分光光度計(jì)2009-9

1、Basic UV-Vis Theory and Applications分光光度計(jì)的原理與應(yīng)用一、基本原理一、基本原理o 利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測(cè)定物質(zhì)的利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測(cè)定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定量分吸收光譜，利用此吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱為析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱為分光光度法或分光光度法或分光分光光度技術(shù)，使用的儀器稱為分光光度計(jì)。光度技術(shù)，使用的儀器稱為分光光度計(jì)。o 分光光度計(jì)靈敏度高，測(cè)定速度快，應(yīng)用范圍廣，分光光度計(jì)靈敏度高，測(cè)定速度快，應(yīng)用范圍廣，其中的紫外其中的紫外/可見分光光度技術(shù)更是生物化學(xué)

2、研究可見分光光度技術(shù)更是生物化學(xué)研究工作中必不可少的基本手段之一。因此我們重點(diǎn)討工作中必不可少的基本手段之一。因此我們重點(diǎn)討論紫外論紫外/可見分光光度法的基本原理、儀器構(gòu)造及可見分光光度法的基本原理、儀器構(gòu)造及其在生化領(lǐng)域中的應(yīng)用等。其在生化領(lǐng)域中的應(yīng)用等。電磁輻射的波長(zhǎng)電磁波波長(zhǎng)的范圍o Region Wavelength (nm)o Far ultraviolet 10-200o Near ultraviolet 200-380o Visible 380-780o Near infrared 780-3000o Middle infrared 3000-30,000o Far infrar

3、ed 3104-3105o Microwave 3105-1109Relationship between light absorption and color電子躍遷類型與紫外吸收波長(zhǎng)(nm)關(guān)系o 電子躍遷類型 例子 紫外吸收波長(zhǎng)范圍o * CH 100150 nm o *(非共軛) CO 200 nm o *(共軛) CC 200300 nm o n* CO 300 nmExamples of transitions and resulting maxo*躍遷：此類躍遷所需能量較小，躍遷：此類躍遷所需能量較小，吸收波長(zhǎng)在紫外區(qū)的吸收波長(zhǎng)在紫外區(qū)的200300 nm，不飽和烴、共軛烯烴及芳

4、香烴均可發(fā)不飽和烴、共軛烯烴及芳香烴均可發(fā)生這類躍遷，氨基酸、蛋白質(zhì)與核酸生這類躍遷，氨基酸、蛋白質(zhì)與核酸均含有大量共軛雙鍵，因而均含有大量共軛雙鍵，因而200300 nm的紫外吸收測(cè)定，在生化實(shí)的紫外吸收測(cè)定，在生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)中有極廣泛的用途。驗(yàn)技術(shù)中有極廣泛的用途。Commonly used solvents and their cut-off wavelengths不同溶劑對(duì)酚紫外檢測(cè)的影響不同溶劑對(duì)酚紫外檢測(cè)的影響o 若逐漸改變照射某物質(zhì)的入射光的波長(zhǎng)，并若逐漸改變照射某物質(zhì)的入射光的波長(zhǎng)，并測(cè)定物質(zhì)對(duì)各種波長(zhǎng)光的吸收程度（吸光度測(cè)定物質(zhì)對(duì)各種波長(zhǎng)光的吸收程度（吸光度“A”或光密度或光密

5、度“O.D”）或透射程度（透光）或透射程度（透光度度“T”），以波長(zhǎng)），以波長(zhǎng)作橫坐標(biāo)，作橫坐標(biāo)，“A”或或“T”為縱座標(biāo)，畫出連續(xù)的為縱座標(biāo)，畫出連續(xù)的“A”或或“T”曲線，即為該物質(zhì)的吸收光譜曲線。曲線，即為該物質(zhì)的吸收光譜曲線。吸收峰的命名o 曲線上“A”處稱最大吸收峰，它所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱最大吸收波長(zhǎng)，以max表示。o 曲線上“B”處有一谷，稱最小吸收，它所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)，所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)，稱最小吸收波長(zhǎng)，以min 表示。o 曲線上在最大吸收峰旁邊有一小峰“C”，稱肩峰。o 在吸收曲線的波長(zhǎng)最短的一端，曲線上“D”處，吸收相當(dāng)強(qiáng)，但不成峰形，此處稱為末端吸收。o max是化合物中電子能級(jí)躍遷時(shí)吸收

6、的特是化合物中電子能級(jí)躍遷時(shí)吸收的特征波長(zhǎng)，不同物質(zhì)有不同的最大吸收峰，所征波長(zhǎng)，不同物質(zhì)有不同的最大吸收峰，所以它對(duì)鑒定化合物極為重要。吸收光譜中，以它對(duì)鑒定化合物極為重要。吸收光譜中，max、min、肩峰以及整個(gè)吸收光譜的肩峰以及整個(gè)吸收光譜的形狀決定于物質(zhì)的性質(zhì)，其特征隨物質(zhì)的結(jié)形狀決定于物質(zhì)的性質(zhì)，其特征隨物質(zhì)的結(jié)構(gòu)而異，所以是物質(zhì)定性的依據(jù)。構(gòu)而異，所以是物質(zhì)定性的依據(jù)。o 測(cè)定某物質(zhì)的紫外吸收光譜的曲線，可與已測(cè)定某物質(zhì)的紫外吸收光譜的曲線，可與已知標(biāo)準(zhǔn)的紫外光譜圖相對(duì)照，對(duì)照時(shí)須注意知標(biāo)準(zhǔn)的紫外光譜圖相對(duì)照，對(duì)照時(shí)須注意測(cè)定的條件，如溶劑、濃度等。測(cè)定的條件，如溶劑、濃度等。o

7、由于化合物紫外吸收峰較少，而且峰形都很寬，不由于化合物紫外吸收峰較少，而且峰形都很寬，不象紅外光譜有許多指紋峰，所以在用紫外吸收光譜象紅外光譜有許多指紋峰，所以在用紫外吸收光譜進(jìn)行化合物定性鑒定時(shí)，應(yīng)注意：化合物相同，其進(jìn)行化合物定性鑒定時(shí)，應(yīng)注意：化合物相同，其紫外光譜應(yīng)完全相同；但是紫外光譜相同不一定化紫外光譜應(yīng)完全相同；但是紫外光譜相同不一定化合物就相同，可能僅是存在某些相同的發(fā)色團(tuán)或基合物就相同，可能僅是存在某些相同的發(fā)色團(tuán)或基團(tuán)，因此在鑒定時(shí)應(yīng)與紅外光譜相結(jié)合。團(tuán)，因此在鑒定時(shí)應(yīng)與紅外光譜相結(jié)合。o 由于電子躍遷的同時(shí)也引起分子的轉(zhuǎn)動(dòng)和振動(dòng)光譜，由于電子躍遷的同時(shí)也引起分子的轉(zhuǎn)動(dòng)和振

8、動(dòng)光譜，要把電子躍遷和分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)的躍遷完全分開是要把電子躍遷和分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)的躍遷完全分開是不可能的，因此我們常見的紫外吸收光譜是由一個(gè)不可能的，因此我們常見的紫外吸收光譜是由一個(gè)或幾個(gè)寬的吸收譜帶所組成?；驇讉€(gè)寬的吸收譜帶所組成。紫外光譜中常用的術(shù)語(yǔ)發(fā)色團(tuán)、助色團(tuán)、增色效應(yīng)和減色效應(yīng)。發(fā)色團(tuán)、助色團(tuán)、增色效應(yīng)和減色效應(yīng)。o 發(fā)色團(tuán)：凡是與飽和碳?xì)浠衔镞B接能引起發(fā)色團(tuán)：凡是與飽和碳?xì)浠衔镞B接能引起n*、*、 n* 等電子躍遷的基團(tuán)稱為發(fā)色團(tuán)。等電子躍遷的基團(tuán)稱為發(fā)色團(tuán)。例如：例如：CC、CO等。等。o 助色團(tuán)：助色團(tuán)是一些具有非共價(jià)鍵的基團(tuán)（如助色團(tuán)：助色團(tuán)是一些具有非共價(jià)鍵的基團(tuán)（如

9、OH、NH2、SH等）。這些基團(tuán)在波長(zhǎng)等）。這些基團(tuán)在波長(zhǎng)200 nm處沒(méi)有吸收，當(dāng)它與發(fā)色團(tuán)相連接時(shí)，使發(fā)色處沒(méi)有吸收，當(dāng)它與發(fā)色團(tuán)相連接時(shí)，使發(fā)色團(tuán)的吸收帶向長(zhǎng)波移動(dòng)，稱為團(tuán)的吸收帶向長(zhǎng)波移動(dòng)，稱為紅移紅移（或淺色效應(yīng)），（或淺色效應(yīng)），紅移的同時(shí)吸收帶的強(qiáng)度增加。若助色團(tuán)與發(fā)色團(tuán)紅移的同時(shí)吸收帶的強(qiáng)度增加。若助色團(tuán)與發(fā)色團(tuán)相連接，產(chǎn)生相連接，產(chǎn)生 n* 躍遷，使吸收波長(zhǎng)向短波躍遷，使吸收波長(zhǎng)向短波移動(dòng)，稱為移動(dòng)，稱為蘭移蘭移（或深色效應(yīng)）。（或深色效應(yīng)）。增色效應(yīng)（增色效應(yīng)（hyperchromic effect）o 核酸變性或降解，使得核酸變性或降解，使得DNA或或RNA溶液對(duì)溶液對(duì)紫

10、外光的吸收明顯增加，即紫外光的吸收明顯增加，即 值（吸光系數(shù)值（吸光系數(shù)或稱消光系數(shù)）顯著升高，此現(xiàn)象稱為增色或稱消光系數(shù)）顯著升高，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。此效應(yīng)是由于堿基之間電子相互作用效應(yīng)。此效應(yīng)是由于堿基之間電子相互作用的改變所致，通常在的改變所致，通常在260nm處測(cè)量。處測(cè)量。減色效應(yīng)（減色效應(yīng)（hypochromic effect）o 在一定的條件下，變性的核酸又可以復(fù)性，在一定的條件下，變性的核酸又可以復(fù)性，此時(shí)此時(shí)值又明顯減少，回復(fù)到原來(lái)的核酸分值又明顯減少，回復(fù)到原來(lái)的核酸分子子值較低的水平，即此時(shí)值較低的水平，即此時(shí)DNA或或RNA溶溶液的紫外光吸收顯著降低，此現(xiàn)象稱為減色液

11、的紫外光吸收顯著降低，此現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)，此效應(yīng)也是由于堿基之間電子相互作效應(yīng)，此效應(yīng)也是由于堿基之間電子相互作用的變化所引起的，通常在用的變化所引起的，通常在260nm條件下條件下測(cè)量。測(cè)量。光吸收定律光吸收定律o 朗伯朗伯比爾（比爾（Lambertbeer）光吸收定律：）光吸收定律： A-lgTb co A吸光度，又稱光密度吸光度，又稱光密度“O.D”。o T透光度，透光度， TI / I。，。， I。為照射到吸收為照射到吸收池上的光強(qiáng)，池上的光強(qiáng)，I為透過(guò)吸收池的光強(qiáng)。為透過(guò)吸收池的光強(qiáng)。o 摩爾吸光系數(shù)（摩爾吸光系數(shù)（Lmol-1cm-1）。）。o b樣品光程（樣品光程（cm），通常使

12、用），通常使用1.0cm 的吸收池，的吸收池，b=1cm。o C樣品濃度（樣品濃度（mol/L）。）。吸光度吸光度A與物質(zhì)的吸光系數(shù)與物質(zhì)的吸光系數(shù)“”和物質(zhì)的濃度和物質(zhì)的濃度“C”成正比。成正比。檢測(cè)計(jì)算溶液的摩爾濃度o 例如：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測(cè)定 260nm處的吸光度為0.650，用同一吸收池測(cè)定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，計(jì)算尿嘧啶溶液的摩爾濃度，已知其摩爾吸光系數(shù) = 8.2103 M-1cm-1（Mmol / L)。o A bC A（溶劑加樣品的吸光度）（溶劑的吸光度）o A0.6500.0700.580 b1cmo C=7.110-5 mol / L 二、分光光度

13、計(jì)的組成和構(gòu)造 o 組成：各種型號(hào)的紫外組成：各種型號(hào)的紫外/可見分光度計(jì)，不可見分光度計(jì)，不論是何種型式，基本上都由五部分組成：論是何種型式，基本上都由五部分組成：o 光源：鎢燈和氘光源：鎢燈和氘(dao)燈燈o 單色器（包括產(chǎn)生平行光和把光引向檢測(cè)器單色器（包括產(chǎn)生平行光和把光引向檢測(cè)器的光學(xué)系統(tǒng)）；的光學(xué)系統(tǒng)）；o 樣品室；樣品室；o 接收檢測(cè)放大系統(tǒng)；接收檢測(cè)放大系統(tǒng)；o 顯示或記錄器。顯示或記錄器。 光源光源o 理想光源的條件是：能提供連續(xù)的輻射；光強(qiáng)度理想光源的條件是：能提供連續(xù)的輻射；光強(qiáng)度足夠大；在整個(gè)光譜區(qū)內(nèi)光譜強(qiáng)度不隨波長(zhǎng)有明顯足夠大；在整個(gè)光譜區(qū)內(nèi)光譜強(qiáng)度不隨波長(zhǎng)有明顯變

14、化；光譜范圍寬；使用壽命長(zhǎng)，價(jià)格低。變化；光譜范圍寬；使用壽命長(zhǎng)，價(jià)格低。o 用于可見光和近紅外光區(qū)的光源是鎢燈，現(xiàn)在最常用用于可見光和近紅外光區(qū)的光源是鎢燈，現(xiàn)在最常用的是鹵鎢燈（的是鹵鎢燈（Halogen lamp），即石英鎢燈泡中），即石英鎢燈泡中充以鹵素，以提高鎢燈的壽命。適用波長(zhǎng)范圍是充以鹵素，以提高鎢燈的壽命。適用波長(zhǎng)范圍是3201100nm。由于能量輸出的波動(dòng)為電壓波動(dòng)。由于能量輸出的波動(dòng)為電壓波動(dòng)的四次方倍，因此電源電壓必須穩(wěn)定。的四次方倍，因此電源電壓必須穩(wěn)定。o 用于紫外光區(qū)的是氘燈（用于紫外光區(qū)的是氘燈（Deuterium lamp），適），適用波長(zhǎng)范圍是用波長(zhǎng)范圍是19

15、5400nm，由于氘燈壽命有限，由于氘燈壽命有限，國(guó)產(chǎn)氘燈壽命僅五百小時(shí)左右，要注意節(jié)約燈時(shí)。國(guó)產(chǎn)氘燈壽命僅五百小時(shí)左右，要注意節(jié)約燈時(shí)。 單色器單色器o 單色器是分光光度計(jì)的心臟部分，它的作用是把來(lái)自光源單色器是分光光度計(jì)的心臟部分，它的作用是把來(lái)自光源的混合光分解為單色光并能隨意改變波長(zhǎng)。它的主要組成的混合光分解為單色光并能隨意改變波長(zhǎng)。它的主要組成部件和作用是：入射狹縫部件和作用是：入射狹縫限制雜散光進(jìn)入。色散限制雜散光進(jìn)入。色散元件元件即棱鏡或光柵，是核心部件，可將混合光分解為即棱鏡或光柵，是核心部件，可將混合光分解為單色光。準(zhǔn)直鏡單色光。準(zhǔn)直鏡把來(lái)自入射狹縫的光束轉(zhuǎn)化為平等把來(lái)自入射

16、狹縫的光束轉(zhuǎn)化為平等光，并把來(lái)自色散元件的平等光聚焦于出射狹縫上。出光，并把來(lái)自色散元件的平等光聚焦于出射狹縫上。出射狹縫射狹縫只讓額定波長(zhǎng)的光射出單色器只讓額定波長(zhǎng)的光射出單色器o 轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡或光柵的波長(zhǎng)盤，可以改變單色器出射光束的波轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡或光柵的波長(zhǎng)盤，可以改變單色器出射光束的波長(zhǎng)；調(diào)節(jié)出入射狹縫隙的寬度，可以改變出射光束的帶寬長(zhǎng)；調(diào)節(jié)出入射狹縫隙的寬度，可以改變出射光束的帶寬和單色光的純度。和單色光的純度。o 光柵：光柵有透射光柵和反射光柵，實(shí)際應(yīng)用的都是反射光柵：光柵有透射光柵和反射光柵，實(shí)際應(yīng)用的都是反射光柵，它又可分為平面反射光柵（即通稱的反射光柵或閃光柵，它又可分為平面反射光柵（

17、即通稱的反射光柵或閃爍光柵）和凹面反射光柵兩類，凹面反射光柵可以起色散爍光柵）和凹面反射光柵兩類，凹面反射光柵可以起色散元件和準(zhǔn)直鏡兩個(gè)作用，使色散后的光束聚焦于出射狹縫，元件和準(zhǔn)直鏡兩個(gè)作用，使色散后的光束聚焦于出射狹縫，得到銳線光譜。得到銳線光譜。狹縫、光譜頻帶寬度和分辨率狹縫、光譜頻帶寬度和分辨率o 出射狹縫的寬度通常有兩種表示方法：一為出射狹縫的寬度通常有兩種表示方法：一為狹縫的實(shí)際寬度，以毫米（狹縫的實(shí)際寬度，以毫米（mm）表示，另）表示，另一種為光譜頻帶寬度，即指由出射狹縫射出一種為光譜頻帶寬度，即指由出射狹縫射出光束的光譜寬度，以毫微米光束的光譜寬度，以毫微米nm表示。例如，表示

18、。例如，出射狹縫的寬度是出射狹縫的寬度是6nm，并不是說(shuō)出射狹，并不是說(shuō)出射狹縫的寬度是縫的寬度是6nm，而是指由此狹縫射出的，而是指由此狹縫射出的光具有光具有6nm的光譜帶寬。的光譜帶寬。o 純粹的單色光只是一種理想情況，分光光度計(jì)所能純粹的單色光只是一種理想情況，分光光度計(jì)所能得到的得到的“單色光單色光”，實(shí)際上只是具有一定波長(zhǎng)范圍，實(shí)際上只是具有一定波長(zhǎng)范圍的譜帶，狹縫越寬，所包括的波長(zhǎng)范圍也愈寬。的譜帶，狹縫越寬，所包括的波長(zhǎng)范圍也愈寬。 對(duì)單色光純度來(lái)說(shuō)，狹縫是愈窄愈好，但光的強(qiáng)度對(duì)單色光純度來(lái)說(shuō)，狹縫是愈窄愈好，但光的強(qiáng)度也就越弱，因此狹縫不能無(wú)限制地小，狹縫的最小也就越弱，因此狹

19、縫不能無(wú)限制地小，狹縫的最小寬度取決于檢測(cè)器能準(zhǔn)確地進(jìn)行測(cè)量的最小光能量。寬度取決于檢測(cè)器能準(zhǔn)確地進(jìn)行測(cè)量的最小光能量。目前達(dá)到的最小寬度為目前達(dá)到的最小寬度為0.1nm。o 由于光柵分光其色散是線性的，所以只用一種狹縫由于光柵分光其色散是線性的，所以只用一種狹縫寬度對(duì)各種波長(zhǎng)的光的測(cè)量，其分辨率都相同，即寬度對(duì)各種波長(zhǎng)的光的測(cè)量，其分辨率都相同，即狹縫寬度不必經(jīng)常調(diào)節(jié)。只要光強(qiáng)能達(dá)到要求，應(yīng)狹縫寬度不必經(jīng)常調(diào)節(jié)。只要光強(qiáng)能達(dá)到要求，應(yīng)使用盡可能小的狹縫寬度，以提高分辨率。使用盡可能小的狹縫寬度，以提高分辨率。 樣品室樣品室o 包括池架、吸收池（即比色杯）以及各種可更換的包括池架、吸收池（即比

20、色杯）以及各種可更換的附件。池架有普通池架和恒溫池架，恒溫池架有水附件。池架有普通池架和恒溫池架，恒溫池架有水恒溫池架和電恒溫池架。水恒溫池架需用循環(huán)水恒恒溫池架和電恒溫池架。水恒溫池架需用循環(huán)水恒溫裝置打入循環(huán)水保持池架恒溫，控溫精度為溫裝置打入循環(huán)水保持池架恒溫，控溫精度為 0.1，電恒溫池架十分昂貴，控溫精度可達(dá)，電恒溫池架十分昂貴，控溫精度可達(dá) 0.05。o 吸收池有光學(xué)玻璃杯和石英玻璃杯兩種。光學(xué)玻璃吸收池有光學(xué)玻璃杯和石英玻璃杯兩種。光學(xué)玻璃杯因?yàn)槠胀ü鈱W(xué)玻璃吸收紫外光，因此只能用于可杯因?yàn)槠胀ü鈱W(xué)玻璃吸收紫外光，因此只能用于可見光，適用波長(zhǎng)范圍是見光，適用波長(zhǎng)范圍是400nm20

21、00nm。石。石英玻璃杯可透過(guò)紫外光、可見光和紅外光，英玻璃杯可透過(guò)紫外光、可見光和紅外光， 是最是最常使用的吸收池，使用波長(zhǎng)范圍是常使用的吸收池，使用波長(zhǎng)范圍是180nm3000nm。 吸收池使用注意事項(xiàng)吸收池使用注意事項(xiàng)o 要徹底清洗，尤其是盛過(guò)蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層要徹底清洗，尤其是盛過(guò)蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時(shí)可放在膜，不易洗去，通常杯子不用時(shí)可放在 1洗潔凈液中洗潔凈液中浸泡，去污效果好，使用時(shí)用水沖洗干凈，要求杯壁不浸泡，去污效果好，使用時(shí)用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可用綢布絲線或軟塑料制作小刷子清洗。掛水珠，還可用綢布絲線或軟塑料制作小刷子清

22、洗。o 嚴(yán)禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴(yán)禁用硬紙嚴(yán)禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴(yán)禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。o 嚴(yán)禁加熱烘烤。急用干的杯子時(shí)，可用酒精蕩洗后用冷嚴(yán)禁加熱烘烤。急用干的杯子時(shí)，可用酒精蕩洗后用冷風(fēng)吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。風(fēng)吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。o 吸收池的校正：要固定參比杯和樣品杯，可在杯的毛玻吸收池的校正：要固定參比杯和樣品杯，可在杯的毛玻璃面上寫上記號(hào)。用盛有參比液的參比杯和樣品杯測(cè)定璃面上寫上記號(hào)。用盛有參比液的參比杯和樣品杯測(cè)定吸光度吸光度“A0”，樣品杯換上樣品液后測(cè)定的吸光度為，

23、樣品杯換上樣品液后測(cè)定的吸光度為“A1”，則校正后的實(shí)際吸光度，則校正后的實(shí)際吸光度A為：為：o A= A1A0 檢測(cè)器檢測(cè)器o 檢測(cè)器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，即把光強(qiáng)度以電訊號(hào)顯示出來(lái)，常用的檢測(cè)器有光電管，光電倍增管和光電二極管等三種。o 光電二極管：原理是硅二極管受紫外近紅外輻射照射時(shí)，其導(dǎo)電性增強(qiáng)的大小與光強(qiáng)成正比。近年來(lái)分光光度計(jì)使用光電二極管作檢測(cè)器在增加，雖然其靈敏度還趕不上光電倍增管，但它的穩(wěn)定性更好，使用壽命更長(zhǎng)，價(jià)格便宜，因而許多著名品牌的高檔分光光度計(jì)都在使用它作檢測(cè)器。尤其值得注意的是由于計(jì)算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展，使用光電二極管的二極管陣列分光光度計(jì)有了很大發(fā)展，二極管數(shù)目已達(dá)

24、1024個(gè)，明顯提高了分辨率。o 這種新型分光光度計(jì)的特點(diǎn)是“后分光”，即氘燈發(fā)射的光經(jīng)透鏡聚焦后穿過(guò)樣品吸收池，經(jīng)全息光柵色散后被二極管陣列的各個(gè)二極管接收，信號(hào)由計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理和存儲(chǔ)，因而掃描速度極快，約10ms就可完成全波段掃描，繪出吸光度、波長(zhǎng)和時(shí)間的三維立體色譜圖，可以最方便快速地得到任一波長(zhǎng)的吸收數(shù)據(jù)，它最適宜用于動(dòng)力學(xué)測(cè)定，也是高效液相色譜儀最理想的檢測(cè)器。 顯示輸出裝置顯示輸出裝置低檔分光光度計(jì)現(xiàn)在已都使用數(shù)字顯示，有的低檔分光光度計(jì)現(xiàn)在已都使用數(shù)字顯示，有的還連有打印機(jī)。現(xiàn)代高性能分光光度計(jì)均可還連有打印機(jī)?，F(xiàn)代高性能分光光度計(jì)均可以連接微機(jī)，而且有的主機(jī)還使用帶液晶或以連接

25、微機(jī)，而且有的主機(jī)還使用帶液晶或CRT熒屏顯示的微處理機(jī)和打印繪圖機(jī)。熒屏顯示的微處理機(jī)和打印繪圖機(jī)。有的還帶有標(biāo)準(zhǔn)軟驅(qū)，存取數(shù)據(jù)更加方便（例有的還帶有標(biāo)準(zhǔn)軟驅(qū)，存取數(shù)據(jù)更加方便（例如如SPECORD 200）。）。分光光度計(jì)光路原理圖光源切換鏡石英鹵素?zé)綦疅魹V色盤場(chǎng)鏡入口球面反光鏡基準(zhǔn)轉(zhuǎn)換鏡旋轉(zhuǎn)鏡電機(jī)螺環(huán)鏡樣品室凹形全息光柵出口分光光度法在生化實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用o 分光光度計(jì)除用于常規(guī)的吸光度測(cè)定和吸收分光光度計(jì)除用于常規(guī)的吸光度測(cè)定和吸收光譜的掃描外，常用的分光光度法還有導(dǎo)數(shù)光譜的掃描外，常用的分光光度法還有導(dǎo)數(shù)分光光度法、催化動(dòng)力學(xué)分光光度法和差示分光光度法、催化動(dòng)力學(xué)分光光度法和差示分光光度

26、法等。分光光度法等。o 在生化實(shí)驗(yàn)中主要用于氨基酸含量的測(cè)定、在生化實(shí)驗(yàn)中主要用于氨基酸含量的測(cè)定、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定、核酸的測(cè)定、酶活力測(cè)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定、核酸的測(cè)定、酶活力測(cè)定、生物大分子的鑒定和酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)定、生物大分子的鑒定和酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究等。的研究等。o 相對(duì)濃度、分子構(gòu)象、反應(yīng)過(guò)程記錄等等。相對(duì)濃度、分子構(gòu)象、反應(yīng)過(guò)程記錄等等。NAD 和和 NADH吸收光譜的對(duì)比吸收光譜的對(duì)比三、三、Helios儀器特點(diǎn)儀器特點(diǎn)o 采用全息母光柵（不是復(fù)制光柵），采用全息母光柵（不是復(fù)制光柵）， 可獲得優(yōu)異可獲得優(yōu)異的光學(xué)性能和耐久性，即使在高吸光度的光學(xué)性能和耐久性，即使在高吸光度3A

27、下也能下也能保持線性。保持線性。o 采用步進(jìn)馬達(dá)單色器，配合采用步進(jìn)馬達(dá)單色器，配合Hatten Modulator 調(diào)制器，使得無(wú)論是高速掃描還是低速掃描，其掃調(diào)制器，使得無(wú)論是高速掃描還是低速掃描，其掃描曲線完全重合（沒(méi)有峰值）。描曲線完全重合（沒(méi)有峰值）。o 真正的雙光束，光束能量比為樣品真正的雙光束，光束能量比為樣品/參比參比=80/20，可獲得良好的信噪比?？色@得良好的信噪比。o 標(biāo)準(zhǔn)軟盤，存取方便，方便計(jì)算機(jī)的應(yīng)用。標(biāo)準(zhǔn)軟盤，存取方便，方便計(jì)算機(jī)的應(yīng)用。主機(jī)功能o SCAN：測(cè)定吸收值和吸收峰o FIXED：在一固定波長(zhǎng)下的吸收值o QUANT：濃度測(cè)定（以一標(biāo)準(zhǔn)作參照）o RATE：一定時(shí)間范圍內(nèi)吸收值的變化曲線。o 存盤配件功能配件功能n 連續(xù)進(jìn)樣分析：加流動(dòng)池配件連續(xù)進(jìn)樣分析：加流動(dòng)池配件（SUPPERSIPPER）n 打?。号浯蛴C(jī)打?。号浯蛴C(jī)n 計(jì)算機(jī)控制：配計(jì)算機(jī)計(jì)算機(jī)控制：配計(jì)算機(jī)n 核酸解鏈分析：配核酸解鏈配件（水浴核酸解鏈分析：配核酸解鏈配件（水浴+溫控）溫控）n 酶動(dòng)力學(xué)：溫控裝置。酶動(dòng)力學(xué)：溫控裝置。操作步驟o開機(jī)預(yù)熱：電源在機(jī)器后面。開機(jī)預(yù)熱：電源在機(jī)器后面。o在在HOME 主頁(yè)上選擇功能，用箭頭（機(jī)子右下角）主頁(yè)上選擇功能，用箭頭（機(jī)子右下角）選擇，確定后按選擇，確定后按ENTER，再進(jìn)一步用箭頭，