細(xì)胞融合操作規(guī)程

1、細(xì)胞融合一、實(shí)驗(yàn)材料手術(shù)剪，鏡子，離心機(jī)，蠟盤等。二、實(shí)驗(yàn)所配試劑1640基礎(chǔ)培育液：取一包1640干粉，溶于1000mL雙蒸水中，慢慢加入2.5gNaHCChUm濾膜過濾除菌，分裝，4c冰箱保留備用。青鏈霉素溶液（100X）：取青霉素100萬單位和鏈霉素1g,無菌溶于100mL己滅菌的三蒸水中，Um濾膜過濾除菌，1mL/管分裝,-20凍存?zhèn)溆谩?640完全培育液：向1640基礎(chǔ)培育液中加入10%的小牛血清和1%青鏈霉素溶液（100X）（為養(yǎng)成良好的操作適應(yīng)，建議不加最好）,搖勻，4冰箱保留備用。HT培育液：在100mL含15%血清的1640完全培育液中加入1mL100X的HT溶液，搖勻，4冰

2、箱保留備用。HAT培育液：在100mL含15%血清的1640完全培育液中加入2mL50X的HAT溶液（利用前HAT有部份白色沉淀應(yīng)充分混勻），搖勻，4冰箱保留備用。GNK溶液：準(zhǔn)確稱取KCL0.4g,NaCL8g,NaJiPOi2401.77g（NaJiPOj12H：03.56g）,NaH2PO.H：00.69g（NaHfOi-2H：00.78g）,酚紅0.01g,葡萄糖2g,加DDW定容至1000mL,調(diào)劑pH值至，115高壓滅菌，4c保留備用。三、實(shí)驗(yàn)步驟1 .免疫小鼠選擇6-8周齡的Balb/c雌性小鼠進(jìn)行免疫，免疫劑量5011g/只，皮下注射。免疫程序如下：第一次免疫：100J1L抗原

3、+100pL弗氏完全佐齊“只增強(qiáng)免疫：100pL抗原+100pL弗氏不完全佐齊I/只，于首免后2周后進(jìn)行。共免疫3次，每次距離2周。第二次免疫后的第十天斷尾采血（一樣尾部采血4匹，溶于200pLPBS混勻備用）檢測效價(jià)，若是效價(jià)很低或沒有效價(jià)，建議直接舍棄，不用繼續(xù)再免疫。若是效價(jià)能夠，在二免后的2周進(jìn)行三免，最后一次免疫10天后，斷尾采血,用適當(dāng)?shù)目乖M(jìn)行包被，用間接ELISA檢測抗體效價(jià)，效價(jià)達(dá)到1:1600以上即可進(jìn)行細(xì)胞融合。超強(qiáng)免疫：最后一次增強(qiáng)免疫后2周，細(xì)胞融合前35天，尾靜脈或腹腔注射50pg純抗原。2 .飼養(yǎng)細(xì)胞的制備融合前1-2d制備飼養(yǎng)細(xì)胞。取昆明鼠1只致死（搜集小鼠血清

4、,以供挑選時(shí)用該血清做陰性對照），75%酒精消毒體表，無菌手術(shù)剪子輕輕剝?nèi)バ∈蟮母共科つw，以避免剪破腹膜，暴露腹膜。然后用5mL注射器和16號針頭將5mL預(yù)冷的HAT打入小鼠腹腔，輕輕壓擠腹部，從頭吸出注入的液體（在吸取進(jìn)程中為避免污染，幸免針頭刺破腸管），收取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。用HAT稀釋至40mL100uL/孔添加到4塊96孔細(xì)胞培育板中，置37c5%COz培育箱中培育，第二天檢查有無污染情形。3 .細(xì)胞計(jì)數(shù)為保證NSO細(xì)胞在融合時(shí)達(dá)到最正確狀態(tài)和高活力，建議在融合時(shí)前一天給所需的每瓶NSO細(xì)胞換液，以備融合時(shí)利用。80%左右NSO的細(xì)胞計(jì)數(shù)(三次平均數(shù))：(X105+9X105+X105

5、)/3=X107mL脾細(xì)胞計(jì)數(shù)義107mL,大約是40mL有X10'個(gè)細(xì)胞，兩次計(jì)數(shù)相差不大，因此脾細(xì)胞數(shù)可固定為X10,個(gè)/40mL。NSO細(xì)胞計(jì)數(shù):X10$ 個(gè)/mL (70%)(80%4 .細(xì)胞融合在40水浴中預(yù)熱GNK溶液、PEG和HAT溶液；免疫小鼠采血并分離血清，然后致死浸泡到酒精中；搜集NSO細(xì)胞于50mL離心管中（為保證高融合率建議大于4瓶90%的NS0細(xì)胞）,1000r/min離心10min,棄上清,用GNK洗一次;5小鼠脾細(xì)胞的制備依次剪開小鼠皮膚，腹膜暴露腹腔（建議為避免污染，建議至少用兩套手術(shù)刀具，一套用于剝開小鼠外部皮膚和腹膜，另一套用于掏出小鼠脾臟），取脾臟

6、放置與尼龍紗布上充分研碎，并用GNK洗下去，搜集脾細(xì)胞于50mL離心管中,1000r/min離心10min,棄上清,打散細(xì)胞團(tuán)；將脾細(xì)胞與NS0骨髓瘤細(xì)胞混合于50mL離心管中，加GNK溶液至40mL,1000r/min離心10min,棄上清，打散細(xì)胞團(tuán)（充分打散細(xì)胞團(tuán)，以保證融合時(shí)的高融合率）；為保證融合時(shí)的溫度能夠事前將混勻好的細(xì)胞在40C水浴預(yù)熱兩分鐘，然后在另一剛掏出的40水浴燒杯中做融合，用1mL或大于1mL吸管將預(yù)熱的50%PEG（）滴加到融合管中，邊加邊輕輕搖動(dòng)融合管，Imin或80s內(nèi)加完，并繼續(xù)在水浴中緩緩搖動(dòng)融合管。當(dāng)即緩慢滴加37預(yù)熱的GNK溶液15mL。加入步驟為：1m

7、L/30s,3mL/30s,llmL/30so然后慢慢補(bǔ)加GNK溶液至40mL,37水浴靜置5min,1000r/min離心10min,棄上清。打散細(xì)胞團(tuán)，加40mLHAT完全培育具吹打混勻，加到含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培育板上，每孔100r1,置37c5%CCh培育箱中培育?？寺〖?xì)胞的挑選、轉(zhuǎn)孔及亞克隆一、融合細(xì)胞的培育1、融合后的細(xì)胞置于CO2培育箱中培育，第二天檢查有無污染,如發(fā)覺污染當(dāng)即滴加1%的NaOH。2、一樣23d可見小克隆；7d時(shí)于顯現(xiàn)克隆的孔內(nèi)半量換液（注意：37預(yù)熱HAT培育基）；3、10d左右能夠吸取少量上清用于挑選（一樣吸取50IOOrL）,并補(bǔ)加等量的HAT培育基（換液

8、時(shí)應(yīng)輕柔，以減少對克隆細(xì)胞的損傷）；4、14d左右對所挑選的陽性孔可半量改換HT培育基，同時(shí)對挑選陽性孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)至24孔培育板中擴(kuò)大培育，預(yù)備克隆化。在挑選進(jìn)程中將HAT培育基慢慢改換為完全培育基RPMI1640/10o二、挑選（1）包被。將抗原以pH的NaCCh-NaHCCh包被，每塊酶標(biāo)板以5-20ug抗原為宜（若是抗原為多肽或小分子物質(zhì)，那么需要加大包被量，若是是純化病毒依照病毒的濃度做1:400-1000倍稀釋）。每孔的包被體積為50ul。37c包被2h或4包被留宿。（2）封鎖。倒掉抗原，拍干酶標(biāo)板孔內(nèi)液體，5%脫脂牛奶（PBST溶解）或其它無關(guān)物種血清于37封鎖2h,封鎖完后可當(dāng)即利

9、用，也能夠洗滌一次置于4密封保留以備后面利用。（3）一抗。封鎖完后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，用封鎖液1:1稀釋待檢測克隆孔上清，每孔50ul為宜。同時(shí)做陽性（融合小鼠血清1:500-1000倍稀釋）和陰性（所制備飼養(yǎng)細(xì)胞小鼠血清1:200倍稀釋）及空白對照（所稀釋抗體用封鎖液）和無克隆孔上清對照。在每塊板子上做好標(biāo)記。37孵育30min。（4）二抗。孵育完一抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，以PBST洗滌3次，每次5min。依照二抗說明稀釋二抗至適當(dāng)比例，每孔加入50uI,37孵育30min,>（5）顯色。孵育完二抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，加入顯色劑，37顯色5-10min,拍照記錄檢測結(jié)果，挑選出

10、陽性較強(qiáng)的克隆進(jìn)行特異性檢測。三、特異性挑選對挑選的強(qiáng)陽性克隆孔進(jìn)行特異性挑選，若是是用大腸桿菌表達(dá)的蛋白，能夠用載體蛋白、正常大腸桿菌上清和其它無關(guān)蛋白進(jìn)行包板檢測；若是是細(xì)胞毒免疫的能夠用正常細(xì)胞的裂解液包板檢測；若是是組織毒免疫的能夠用正常動(dòng)物組織包板檢測。其檢測方式同上，注意設(shè)立對照組。同時(shí)對挑選的特異性較強(qiáng)的陽性孔轉(zhuǎn)至24孔培育板中擴(kuò)大培育，預(yù)備克隆化。四、陽性細(xì)胞的轉(zhuǎn)孔一、為保證轉(zhuǎn)孔成功，建議當(dāng)96孔板細(xì)胞長至80%時(shí)轉(zhuǎn)孔。2、按常規(guī)方式轉(zhuǎn)孔前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞，24孔板每孔加入的飼養(yǎng)細(xì)胞懸液，第二天檢查有無污染情形。（轉(zhuǎn)孔時(shí)所用培育基和轉(zhuǎn)孔前所用培育基應(yīng)維持一致）。3、搜集待轉(zhuǎn)孔的

11、陽性細(xì)胞上清，做好標(biāo)記保留備用，添加己預(yù)熱的HAT和HT培育基1:1混合（因現(xiàn)在96孔板克隆已半量過度到HT培育基）各i00ui/?Lo4、用200U1移液器輕輕吹下細(xì)胞，為減少對克隆細(xì)胞的刺激，吹打進(jìn)程應(yīng)輕柔，然后將細(xì)胞懸液加入至24孔板中，為保證細(xì)胞均勻分布到板底，能夠用振蕩器輕輕混勻，做好標(biāo)記。同時(shí)，對所轉(zhuǎn)孔細(xì)胞補(bǔ)加新的培育基，保留原始孔以幸免轉(zhuǎn)孔失敗。五、轉(zhuǎn)孔后的檢測當(dāng)轉(zhuǎn)孔后細(xì)胞長至50%時(shí)，用ELISA檢測方式及時(shí)進(jìn)行效價(jià)檢測和特異性檢測，檢測方式同上，挑選出效價(jià)高和特異性較強(qiáng)的預(yù)備亞克隆。同時(shí)在挑選進(jìn)程中對24孔板的細(xì)胞慢慢改換至1640完全培育基。六、雜交瘤細(xì)胞的克隆為保證克隆細(xì)

12、胞的活性和數(shù)量，建議當(dāng)待克隆的細(xì)胞孔長至80%時(shí)進(jìn)行有限稀釋。提早一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞，搜集待轉(zhuǎn)孔細(xì)胞的培育上清保留備用，加入已預(yù)熱1640不完全培育基1ml（其目的是該孔細(xì)胞被有限稀釋后能夠凍存該孔細(xì)胞。凍存方式為：直接吸取500ul該孔細(xì)胞懸液,再加入400ul胎牛血清和100ulDMSO混勻，1ml/管，做好標(biāo)記，依照正常程序凍存細(xì)胞），輕輕吹打混勻細(xì)胞，掏出少量細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，采納有限稀釋法對陽性孔的融合細(xì)胞進(jìn)行克隆化。其步驟如下：一、用10ul臺盼藍(lán)和10ul細(xì)胞懸液于PCR管中等比例混合后，在顯微鏡下進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)依照公式：細(xì)胞數(shù)/mL=N/4X103X10X稀釋倍數(shù)（N為顯微鏡下四

13、角4個(gè)大方格的活細(xì)胞總數(shù)）來計(jì)算每毫升細(xì)胞懸液所含的活細(xì)胞數(shù)，然后取適量的細(xì)胞懸液，用1640培育基（現(xiàn)在24孔板克隆細(xì)胞過度到那種培育基就用那種培育基做有限稀釋）稀釋到10mL,而且要含有2X103個(gè)活細(xì)胞（稀釋度I）；二、取1mL稀釋度I的細(xì)胞懸液加9mLi640完全培育基（稀釋度H）；3、取3mL稀釋度H的細(xì)胞懸液加7mL1640完全培育基（稀釋度III）;4、用稀釋度I的細(xì)胞懸液鋪板半塊96孔板，IOOrL/孔，20個(gè)細(xì)胞/孔；用稀釋度H的細(xì)胞懸液鋪板另半塊96孔板，IOOrL/孔，2個(gè)細(xì)胞/孔；用稀釋度III的細(xì)胞懸液鋪一塊96孔板，IOOrL/孔，個(gè)細(xì)胞/孔；五、將上述培育板置于CO?培育箱中培育，培育7d后，對單克隆孔進(jìn)行標(biāo)記并半量換液，當(dāng)單克隆長