Actin調(diào)控激酶MoArk1結(jié)合蛋白MoCAP和MoAbp1在稻瘟病菌發(fā)育和致病中的功能分析

1、Actin調(diào)控激酶 MoArk1結(jié)合蛋白 MoCAP和 MoAbp1在稻瘟病菌發(fā)育和致病中的功能分析稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)引發(fā)的水稻稻瘟病是重要的水稻病害之一,易暴發(fā)成災(zāi) , 該病害在水稻的整個(gè)生育期內(nèi)都會(huì)發(fā)生, 其流行程度因不同區(qū)域和不同年份而具有一定的差異, 平均每年給全世界的水稻生產(chǎn)造成10%20%的損失。該病害也是我國(guó)各水稻種植區(qū)重要的病害之一, 正危害我國(guó)水稻的生產(chǎn)安全。目前 , 對(duì)該病害的防治仍以篩選培育抗病品種和化學(xué)藥劑為主, 但是由于該病原菌容易發(fā)生變異 , 抗病品種抗病性會(huì)隨新的致病群體的形成而迅速喪失, 而化學(xué)藥劑的常年使用也會(huì)導(dǎo)致抗藥性群體產(chǎn)生

2、, 導(dǎo)致藥劑失去防治效果 , 因此 , 對(duì)于該病害的控制一直是水稻生產(chǎn)上一個(gè)亟待解決的重要問(wèn)題, 而控制稻瘟病菌危害的一個(gè)重要前提就是要了解其致病機(jī)理, 這一問(wèn)題的解決將對(duì)該病害的治理與控制具有重要的理論與實(shí)踐意義。 本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白actin細(xì)胞骨架調(diào)控激酶 MoArk1通過(guò)調(diào)控 actin細(xì)胞骨架的組裝 , 細(xì)胞內(nèi)吞作用 , 頂體的形成參與調(diào)控稻瘟病菌的生長(zhǎng), 產(chǎn)孢及致病力。本論文主要對(duì) actin調(diào)控激酶 MoArk1 的三個(gè)結(jié)合蛋白 MoCapA、MoCapB和MoAbp1在稻瘟病菌生長(zhǎng)發(fā)育及致病過(guò)程中的功能進(jìn)行分析, 研究結(jié)果如下 : 為了進(jìn)一步研究 MoArk1及 ac

3、tin 細(xì)胞骨架在稻瘟病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病過(guò)程中的功能,本文通過(guò) Co-IP 篩選了稻瘟病菌中與MoArk1互作的蛋白 , 并對(duì)親和純化篩選到的F-actin加帽蛋白 MoCapA和 MoCapB與 actin細(xì)胞骨架調(diào)控激酶MoArk1的互作關(guān)系進(jìn)行了驗(yàn)證 , 結(jié)果證明它們是相互作用的。MoCapA和 MoCapB分別是 actin加帽蛋白復(fù)合體的 亞基和 亞基 ,MoCapA具有兩個(gè) actin加帽基序 ,MoCapB具有一個(gè) actin加帽基序。通過(guò)基因敲除獲得了MoCAP和 MoCAPB的缺失突變體及 MoCAPA和 MoCAPB的雙缺失突變體 , 與野生型菌株 Guy11相比 , 突變

4、體的生長(zhǎng)顯著減慢 ; 產(chǎn)孢量顯著下降 , 孢子形態(tài)異常多樣 , 而缺失 MoCAPA或 MoCAPB和同時(shí)缺失 MoCAPA和 MoCAPB的表型是相同的 , 說(shuō)明 actin加帽蛋白復(fù)合體缺失了任何一個(gè)亞基都會(huì)使整個(gè)復(fù)合體的功能喪失。同時(shí)發(fā)現(xiàn), 突變體中 actin細(xì)胞骨架組裝異常 , 有絲分裂減慢 ,胞吞作用延遲 , 效應(yīng)分子的分泌異常 , 細(xì)胞自噬作用延遲。MoCAP與 actin相互作用 , 與 actin共定位 , 調(diào)控 actin細(xì)胞骨架的組裝。 進(jìn)一步地對(duì) MoCAP的 actin加帽基序進(jìn)行缺失突變并進(jìn)行表性分析發(fā)現(xiàn),actin加帽基序缺失突變體的生長(zhǎng), 孢子形態(tài) , 致病力與

5、 MoCAP缺失突變體的相同 , 而MoCAP的定位由原來(lái)的actin定位模式變成了充滿細(xì)胞質(zhì), 而且缺失 actin加帽基序后 MoCAP不能與 actin.互作 , 表明 MoCAP通過(guò) actin細(xì)胞骨架調(diào)控多個(gè)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程參與調(diào)控稻瘟病菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及致病過(guò)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) ,MoArk1 能夠通過(guò)磷酸化MoCapA的第 85 位的絲氨酸 ,MoCapB的第 285 位的絲氨酸調(diào)控 MoCapA和 MoCapB的功能。 MoCAP能夠響應(yīng)PIP2 的水平調(diào)控 actin細(xì)胞骨架的組裝。以上結(jié)果表明 MoCAP對(duì)于稻瘟病菌細(xì)胞骨架的組裝, 多個(gè)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程及致病力都是非常重要的 ,

6、 且其功能受到 MoArk1 和 PIP2 的調(diào)控。對(duì)親和純化篩選到的 actin結(jié)合蛋白 MoAbp1與 MoArk1 的互作關(guān)系進(jìn)行了驗(yàn)證 , 結(jié)果證明它們是相互作用的。MoAbp1具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域 , 分別是 ADFH結(jié)構(gòu)域和兩個(gè) SH3結(jié)構(gòu)域。通過(guò)基因敲除獲得了 MoABP的缺失突變體 , 表型分析發(fā)現(xiàn) MoABP1缺失突變體生長(zhǎng)減慢 , 致病力下降。同時(shí) ,MoABP1缺失突變體 actin細(xì)胞骨架組裝異常 , 胞吞作用延遲。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) MoAbp1參與調(diào)控 MoArk1的亞細(xì)胞定位和自我磷酸化, 同時(shí)參與調(diào)控環(huán)化酶相關(guān)蛋白 MoCap1的定位 , 影響 cAMP的合成。通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MoAbp1能夠通過(guò) ADFH,F-SH3,E-SH3分別與MoAct1,MoArk1,MoCap1互作 , 而 MoAbp1與 actinpatches 共定位依賴于 ADFH功能域 , 但 MoAbp1的每個(gè)功能域?qū)τ谄湔５墓δ芏际遣豢扇鄙俚??？傊?MoAbp1作為一個(gè)接頭蛋白將MoArk1 和 MoCap1招募到 actin細(xì)胞骨架上 , 調(diào)控 actin細(xì)胞骨架的組裝、胞吞過(guò)程進(jìn)而控制稻瘟病菌的生長(zhǎng)發(fā)育及致病過(guò)程。綜上所述 ,actin細(xì)胞骨架的組裝在稻瘟病菌