項目4酶法制備1,2-位脫氫高端甾體藥物技術(shù)與產(chǎn)業(yè)化

1、項目 4 酶法制備1，2-位脫氫高端甾體藥物技術(shù)與產(chǎn)業(yè)化需求單位： 湖北工業(yè)大學(xué)需求描述：1、現(xiàn)有成果技術(shù)特點含有1，2-位雙鍵甾體藥物能夠極大地增強藥物與甾體類糖皮質(zhì)激素受體的親和力。這類甾體藥物及其衍生物，包括1，4-雄烯二酮（ADD），醋酸潑尼松（prednisone acetate）、潑尼松龍（prednisolone）、16-甲基-1，9-去氫雄烯二酮（DBT-1）、美雄酮（methandrostenolone）、去氫甲睪酮（metandienone）、依西美坦（exemestane）、1，9-去氫雄烯二酮（DH1）、醋酸脫氫阿奈可他（DH5）、倍他米松環(huán)氧水解物（DB11）、醋酸潑

2、尼松龍（prednisolone acetate）、 寶丹酮（boldenon）等1、2-位脫氫甾體藥物，臨床應(yīng)用廣，市場價值高。本技術(shù)通過改造分枝桿菌3-甾酮-D1-脫氫酶（KstD）,獲得多種3-甾酮-D1-脫氫酶突變體（mKstDs），首次在工業(yè)化級別實現(xiàn)了利用酶催化技術(shù)生產(chǎn)高端甾體類糖皮質(zhì)激素藥物。該技術(shù)具體工藝特點和參數(shù)如下：（1）提供一種利用非水相酶學(xué)機理、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)機制和基因工程方法，改造分枝桿菌3-甾酮-D1-脫氫酶（KstD）,達(dá)到耐溶劑、底物高度專一性和高轉(zhuǎn)化率的3-甾酮-D1-脫氫酶突變體（mKstDs）的技術(shù)。（2）提供重組酶蛋白基因工程菌構(gòu)建，建立高密度發(fā)酵表達(dá)

3、3-甾酮-D1-脫氫酶生產(chǎn)工藝，達(dá)到單罐批次發(fā)酵培養(yǎng)體系為大于10噸，菌體濕量可達(dá)到110g/L以上，3-甾酮-D1-脫氫酶突變體（mKstD）酶活力為10 x 106單位以上。（3）提供重組酶純化工藝，處理量為2噸/小時。（4）提供針對不同產(chǎn)品，選用不同KstD酶蛋白和不同溶劑反應(yīng)體系，提供專一的脫氫酶轉(zhuǎn)化工藝，單批次底物投料量達(dá)800公斤/10噸，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到97%以上。（5）提供針對不同產(chǎn)品，建立酶催化反應(yīng)物溶劑提取和精制工藝，產(chǎn)品純度達(dá)到99%以上。2、現(xiàn)有成果研發(fā)所處階段該技術(shù)由多方合作，完成了和正在攻克如下關(guān)鍵技術(shù)，各項關(guān)鍵技術(shù)具體進(jìn)展如下：（1）酶分子結(jié)構(gòu)改造技術(shù):已完成和建立

4、了利用非水相酶學(xué)機理、蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)機制和基因工程方法，改造分枝桿菌3-甾酮-D1-脫氫酶（KstD）的技術(shù)體系?？蔀槠髽I(yè)提供底物專一性3-甾酮-D1-脫氫酶突變體設(shè)計。新設(shè)計3-甾酮-D1-脫氫酶（KstD）具有耐溶劑、底物高度專一性和高轉(zhuǎn)化率能力。（2）酶發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)工藝：已完成和建立了重組酶蛋白基因工程菌構(gòu)建技術(shù)，完成了3-甾酮-D1-脫氫酶表生產(chǎn)菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)工藝，批次單罐20噸可發(fā)酵體積為1012噸，菌體濕量可達(dá)到110/L以上，3-甾酮-D1-脫氫酶突變體（mKstD）酶活力可達(dá)為10 x 106單位/mL以上。建立了酶活測定和評價規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。（3）工業(yè)化酶提取工藝：已完成和建立

5、了發(fā)酵液菌體收集、細(xì)胞破粹、重組酶純化工藝，處理量為2噸/小時以上。（4）酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系：已完成和建立了針對不同產(chǎn)品，選用不同KstD酶蛋白和不同溶劑的反應(yīng)體系，單批次底物投料量可達(dá)800公斤/10噸，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到97%以上。建立了產(chǎn)物產(chǎn)率測定和評價規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。（5）酶催化底物反應(yīng)測試：已完成和建立了針對不同底物，反應(yīng)溶劑選擇和轉(zhuǎn)化條件的篩選和評價規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。（6）小試：已完成16種不同甾體中間體的酶催化反應(yīng)（克級）反應(yīng)測試，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%以上。（7）中試：其中已完成了8個1，2-脫氫類糖皮質(zhì)激素品種（100克級）反應(yīng)測試，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到97%以上。（8）試生產(chǎn)：其中已完成了4個1，2-脫

6、氫類糖皮質(zhì)激素品種（600800公斤級）生產(chǎn)反應(yīng)測試，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到97%以上，達(dá)到具有工業(yè)化生產(chǎn)水平。（9）產(chǎn)物純化工藝和產(chǎn)品質(zhì)控：已建立了1、2-脫氫類糖皮質(zhì)激素品種在100克級、200800公斤級反應(yīng)物提取和精制工藝條件，純度可達(dá)99%，并建立了產(chǎn)品質(zhì)控規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。（10）知識產(chǎn)權(quán)：該成果已申報菌種保藏6只，申報和準(zhǔn)備設(shè)備發(fā)明專利8項，知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)后將發(fā)表SCI和核心刊物科研論文16篇。3、現(xiàn)有成果已投入資金該成果的研究是以湖北工業(yè)大學(xué)蘇正定教授實驗室為主，在武漢艾默佳華生物科技有限公司合作下完成的，有關(guān)大規(guī)模試生產(chǎn)試驗是委托第三方進(jìn)行。前期各方就本項目投入實驗室建設(shè)和設(shè)備費用，以及研發(fā)和

7、人工費用慨算如下。單位內(nèi)容費用湖北工業(yè)大學(xué)材料費120萬元設(shè)備費20萬元人員費40萬元武漢艾默佳華生物科技有限公司研發(fā)費80萬元第三方試生產(chǎn)研發(fā)費120萬元合計380萬元4、現(xiàn)有成果參與人員該成果的研究是以湖北工業(yè)大學(xué)蘇正定實驗室團(tuán)隊成員為主，在武漢艾默佳華生物科技有限公司研發(fā)人員合作下完成的，有關(guān)試生產(chǎn)試驗是委托第三方甾體藥物生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行。前期各方就本項目投入的主要人員如下。單位姓名職稱完成任務(wù)湖北工業(yè)大學(xué)蘇正定教授整體設(shè)計湖北工業(yè)大學(xué)陽飛副教授基因組學(xué)湖北工業(yè)大學(xué)張華山教授發(fā)酵工藝設(shè)計湖北工業(yè)大學(xué)黃永棋副教授蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)計湖北工業(yè)大學(xué)成細(xì)瑤實驗員蛋白結(jié)構(gòu)測定與設(shè)計湖北工業(yè)大學(xué)彭飛研究生分子克

8、隆及酶表達(dá)及反應(yīng)湖北工業(yè)大學(xué)王宏偉研究生分子克隆及酶表達(dá)及反應(yīng)湖北工業(yè)大學(xué)宋士奎研究生酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)及小試和中試湖北工業(yè)大學(xué)李欣研究生分子克隆及酶表達(dá)及反應(yīng)湖北工業(yè)大學(xué)陳甜研究生分子克隆及酶表達(dá)及反應(yīng)武漢艾默佳華生物科技有限公司研發(fā)部（5人）工程師級基因組學(xué)及表達(dá)載體設(shè)計與測試試生產(chǎn)委托方（湖北企業(yè)）生產(chǎn)部（5人）工程師級2噸反應(yīng)釜酶試生產(chǎn)、10噸釜酶催化試生產(chǎn)、10噸反應(yīng)釜萃取試生產(chǎn)5、現(xiàn)有成果應(yīng)用本成果主要應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)高端甾體皮質(zhì)激素藥物，在技術(shù)和工藝上首次實現(xiàn)單一反應(yīng)罐達(dá)到公斤級到噸級生產(chǎn)規(guī)模，已完成了4個1、2-脫氫類糖皮質(zhì)激素品種（600800公斤級）生產(chǎn)測試，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到97%以

9、上，提前和精制工藝簡單，月生產(chǎn)能力已達(dá)到300噸，產(chǎn)品質(zhì)量符合FDA標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)成本低。也完成了其它12個1、2-脫氫類糖皮質(zhì)激素品種克級測試，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%以上。因此，本技術(shù)具有不可替代的競爭力?，F(xiàn)有成果建立的“分子桿菌基因組學(xué)方法及基因敲除技術(shù)”也可用于甾體菌種的特定改造，定向基因敲除和敲入，實現(xiàn)單一和高純度品種植物甾醇生物轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)有成果建立的“酶分子結(jié)構(gòu)改造技術(shù)”也可用于改造分枝桿菌植物甾醇轉(zhuǎn)化途徑的關(guān)鍵酶?？蔀槠髽I(yè)提供甾體中間體專一性酶法改造工藝。對揭榜方要求：揭榜方除滿足通知中共性要求外，還應(yīng)滿足以下個性化要求：（1）甾體藥物生產(chǎn)企業(yè)或正在籌建甾體藥物生產(chǎn)廠家；（2）為高新技術(shù)認(rèn)定企業(yè)，最好具有省級工程研究中心或省級工程技術(shù)中心；（3）具有相當(dāng)數(shù)量的科研