westblotting 方法

1、Western印跡法一實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩Ψ欠派湫詷?biāo)記的蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進(jìn)行鑒別和鑒定。二實(shí)驗(yàn)原理：把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體，并以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測它。Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。是對非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進(jìn)行鑒別和鑒定。三實(shí)驗(yàn)操作儀器：高壓鍋、20低溫冰箱、分光光度儀、玻璃勻漿器、高速離心機(jī)、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置、恒溫水浴搖床、多用脫色搖床、恒溫水浴搖床、。試劑：單去污劑裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10分離膠、4濃縮校、G250

2、考馬斯亮藍(lán)溶液、2X（5X）SDS上樣緩沖液、0.15mol/L NaCl 溶液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、封閉液、TBST、10X麗春紅染液、TBS、顯影液、定影液、抗體、化學(xué)發(fā)光試劑、洗脫抗體緩沖液。雜品與耗材：各種規(guī)格的吸頭、離心管和加樣器、各種規(guī)格的燒杯、量筒和平皿等玻璃器材、硝酸纖維素膜，保鮮膜，乳膠手套，搪瓷盤（>20×20cm），X-光片，X-光片夾，玻棒長短各一根，吸水紙，計(jì)時(shí)器，試劑配制：（一）母液：1. 0mol/L Tris·HCl： Tris (MW121.14) 30.29g 蒸餾水 200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至所需點(diǎn)（見下表），最后用蒸

3、餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。PHHCl7.4約17ml7.5約16m7.6約15ml8.0約10ml 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF： PMSF 0.174g異丙醇 100ml溶解后，分裝于1.5ml離心管中，20保存。0.2mol/L NaH2PO4： NaH2PO4（MW119.98） 12g 蒸餾水至 500ml 溶解后，高壓滅菌，室溫保存。0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸餾水至 1000ml溶解后，高壓滅菌，室溫保存。10SDS SDS 10g 蒸餾水至 100ml50水浴下溶解，室

4、溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10過硫酸胺（AP）過硫酸胺 0.1g超純水 1.0ml溶解后，4保存，保存時(shí)間為1周。1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 45.43g超純水 200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至8.8，最后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g 超純水 200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8，最后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。40Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（A

5、cr） 37.5g甲叉雙丙稀酰胺（Bic） 1g超純水至 100ml37下溶解后，4保存。使用時(shí)恢復(fù)至室溫且無沉淀。20Tween20Tween20 20ml蒸餾水至 100ml混勻后4保存。（二）使用液單去污劑裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX100，100mg/ml PMSF）： 1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX100 0.5ml蒸餾水至 50ml 混勻后， 4保存。使用時(shí)，加入PMSF至終濃度為100mg/ml（0.87ml裂解液加入1.74

6、mg/ml PMSF50l）。0.01mol/L PBS（ pH ）0.2 mol/L NaH2PO4 19ml0.2 mol/L Na2HPO4 81mlNaCl 17g蒸餾水至 2000mlG250考馬斯亮藍(lán)溶液（測蛋白含量專用） 考馬斯亮藍(lán)G250： 100mg 95乙醇： 50ml 磷酸： 100ml 蒸餾水至 1000ml 配制時(shí)，先用乙醇溶解考馬斯亮藍(lán)染料，再加入磷酸和水，混勻后，用濾紙過濾，4保存。0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g 蒸餾水至 100 ml高溫滅菌后，室溫保存。100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g 0.1

7、5 mol/L NaCl 1ml溶解后，20保存。制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，用0.15 mol/L NaCl進(jìn)行100倍稀釋成1mg/ml，20保存。10分離膠和4濃縮校 10分離膠（兩塊膠，10ml） 4濃縮膠（兩塊膠，5ml）超純水 4.85ml 3.16ml40Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 2.5ml 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 1.26ml10SDS 100 ml 50 ml10%AP（過硫酸胺） 50 ml 25 mlTEMED 5 ml 5 ml 加TEMED后，立即混

8、勻即可灌膠。還原型5XSDS上樣緩沖液（0.25mol/L Tris·HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10 SDS，0.5溴酚藍(lán)，50甘油） 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml 二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g SDS 0.5g溴酚藍(lán) 0.025甘油 2.5ml 混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4保存。電泳液緩沖液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1 SDS） Tris（MW121.14） 3.03g 甘氨酸（MW75.07） 18.77gSDS 1g蒸餾水至 1000ml 溶解后室溫保

9、存，次溶液可重復(fù)使用35次。轉(zhuǎn)移緩沖液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037 SDS，20甲醇）甘氨酸（MW75.07） 2.9gTris（MW121.14） 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml蒸餾水至 1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用35次。10X麗春紅染液麗春紅S 2g三氯乙酸 30g磺基水楊酸 30g蒸餾水至 100ml使用時(shí)將其稀釋10倍。TBS緩沖液（100mmol/ L Tris·HCl pH7.5,150mmol/L NaCl）1 mol/ LTris·HCl（pH7.5） 10mlNaCl 8.8g蒸餾水至

10、1000ml TBST緩沖液（含0.05Tween20的TBS緩沖液） 20Tween20 1.65ml TBS 700ml 混勻后即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。1×TBST 1LTris base 2.422g (MW121.4)Nacl 8.775gTween20 0.5ml封閉液（含5脫脂奶粉的TBST緩沖液）脫脂奶粉（國產(chǎn)，安怡牌） 5g TBST 100ml溶解后4保存。使用時(shí)，恢復(fù)室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。洗脫抗體緩沖液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2SDS，62.5m mol/L Tris·HCl pH6.8）14.4 mol

11、/L 2- Mercaptoethanol(-巰基乙醇) 700 ml（通風(fēng)廚里加） SDS 2g 0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml 超純水至 100ml配制時(shí)，在通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行。4保存。可重復(fù)使用1次。顯影液（5X） 自來水（加熱至50） 375ml （以下藥品加到溫水中） 米吐爾 1.55g 亞硫酸鈉（無水） 22.5g 碳酸鈉（無水） 33.75g 溴化鉀 20.95g 補(bǔ)水至 500ml配制時(shí)，上述藥品應(yīng)逐一加入，待一種試劑溶解后，再加入后一種試劑。4保存。使用時(shí)用自來水稀釋至1倍。定影液自來水（5060） 700ml （以下藥品按順序加入前者溶解

12、后再加后者）硫代硫酸鈉 240g亞硫酸鈉（無水） 15g冰乙酸 12.6ml硼酸 7.5g鉀明礬 15g（水溫冷至30以下時(shí)再加入）加水定容至1000ml，室溫保存抗體 用TBST稀釋至一定濃度使用，每張膜需0.5ml化學(xué)發(fā)光試劑購自北京中山公司，為Santa Cruz產(chǎn)品，分A和B兩種試劑。操作步驟：（一） 蛋白樣品制備（1） 單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：1、 倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。2、 每瓶細(xì)胞加3ml 4預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重

13、復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。3、 按1ml裂解液加10 ml PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）4、 每瓶細(xì)胞加400 ml含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。5、 裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）6、 于4下12000rpm離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）7、 將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min的離心管中放于20保存。（2） 組織中總蛋白的提?。?

14、、 將少量組織塊置于12ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。2、 加400 ml單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。3、 幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。4、 裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于20保存。（3） 加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。河捎谑芩幬锏挠绊?，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?、 將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min

15、。2、 棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。3、 用槍洗干上清后，加100 ml裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。4、 將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于20保存。（二） 蛋白含量的測定（1） 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1、 從20取出1mg/ml BSA，室溫融化后，備用。2、 取18個(gè)1.5ml離心管，3個(gè)一組，分別標(biāo)記為0mg，2.5mg，5.0mg ，10.0mg ，20.0mg ，40.0mg。3、 按下表在各管中

16、加入各種試劑。0mg2.5mg5.0mg10.0mg20.0mg40.0mg1mg/ml BSA2.5ml5.0ml10.0ml20.0ml40.0ml0.15mol/L NaCl100ml97.5ml95.0ml90.0ml80.0ml60.0mlG250考馬斯亮藍(lán)溶液1ml1ml1ml1ml1ml1ml4、 混勻后，室溫放置2min。在生物分光光度計(jì)（BioPhotometer，Eppentoff）上比色分析。（2） 檢測樣品蛋白含量1、 取足量的1.5ml離心管，每管加入4儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1ml。室溫放置30min后即可用于測蛋白。2、 取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15mol/L NaCl

17、溶液100 ml，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測空白樣品。3、 棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用無菌水洗一次。4、 取一管考馬斯亮藍(lán)加95 ml 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ml待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。注意：每測一個(gè)樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次?？赏瑫r(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測得的結(jié)果是5 ml樣品含的蛋白量。（三） SDSPAGE電泳（1） 清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗

18、衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。（2） 灌膠與上樣1、 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要使兩玻璃對齊，以免漏膠。）2、 按前面方法配10分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）3、 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用

19、吸水紙將水吸干。4、 按前面方法配4的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。5、 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）6、 測完蛋白含量后，計(jì)算含50mg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5ml離心管中，加入5&#

20、215;SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15ml，加樣孔的最大限度可加20ml樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮5min使蛋白變性。7、 加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。（3） 電泳電泳時(shí)間一般45 h，電壓為40V較好，也可用60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。（四） 轉(zhuǎn)膜（1） 轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0

21、8.3cm的濾紙和1張7.38.6cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會(huì)阻止膜吸水。（2） 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。（3） 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），

22、一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。（4） 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通

23、。）（5） 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60V轉(zhuǎn)移2 h或40V轉(zhuǎn)移3 h。（6） 轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。 將膜晾干備用。 （五） 免疫反應(yīng)（1） 將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h。（2） 將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5ml離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留

24、液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育12h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。（3） 同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育12h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。（六） 化學(xué)發(fā)光，顯影，定影（1） 將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。（2） 在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L和寬均需大1cm）；打開X-光片夾，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上X-光片夾，開始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1min或5min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)最佳效果；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止