C型利尿鈉肽對小鼠小腸Cajal間質(zhì)細胞起搏電流的影響及機制

1、C型利尿鈉肽對小鼠小腸Cajal 間質(zhì)細胞起搏電流的影響及機制眾多的研究結(jié)果表明 ,Cajal間質(zhì)細胞 (interstitialcellsof Cajal,ICC)是胃腸道平滑肌慢波的起搏細胞。根據(jù)它們在胃腸道內(nèi)分布位置的差異, 可以分為肌間 ICC 和肌內(nèi) ICC 兩大類。二者在起搏電流的產(chǎn)生 , 傳播 , 神經(jīng)信息傳遞等方面承擔著不同的功能。C 型利尿鈉肽 (C-typenatriureticpeptide,CNP)是利尿鈉肽家族的一員 , 它不僅分布廣泛 , 而且具有多種生物學功能。我們以往的研究表明 , 利尿鈉肽家族對胃腸運動具有抑制性調(diào)節(jié)作用, 而這種抑制作用是否也可以通過影響IC

2、C 起搏電流的形成來實現(xiàn) , 國內(nèi)外還未見相關(guān)的報道。在本研究中 , 我們采用免疫細胞化學技術(shù)對培養(yǎng)的ICC 進行鑒定。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)的多種鉗制模式, 觀察了 ICC 起搏電流的特性 ; 用免疫雙標法 , 檢測了利尿鈉肽受體在 ICC的表達 ; 用全細胞膜片鉗技術(shù)觀察了 CNP對網(wǎng)絡(luò)和單個 ICC起搏電流的影響 ; 進一步應(yīng)用 cGMP的擬似物等工具藥物來研究 CNP影響起搏電流的機制 ; 用膜內(nèi)面向外和細胞吸附模式觀察了 CNP和 cGMP對起搏電流形成相關(guān)的離子通道活性的影響。結(jié)果表明 : 培養(yǎng)的大部分細胞均為 C-Kit 抗體陽性表達 ; 在全細胞模式下 , 高濃度鈣鰲合劑使細胞內(nèi)游離鈣

3、濃度降低后 ,ICC上可以激活持續(xù)性內(nèi)向電流; 在膜內(nèi)面向外的膜片鉗模式下, 當膜內(nèi)鈣離子濃度由 1mol/L 降低到 0.1 mol/L 時, 激活幅度大、頻率快的自發(fā)性內(nèi)向電流 ; 在全細胞模式下 , 鈣調(diào)蛋白抑制劑 W-7可以增加 ICC自發(fā)性內(nèi)向電流的幅度 ; 在細胞吸附模式下 ,W-7 激活幅度大、頻率快的自發(fā)性內(nèi)向電流。也有一種細胞的電生理學特性卻不受細胞內(nèi)低鈣環(huán)境和鈣調(diào)蛋白抑制劑W-7的影響 ; 免疫雙標法證實 , 利尿鈉肽受體A和 B 在 ICC 表面呈陽性表達 ; 在全細胞鉗制模式下 , 在網(wǎng)絡(luò)式生長的 ICC 記錄到幅度為 322±22pA,頻率為16.25 &#

4、177;0.95Hz 的起搏電流 ;CNP對網(wǎng)絡(luò) ICC起搏電流的幅度和頻率具有明顯的抑制作用 , 并具有劑量依賴性, 當CNP的濃度分別為0.01 mol/L 、0.1 mol/L和1 mol/L時 , 可以將起搏電流的幅度抑制到對照組的76.05 ±1.51%、38.24 ±3.74%和 18.33 ± 2.86%,將起搏電流的頻率從 16.25 ±0.95Hz 抑制到 13±0.9Hz 、12±0.8Hz 和 3± 0.2Hz; 膜通透性 8-Br-cGMP 可以模擬 CNP對起搏電流的抑制作用 ,cGMP敏感的磷酸酯

5、酶抑制劑 Zaparinast 可以增強 CNP對起搏電流的抑制作用 ; 在細胞吸附模式下 ,CNP和 8-Br-cGMP對鈣調(diào)蛋白抑制劑 W-7誘發(fā)的 ICC 自發(fā)性內(nèi)向電流具有明顯的抑制作用 ; 在膜內(nèi)面向外的膜片鉗模式下 , 細胞內(nèi)低鈣誘發(fā)的自發(fā)性內(nèi)向電流不被 8-Br-cGMP 抑制 ; 在全細胞模式下 , 細胞內(nèi)高濃度鈣螯合劑使胞內(nèi)鈣濃度持續(xù)降低所引發(fā)的內(nèi)向電流不被CNP和 8-Br-cGMP抑制。上述結(jié)果提示 : 在小鼠小腸分離培養(yǎng)的ICC 上能夠記錄到自發(fā)性瞬間內(nèi)向性電流 , 即起搏電流 , 這種起搏電流的產(chǎn)生與胞內(nèi)低鈣和鈣調(diào)蛋白抑制劑敏感的離子通道有關(guān) ; 在培養(yǎng)的 ICC 中對細胞內(nèi)低鈣和 W-7 敏感的細胞可能就是具有起搏功能的肌層間 ICC (myenteric ICC, ICC-MY); CNP可以直接作用于小腸 ICC 抑制其起搏電流 , 對平滑肌運動起抑制性調(diào)節(jié) ; CNP對小腸 ICC起搏電流的抑制