PCR反應(yīng)中基本成分引物dNTP、等的作用

1、PCR 反應(yīng)中基本成分（引物、dNTP 、模板等）的作用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ) 反應(yīng)包括三個(gè)基本步驟，即：模板 DNA的變性、模板 DNA 與引物的退火復(fù)性、引物的延伸。 PCR反應(yīng)體系包括 5 種基本成分，依次為：引物、 DNA聚合酶、 dNTP、模板 DNA、 Mg2+。PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ) 反應(yīng)包括三個(gè)基本步驟，即：模板 DNA的變性、模板 DNA 與引物的退火復(fù)性、引物的延伸。 PCR反應(yīng)體系包括 5 種基本成分，依次為：引物、 DNA聚合酶、 dNTP、模板 DNA、 Mg2+。1、引物引物是 PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵， PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA互補(bǔ)的程度

2、。理論上，只要知道任何一段模板 DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的 寡核苷酸鏈做引物，利用 PCR就可將模板 DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度： 15-30bp ，常用為 20bp 左右。引物擴(kuò)增跨度：以 200-500bp 為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb 的片段。引物堿基： G+C含量以 40-60%為宜， G+C太少擴(kuò)增效果不佳， G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。 ATGC最好隨機(jī)分布，避免 5 個(gè)以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是 3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成 引物二聚體 ，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物 3端的堿基，特別是最

3、末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致 PCR失敗。引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子 克隆很有好處。引物的特異性： 引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度 0.1 1umol 或 10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增， 且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。2、酶目前有兩種 Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。 催化一典型的 PCR反應(yīng)約需酶量 2.5U( 指總反應(yīng)體積為 1

4、00ul 時(shí)) ，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。3、dNTPdNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系， dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或 1M Tris 。HCL的緩沖液將其 PH調(diào)節(jié)到 7.0 7.5 ，小量分裝， - 20冰凍保存。多次凍融會(huì)使 dNTP降解。在 PCR反應(yīng)中， dNTP應(yīng)為 50 200umol/L ，尤其是注意 4 種 dNTP的濃度要相等 ( 等摩爾配制 ) ，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí) ( 偏高或偏低 ) ，就會(huì)引起錯(cuò)配。 濃度過(guò)低又會(huì)降低 PCR產(chǎn)物

5、的產(chǎn)量。 dNTP 能與 Mg2+結(jié)合，使游離的 Mg2+濃度降低。dNTP儲(chǔ)存液： dNTP溶于 pH 為 7.0 的 NaOH貯存液中，最初的貯存液可稀釋到 10mol/L ，分裝后存放在 - 20冰箱中。 dNTP使用濃度在 20200 mol/L 之間。 4 種 dNTP?必須等濃度配合以減少錯(cuò)配誤差。dNTP使用濃度：在 PCR反應(yīng)中 , 使用低 dNTP濃度 ,? 可減少非靶位置啟動(dòng)和延伸時(shí)的核苷酸錯(cuò)誤摻入。一般可根據(jù)靶序列的長(zhǎng)度和組成來(lái)決定最低 dNTP濃度。例如在 100l 的反應(yīng)體系中 ,4 種 dNTP的濃度為 20mol/L, 可基本滿(mǎn)足合成2.6 g DNA或?10pm

6、ol/L? 的 400bp 序列。使用低dNTP濃度 ( 每種 dNTP濃度為2mol/L), 能夠高度靈敏地 (1/107)? 擴(kuò)增 ras 基因點(diǎn)突變的等位基因。4、模板模板核酸的量與純化程度， 是 PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一， 傳統(tǒng)的 DNA純化方法通常采用 SDS和蛋白酶 K 來(lái)消化處理標(biāo)本。 SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜， 并解離細(xì)胞中的核蛋白， SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀 ; 蛋白酶 K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與 DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份， 用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板

7、用于 PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本， 可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞， 裂解病原體， 消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離， 直接用于 PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA。5、Mg2+濃度Mg2+對(duì) PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響， 在一般的 PCR反應(yīng)中，各種 dNTP 濃度為 200umol/L 時(shí)， Mg2+濃度為 1.5 2.0mmol/L 為宜。 Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。引物是 PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵， 不好的引物嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量， 好的引物可以事倍功半 ; 酶