細胞工程實驗指導書

1、實驗指導書課程：細胞工程講課專業(yè)：生物工程、生物技術主編：徐艷實驗一實驗室的概況與培育基母液的配制一、實驗目的：熟悉植物細胞工程實驗室的大體結(jié)構(gòu)、必需的大體設備及其用途與作用方式，把握配制培育基母液的大體技術。二、材料與用具：一、藥品：生長調(diào)劑類物質(zhì)、無機鹽類、有機化合物等。二、用具：分析天平、移液管、量筒、培育瓶、燒杯、冰箱、母液瓶等。三、教學時數(shù)：4課時。四、實驗內(nèi)容：（-）實驗室的大體結(jié)構(gòu)及要緊設備：一、洗滌室：水槽、工作分、蒸儲水器等功能：器皿及材料洗滌；蒸鐳水制備。二、消毒室：高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱等功能：器皿的干燥；器皿及培育基的消毒。3、試劑室：試劑柜、冰箱功能：寄存試劑及器皿。4

2、、預備室：工作臺、天平、水浴鍋、電爐、顯微鏡及各類玻璃儀器、金屬儀器等功能：培育基藥品稱量、配制、分裝、滅菌：材料預處置；培育材料的觀看分析。五、接種室（含緩沖室）：超凈工作臺、接種箱等功能：無菌操作。6、培育室：培育架、搖床等功能：培育物的操縱培育。7、馴化移栽室：如溫室、大棚等功能：試管苗的馴化移栽。（二）培育基母液的配制:一、MS大體培育基母液：各成份單獨稱量、單獨溶解后混合定容大量元素母液：10倍，1L注意：易與其他成份反映產(chǎn)生沉淀；微量元素母液：100倍，0.5L鐵鹽母液：100倍，0.5L注意：二者等體積溶解后混合，且需80c水浴lh充分螯合，等待冷卻后定容;有機母液:100倍，0

3、.5L母液種類成分規(guī)定用量(mg/L)擴大倍數(shù)稱取量(mg)母液定容體積(ml)配1LMS培養(yǎng)基吸取量(ml)大量元素KNOjNHNOsKH3PoiI900I6503701704401019000165003700170044001000100微量元素h：bo3KI0.830.25100223086062083252.52.550010鐵鹽NaHDTA1003730278050010有機化合物煙酸甘氨酸肌醇0.51.01001005010010501000050010二、激素類母液的配制:Img/ml的6-BA50ml：先用/L的HCL或NaOH溶解后再加水定容;ml的NAA50ml：先用少量

4、/L的aOH溶解后再加水定容。注：精度要求精準到小數(shù)點后三位。(三)培育器皿的洗滌：一、對污染的培育器皿先進行消毒滅菌處置；二、清除殘渣，用清水洗凈，浸泡于合成洗滌劑中6-24小時；3、用洗滌刷洗滌，并用自來水沖洗干凈；4、用烘箱烘干或晾干，寄存于防塵櫥內(nèi)備用。五、實驗一、母液相制關記錄:備表：母液名稱濃縮倍數(shù)制備培養(yǎng)基取用量制備日期制備人激素母液名稱母液濃度制備日期制備人培養(yǎng)基成分規(guī)定用量(mg/L)濃縮(擴大)倍數(shù)制備(定容)體積理論稱取量(g)實際稱取量(g)配1LMS培養(yǎng)基吸取量(ml)二、試劑標簽:例:實制與滅一、實驗了解MS大量10X100ml/L2008-3-3007園林（1）組

5、驗NAA二培育基的配菌ml2008-3-30目07園林（1）組的：培育基滅菌的原理，熟悉培育基的組成和要求，把握固體培育基配制和滅菌的大體技術。二、材料與用具：一、藥品：各類母液、瓊脂、白糖、NaOH、PH試紙等。二、用具：分析天平、移液管、量筒、電爐、滅菌鍋、培育瓶等。三、教學時數(shù)：8課時。四、實驗內(nèi)容：(-)培育基的制備：一、按配方要求稱好670g/L瓊脂放入鍋中，加入2/3-3/4終體積的水，加熱煮化,一樣先用旺火燒開，再用文火煮溶，并注意常常攪拌，避免糊底；二、按配方要求稱好15-30g/L糖，待瓊脂加熱溶化后加入：3、依照培育基配方，依照各類母液順序和規(guī)定量，用移液管吸或量筒取母液，

6、放在燒杯中，待瓊脂和糖充分溶解后加入；4、加水定容，并充分混勻；五、用L的HC1或N8H調(diào)整PH至規(guī)定范圍；六、將培育基分裝至培育容器內(nèi)，每瓶培育基深度維持在1cm左右；7、封口，并預備滅菌。(二)培育基的滅菌：培育基分裝完后應在24h內(nèi)滅菌一、打開鍋蓋，加水至水位線；二、把已裝好培育基的培育瓶，連同蒸飾水及接種用具等放人鍋內(nèi)，裝時不要過度傾斜培育基，以避免弄到瓶口上或流出，且物品體積不大于鍋內(nèi)整體積的80%：3、蓋上鍋蓋，對角旋緊螺絲，接通電源加熱；4、打開平安閥和排氣閥排放寒氣，至大量白色蒸汽冒出時關閉加壓升溫，或關閉平安閥和排氣閥，當壓力升至0.05MPa時，打開放氣閥放氣至大量白色蒸汽

7、冒出時關閉加壓等溫；五、當氣壓上升到12rt時，保持在121-125%之間滅菌20min左右，停止加熱；6、由慢到快緩慢排氣，當氣壓回后打開鍋蓋，掏出培育基，放于無菌空間的平臺上冷凝備用。注意：冷空氣必需充分排盡，不然滅菌不完全，容易污染；滅菌時刻應依照器皿體積嚴格操縱，不然易破壞PH值及化學物質(zhì)，產(chǎn)生有害物質(zhì)且培育基不易凝固；滅好的培育基不要放置時刻太長，最多不能超過2周。五、實驗相關記錄：培育基制備表：培養(yǎng)基配方母液名稱MS大量MS微量MS鐵鹽MS有機BANAA母液濃度培養(yǎng)基體積取用母液量（ml）實驗三外植體的滅菌與接種一、教學目的：了解外植體滅菌的原理，熟悉無菌空間的滅菌方式，把握外植體

8、的滅菌方式步驟及無菌操作技術。二、材料與用具：一、藥品：75%的酒精、95%的酒精、%的升汞（或漂白粉）、無菌水等二、用具：超凈工作臺、滅過菌的培育基、接種器械（要緊指解剖刀、剪子、鍛子等）、酒精燈、培育材料（根、莖、葉或種子等）等。三、滅菌原理：植物外植體都是帶菌的，在接種前必需進行消毒處置，通過化學消毒劑滅菌，可在不殺死植物材料的前提下取得無菌材料進行組織養(yǎng)。四、教學時數(shù)：4課時。五、實驗內(nèi)容：（-）無菌空間的滅菌：一、按期進行氣體熏蒸：（100ml甲醛+5g高鎰酸鉀）Om。范圍，熏蒸后實驗室封鎖3-5天以避免其對人體產(chǎn)生危害；二、利用之前進行紫外線照射：每次利用前照射15-30min；3

9、、利用之前開動超凈工作臺：須提早開動10-20min以保證臺內(nèi)的無菌環(huán)境。注意：避免塵埃堵塞超凈工作臺過濾器，并按期檢查臺面風速：利用之前先將需用物品放入臺內(nèi)，半途不宜拿進，且擺放東西不易太多，尤其不能堆放太高以防擋風。（二）植物材料修剪與預備：一、取材：選取帶菌量少且生理年齡較小的母株，采取生長正常、無病蟲害的組織材料，除去多余部份，然后將材料整理成適當大小放入燒杯中；二、預處置：先用洗滌劑清洗后再用尼龍網(wǎng)或脫脂紗布覆蓋杯口，然后將其置于自來水管下沖洗30-120分鐘。（三）無菌操作：于超凈工作臺內(nèi)進行一、臺面及器械消毒：對臺面及人手采納75%酒精進行擦拭消毒，對無菌操作的器械進行灼燒滅菌，

10、并放于支架上待涼；二、外植體滅菌：于超凈工作臺內(nèi)，用709L75%的乙醇處置15-60秒，當即除去乙醇；在燒杯中加入消毒劑（如厥升汞），同時可滴1-2滴吐溫，將燒杯振蕩或攪拌滅菌處置3-10分鐘；棄去消毒液，用無菌水清洗3-4次，每次1-3分鐘；將滅菌后的材料置于墊有無菌紙的培育肌中晾干備用。3、外植體的切割與接種：將材料剪成1cm長或切割成1cm二大小左右，依照極性或具體要求接種到培育基上。注意：接種后的培育瓶必需及時放入培育室進行操縱培育，不然阻礙外植體生長。六、實驗相關記錄：接種一周后，觀看接種材料的污染情形，并進行相關記錄，分析污染緣故。實驗號：總瓶數(shù):日期污染瓶數(shù)死亡瓶數(shù)萌動瓶數(shù)總計

11、瓶數(shù)比率（%）實驗四馬鈴薯的莖尖脫毒培育一、教學目的：了解植物茅舍尖脫毒的大體原理，把握馬鈴薯莖尖脫毒的實驗進程及方式，學習運用指示植物法對馬鈴薯病毒進行鑒定。二、材料與用具：一、材料：帶芽馬鈴薯塊莖，指示植物等。二、藥品：75%的酒精、95%的酒精、%的升汞（或漂白粉）、無菌水等。3、用具：超凈工作臺、滅過菌的培育基及培育皿、接種器械（要緊指解剖刀、剪子、鏡子等）、酒精燈、解剖鏡、光照培育箱等。三、實訓原理：植物病毒在寄主植物體內(nèi)的散布具有不均勻性，莖尖（或根尖）等分生組織不含或很少含有病毒粒子，通過植物分生組織離體培育可取得無病毒植株。另外，某些植物病毒對熱不穩(wěn)固，在較高溫度（35-40）

12、條件下會被鈍化而失活,其增殖速度會減緩或停止，采取適當?shù)母邷靥幹靡部稍诤苌倩虿粨p害植物的情形下取得無病毒植株。四、教學時數(shù)：4課時。五、實驗內(nèi)容：一、高溫預處置：待馬鈴薯芽長至2cm時,放入38c的光照培育箱中，光照12h/d,處置2周左右。二、材料剪取與滅菌：剪取馬鈴薯莖尖l-2cm,采納自來水沖洗，剝?nèi)ネ獠咳~片，置于超凈工作臺上進行常規(guī)消毒（75%酒精5-15s,%升汞8Tomin,無菌水3-8次），置于消毒過的培育皿中備用。3、莖尖剝離與接種：將已裝有消毒莖尖的培育皿置于解剖鏡下，逐層剝?nèi)ビ兹~，露出圓滑的生長點，切取-0.5mm的帶1-2個葉原基的莖尖，直立接種到固體培育基上。4、離體培

13、育：通過繼代、生根培育等，取得完整植株。五、病毒檢測：帶根植株通過馴化移栽，取其汁液接種至指示植物千日紅或覽色藜上，觀看其脫毒成效。六、脫毒試管苗的擴繁：對脫毒試管苗進行試管內(nèi)擴繁，或利用愛惜地進行隔離快繁，取得大量商品植株。六、實驗相關記錄：接種一周后，觀看接種材料的污染情形，并進行相關記錄，分析污染緣故。實驗號：總瓶數(shù):日期污染瓶數(shù)死亡瓶數(shù)萌動瓶數(shù)總計瓶數(shù)比率(%)實驗五繼代與生根培育(可與實驗三互換進行以利于鍛煉無菌操作技術)一、教學目的：通過實驗，把握無菌操作技術和植物快速繁衍的大體方式和進程，能熟練的進行獨立操作。二、要緊試劑和儀器：超凈工作臺、70%75%的酒精、解剖刀、剪子、鏡子

14、、母苗瓶等。三、教學時數(shù)：4課時。四、實驗內(nèi)容：1、預備實驗所需東西并擺放到位，打開無菌操作室的紫外燈及超凈工作臺的紫外燈和鼓風機,15-20min后，關閉紫外燈；二、用水和香皂洗凈雙手，穿上滅菌過的專用實驗服、帽子與鞋子，在關閉紫外燈15-20min后進入接種室；3、用70%75%的酒精擦拭工作臺和雙手，把解剖刀、剪子、鎰子等器械浸泡在95%酒精中，在火焰上滅菌后，放在器械架上待涼；4、取下接種器械，掏出無菌紙；五、打開母苗瓶口，用火焰燒瓶口，轉(zhuǎn)動瓶口使瓶口各部份都燒到，掏出母苗放在無菌紙上，依照需要進行切割；六、打開新培育基瓶口，把培育材料接入培育瓶，蓋上瓶口；7、接種終止后，清理和關閉超

15、凈工作臺；八、將接種后的培育瓶及時放入培育室進行操縱培育。注意：接種進程中不能說話及隨意走動，以避免污染；操作期間應常經(jīng)常使用70%酒精擦拭工作臺和雙手，接種器械應反復在95%的酒精中浸泡和在火焰上滅菌；接種器械必需涼透才可進行材料切割，不然易燙死燙傷材料；酒精棉球不可帶太多酒精，以防燒手；接種時應注意達到無菌操作標準，動作熟，切割準確，散布合理，臺面干凈。五、實驗相關記錄：要緊包括污染率、增殖倍數(shù)及生長情形等。實驗六組培苗的馴化移栽一、教學目的：了解組培苗由室內(nèi)至室外環(huán)境條件的轉(zhuǎn)變，把握生根苗的馴化移栽技術。二、材料與用具：一、藥品：多菌靈等消毒殺菌劑。二、用具：鎰子、水盆或桶、噴霧器、竹簽、栽培基質(zhì)（蛭石和珍珠巖）、栽培容器（育苗杯、盤）、生根苗瓶、馴化室（溫室或大棚）等。三、教學時數(shù)：4課時。四、實驗內(nèi)容：一、練苗：將生根的組培苗從培育室掏出，放在自然條件下13天，然后打開瓶口，再放置13天；二、基質(zhì)滅菌：將蛭石和珍珠巖別離用聚丙烯塑料袋裝好，在高壓滅菌鍋中滅菌20分鐘，滅菌后冷卻備用；3、育苗杯、盤預備：取干凈的育苗杯或盤，將基質(zhì)（蛭石和珍珠巖按1：1）混合均勻，然后倒入育苗杯或盤中，用木板刮平，將育苗杯或盤放入