Actin調(diào)控激酶MoArk1結(jié)合蛋白MoCAP和MoAbp1在稻瘟病菌發(fā)育和致病中的功能分析

1、Actin調(diào)控激酶 MoArk1結(jié)合蛋白 MoCAP和 MoAbp1在稻瘟病菌發(fā)育和致病中的功能分析稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)引發(fā)的水稻稻瘟病是重要的水稻病害之一,易暴發(fā)成災(zāi) , 該病害在水稻的整個生育期內(nèi)都會發(fā)生, 其流行程度因不同區(qū)域和不同年份而具有一定的差異, 平均每年給全世界的水稻生產(chǎn)造成10%20%的損失。該病害也是我國各水稻種植區(qū)重要的病害之一, 正危害我國水稻的生產(chǎn)安全。目前 , 對該病害的防治仍以篩選培育抗病品種和化學(xué)藥劑為主, 但是由于該病原菌容易發(fā)生變異 , 抗病品種抗病性會隨新的致病群體的形成而迅速喪失, 而化學(xué)藥劑的常年使用也會導(dǎo)致抗藥性群體產(chǎn)生

2、, 導(dǎo)致藥劑失去防治效果 , 因此 , 對于該病害的控制一直是水稻生產(chǎn)上一個亟待解決的重要問題, 而控制稻瘟病菌危害的一個重要前提就是要了解其致病機(jī)理, 這一問題的解決將對該病害的治理與控制具有重要的理論與實踐意義。 本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)肌動蛋白actin細(xì)胞骨架調(diào)控激酶 MoArk1通過調(diào)控 actin細(xì)胞骨架的組裝 , 細(xì)胞內(nèi)吞作用 , 頂體的形成參與調(diào)控稻瘟病菌的生長, 產(chǎn)孢及致病力。本論文主要對 actin調(diào)控激酶 MoArk1 的三個結(jié)合蛋白 MoCapA、MoCapB和MoAbp1在稻瘟病菌生長發(fā)育及致病過程中的功能進(jìn)行分析, 研究結(jié)果如下 : 為了進(jìn)一步研究 MoArk1及 ac

3、tin 細(xì)胞骨架在稻瘟病菌生長發(fā)育和致病過程中的功能,本文通過 Co-IP 篩選了稻瘟病菌中與MoArk1互作的蛋白 , 并對親和純化篩選到的F-actin加帽蛋白 MoCapA和 MoCapB與 actin細(xì)胞骨架調(diào)控激酶MoArk1的互作關(guān)系進(jìn)行了驗證 , 結(jié)果證明它們是相互作用的。MoCapA和 MoCapB分別是 actin加帽蛋白復(fù)合體的 亞基和 亞基 ,MoCapA具有兩個 actin加帽基序 ,MoCapB具有一個 actin加帽基序。通過基因敲除獲得了MoCAP和 MoCAPB的缺失突變體及 MoCAPA和 MoCAPB的雙缺失突變體 , 與野生型菌株 Guy11相比 , 突變

4、體的生長顯著減慢 ; 產(chǎn)孢量顯著下降 , 孢子形態(tài)異常多樣 , 而缺失 MoCAPA或 MoCAPB和同時缺失 MoCAPA和 MoCAPB的表型是相同的 , 說明 actin加帽蛋白復(fù)合體缺失了任何一個亞基都會使整個復(fù)合體的功能喪失。同時發(fā)現(xiàn), 突變體中 actin細(xì)胞骨架組裝異常 , 有絲分裂減慢 ,胞吞作用延遲 , 效應(yīng)分子的分泌異常 , 細(xì)胞自噬作用延遲。MoCAP與 actin相互作用 , 與 actin共定位 , 調(diào)控 actin細(xì)胞骨架的組裝。 進(jìn)一步地對 MoCAP的 actin加帽基序進(jìn)行缺失突變并進(jìn)行表性分析發(fā)現(xiàn),actin加帽基序缺失突變體的生長, 孢子形態(tài) , 致病力與

5、 MoCAP缺失突變體的相同 , 而MoCAP的定位由原來的actin定位模式變成了充滿細(xì)胞質(zhì), 而且缺失 actin加帽基序后 MoCAP不能與 actin.互作 , 表明 MoCAP通過 actin細(xì)胞骨架調(diào)控多個細(xì)胞生物學(xué)過程參與調(diào)控稻瘟病菌的生長、產(chǎn)孢及致病過程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) ,MoArk1 能夠通過磷酸化MoCapA的第 85 位的絲氨酸 ,MoCapB的第 285 位的絲氨酸調(diào)控 MoCapA和 MoCapB的功能。 MoCAP能夠響應(yīng)PIP2 的水平調(diào)控 actin細(xì)胞骨架的組裝。以上結(jié)果表明 MoCAP對于稻瘟病菌細(xì)胞骨架的組裝, 多個細(xì)胞生物學(xué)過程及致病力都是非常重要的 ,

6、 且其功能受到 MoArk1 和 PIP2 的調(diào)控。對親和純化篩選到的 actin結(jié)合蛋白 MoAbp1與 MoArk1 的互作關(guān)系進(jìn)行了驗證 , 結(jié)果證明它們是相互作用的。MoAbp1具有三個結(jié)構(gòu)域 , 分別是 ADFH結(jié)構(gòu)域和兩個 SH3結(jié)構(gòu)域。通過基因敲除獲得了 MoABP的缺失突變體 , 表型分析發(fā)現(xiàn) MoABP1缺失突變體生長減慢 , 致病力下降。同時 ,MoABP1缺失突變體 actin細(xì)胞骨架組裝異常 , 胞吞作用延遲。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) MoAbp1參與調(diào)控 MoArk1的亞細(xì)胞定位和自我磷酸化, 同時參與調(diào)控環(huán)化酶相關(guān)蛋白 MoCap1的定位 , 影響 cAMP的合成。通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn),MoAbp1能夠通過 ADFH,F-SH3,E-SH3分別與MoAct1,MoArk1,MoCap1互作 , 而 MoAbp1與 actinpatches 共定位依賴于 ADFH功能域 , 但 MoAbp1的每個功能域?qū)τ谄湔５墓δ芏际遣豢扇鄙俚??？傊?MoAbp1作為一個接頭蛋白將MoArk1 和 MoCap1招募到 actin細(xì)胞骨架上 , 調(diào)控 actin細(xì)胞骨架的組裝、胞吞過程進(jìn)而控制稻瘟病菌的生長發(fā)育及致病過程。綜上所述 ,actin細(xì)胞骨架的組裝在稻瘟病菌