如GAL4-ad， VP16)。激活結(jié)構(gòu)域融合基因轉(zhuǎn)入表達結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合基因的酵母細胞系中， 蛋白間的作用使得轉(zhuǎn)錄因子重建導(dǎo)致相鄰的報道基因表達(如lacZ)， 從而可分析蛋白間的結(jié)合作用。酵母雙雜交文庫構(gòu)建基本實驗流程一 第一鏈cDNA合成1. 準(zhǔn)備高質(zhì)量的Poly A 或總RNA2. 在微量離心管中混勻以下試劑 RNA 樣本 (0.0251.0 g poly A+或0.102.0 g 總RNA)12 l1.0 l CDS III 12 l去離子水補齊體系到4.0 l注: 對照實驗時，請使用1g的對照RNA。CDSIII = Oligo-

5、dT；CDSIII/6 =隨機引物 3. 72°C ，孵育2 min。4. 冰上冷卻2 min，然后14000rpm，10s，瞬時離心。5. 混合以下試劑，將混合液加入Step4中的經(jīng)過變性且結(jié)合有引物的RNA樣本中，輕拍混勻。5X First-Strand 緩沖液2.0 lDTT (100 mM)1.0 ldNTP 混合物(10 mM )1.0 lSMART MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶1.0 l 6. 42°C，孵育10 min。7. 加入 1 l SMART III-modified oligo，混勻，42°C，孵育1 h。 8. 75°C ，10 min終

6、止第一鏈合成反應(yīng)。 9. 室溫冷卻，加入1 l RNA酶H (2U)。 10. 37°C，孵育20 min。 11. 繼續(xù)進行 LD-PCR 擴增。 二 第二鏈cDNA合成（LD-PCR） 1. 建立兩管100ul的擴增體系，一個是實驗組，另一個是對照組，往實驗組離心管中加入以下試劑并混合：第一鏈cDNA2 l蒸餾水70 l10X Advantage. 2 PCR緩沖液10 l50X dNTP 混合物2 l5PCR 引物2 l3PCR引物2 l10X溶解液10 l50X Advantage 2聚合酶混合物2 l總體積100 l2. 擴增程序：95°C30 sec x Cyc

7、les 95°C 10s68°C 6 min68°C5min3. 對每個樣品取7 l PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。三 CHROMA SPIN.+TE-400純化柱純化ds cDNA 1. 將剩余的93ul的cDNA樣品加入CHROMA SPIN TE-400 純化柱中，顛倒純化柱數(shù)次，重懸膠基質(zhì)，直至均勻。移除頂端帽子，掰斷柱底部的break away,將柱放置在2ml 的收集管中。2. 700 rpm，5 min離心，丟棄收集管和平衡液，之后讓matrix半干。3. 將將離心柱放在另第二個收集管中，然后，向膠基質(zhì)平坦的表面上方加入93ul的樣本。4. 70

8、0 rpm，5 min離心，樣本便流到了收集管中。 5. 將兩次的純化樣本收集到一個離心管中，并用乙醇進行沉淀cDNA： 加入 1/10體積的3 M 醋酸鈉。加入2.5倍體積的冰乙醇 (95100%)。20°C ，1 hr放置沉淀。 14,000 ，室溫離心20 min。 棄上清，14,000 rpm瞬時離心，去除殘留的上清液。 空氣干燥10 min。 6. 20 l 去離子水重懸cDNA，用于酵母文庫構(gòu)建。四 建立Mate & Plate 文庫1. 遵循酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)文庫規(guī)模酵母轉(zhuǎn)化操作，向0.5ml Y187感受態(tài)中共轉(zhuǎn)化下列組份：已純化的ds cDNA25 gpGADT7

9、-Rec (0.5 g/l)6 l2. 按照轉(zhuǎn)化操作的第二步，將酵母重懸于15ml 0.9% (w/v) NaCl中。3.將100 l 的 1/10 、1/100稀釋液分別鋪板于 SD/Leu 100 mm 固體培養(yǎng)基上， 30°C，孵育 34d，確定文庫的庫容。4. 將剩下的懸浮液鋪板于150 mm SD/Leu選擇培養(yǎng)基上，每板100 l 懸浮液，約使用150板，30°C 孵育3-4d 5. 收獲Step4中的轉(zhuǎn)化子： a. 4°C ，34 h冷卻培養(yǎng)板。b. 加入5 ml 的凍存液（YPDA/25%甘油）。 c. 使用無菌的玻璃珠分離菌落（緩緩地搖晃培養(yǎng)板，

10、玻璃珠均勻地滾動于培養(yǎng)基表面將分離菌落，分離后的菌落溶于凍融液中）。d. 將所有的液體收集于無菌的單管中(收集后的體積要達到0.5 L)。 e.用血球計數(shù)板來計算細胞密度，若細胞密度小于<2 x 107/ml，離心來減少懸浮液的體積。 f. 將文庫分裝到2ml的離心管中（1ml/管）， -80貯存。 6. 取1ml單管文庫進行篩選。 酵母細胞感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化小樣轉(zhuǎn)化文庫轉(zhuǎn)化1 在轉(zhuǎn)化實驗的兩天前，于YPD培養(yǎng)基的平皿上活化酵母菌株(Y2H/Y187)。2.  轉(zhuǎn)化前一天，挑取活化的酵母細胞（單克?。┯赮PDA液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm培養(yǎng)8-12

11、h。3. 取5l上述酵母細胞液于50ml的YPDA培養(yǎng)基中，   30°C，200rpm培養(yǎng)8-12h至OD600>1.5。50ml150ml4.將上述酵母細胞液離心后轉(zhuǎn)接到新的YPDA液體培養(yǎng)基中，使OD600=0.2，30°C 200rpm培養(yǎng)4-6h，使OD600=0.5 300ml1L5. 700g 離心 5分鐘收集酵母細胞，用無菌水或TE洗酵母細胞。25-50ml500ml6.  再次700g 離心 5分鐘。7.  棄上清，用1.1

12、5;TE/LiAc重懸酵母細胞。1.5ml8ml8. 往離心管里加入如下試劑及DNA: DNA-BD/baita AD/library Herring testes carrier DNA 0.1 g0.1 g0.1 mg0.21.0 mg0.10.5 mg20 mg9. 加入感受態(tài)細胞，吸打均勻0.1 ml8 ml10. 加入PEG/LiAc緩沖液，高速漩渦混合0.6 ml60 ml11. 200rpm,30度孵育30min12. 加入DMSO，輕輕混合70 l7.0 ml13. 42度，40min水浴14. 冰浴1-2min15. 室溫高速離心(14000g)5s5min16. 棄上清，用

13、1×TE重懸，進行涂皿操作0.5ml10ml酵母文庫的篩選A 誘餌質(zhì)粒自激活活性檢測和毒性檢測1. 誘餌載體和對照空載體轉(zhuǎn)化酵母Y2H細胞，取100L涂布SD/-Trp固體培養(yǎng)板，30°C倒置培養(yǎng)3-4天待菌落長出。2. 挑(2-3 mm)單克隆至50 ml SD/Trp 液體培養(yǎng)基中，30°C搖床230-260 rpm，16-24 hr后，菌落PCR檢測目的基因是否轉(zhuǎn)入Y2H中，-70°C保存陽性菌種。3. 將陽性克隆在SD/-Trp/X-gal(SDO/X) SD/-Trp/X-gal/Aba(SDO/X/A)平板上劃線，30°C倒置培養(yǎng)2

14、天。4觀察有無藍色菌斑的出現(xiàn)，菌斑不顯藍色則表明無自我激活活性；若實驗菌斑與對照生長狀況相同，則誘餌載體對酵母無毒。 注：所需涂的皿及其生長結(jié)果如下表：sampleSelective agar plate2mm colonycolourY2HpGBKT7:baitSDOSD/-TrpYeswhiteY2HpGBKT7:baitSDO/ X-GalYeswhiteY2HpGBKT7:baitSDO/ X-Gal /AbaNOnoY2HpGBKT7:Lam+Y187pGADT7-TDDO/ X-Gal /AbaNONOY2HpGBKT7:53+Y187pGADT7-TDDO/ X-Gal /Aba

15、YesblueB 結(jié)合實驗及篩庫1在冰上凍融1ml文庫（酵母菌株 2 x 107cells Y187文庫）。2在2L三角瓶中，加入5ml 含Y2H酵母菌（1 x 109cells/ ml目的蛋白bait）的培養(yǎng)基和上述凍融的1ml文庫。3加入45ml 2×YPDA/Kan (50g/ml)，30-50rpm，30，mating 20-24小時，mating 20小時后可取5l到顯微鏡下觀察，如還沒有結(jié)合子存在，再mating 4小時，否則停止mating進入下面操作。4 準(zhǔn)備SD/Ade/His/Leu/Trp（QDO）培養(yǎng)基平板，約150個（涂皿前應(yīng)在超凈工作臺上吹2-3小時）。5

16、轉(zhuǎn)移mating體系至2個50ml離心管中，1000g室溫離心10分鐘，棄上清液。然后再加入2×YPDA洗一次酵母細胞，1000g室溫離心10分鐘，棄上清液。再用滅菌水清洗酵母細胞，兩管合并，1000g室溫離心10分鐘，棄上清液，加入約10 ml滅菌水重懸酵母細胞。6 涂皿，每平板加入150l上述懸浮酵母細胞用玻璃珠涂開至無流動液體。 7 封皿后置于30恒溫生長箱，生長4-6天后，選取菌斑大于2mm的菌落，在QDO平板皿上劃線，2-3d后長出的菌落可挑出來做插入片段擴增PCR。8 將（7）中擴增片段大小不同（PCR驗證3次，可大大降低假陽性菌落（約40%）的菌落于QDO、QDO/X-

17、Gal和QDO/X-Gal/Aba培養(yǎng)基上劃線（可適當(dāng)增大X-Gal和Aba的濃度，以提高篩選的嚴謹性），封皿后置于30恒溫生長箱，生長2-3d后觀察生長狀況。若在QDO上生長，QDO/X-Gal菌落變藍，QDO/X-Gal/Aba不生長，則存在互作。將存在互作的菌落進行菌落PCR，將PCR產(chǎn)物送去測序，對測序結(jié)果進行分析，看是否存在與花粉的發(fā)育、能量傳遞和合成、核酸結(jié)合或者剪切、毒性蛋白等相關(guān)的基因。9 挑互作酵母菌株至2ml 2×YPDA中，30°C搖床230-260 rpm，16-24 hr，提取酵母質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌中擴增含目的基因的載體，測序，到數(shù)據(jù)庫中比對測序結(jié)果，標(biāo)記感興趣的互作蛋白。