分子信標技術(shù)

1、分子信標技術(shù)分子信標技術(shù)o 分子信標簡介分子信標簡介o 分子信標的結(jié)構(gòu)分子信標的結(jié)構(gòu)o 分子信標的工作原理分子信標的工作原理o 分子信標的應(yīng)用分子信標的應(yīng)用o 前景與展望前景與展望分子信標簡介分子信標簡介u TyagiTyagi和和KrammerKrammer于于19961996年首次建立，目的是在液年首次建立，目的是在液相中定量測定靶標序列。相中定量測定靶標序列。o 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRETFRET）設(shè)計的一種新型）設(shè)計的一種新型熒光標記核酸探針；熒光標記核酸探針；o 特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)使得其具有背景信號低、靈敏度特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)使得其具有背景信號低、靈敏度高、特異性識

2、別性強的特點；高、特異性識別性強的特點；o 廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物技術(shù)、廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物技術(shù)、生化分析，生化分析，生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷 。分子信標的結(jié)構(gòu)分子信標的結(jié)構(gòu)經(jīng)典分子信標結(jié)構(gòu)包括：經(jīng)典分子信標結(jié)構(gòu)包括：1 1、環(huán)狀區(qū)環(huán)狀區(qū)（長度（長度15153030個堿基的序列，個堿基的序列，能與目標分子特異結(jié)合）；能與目標分子特異結(jié)合）；2 2、信標莖桿區(qū)信標莖桿區(qū)（長度為（長度為5 58 8個堿基的互個堿基的互補序列，使得形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)）；補序列，使得形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)）；3 3、5 5端熒光基團端熒光基團（徳克薩斯紅、熒光素（徳克薩斯紅、熒光素等染料）；等染料）；4

3、 4、3 3端猝滅基團端猝滅基團（DABCYL DABCYL ）。）。首例分子信標結(jié)構(gòu)示意圖首例分子信標結(jié)構(gòu)示意圖環(huán)狀區(qū)環(huán)狀區(qū)莖桿區(qū)莖桿區(qū)熒光基團熒光基團猝滅基團猝滅基團分子信標工作原理分子信標工作原理 無靶標存在下，莖環(huán)結(jié)構(gòu)使得熒光基團和猝滅基團相互靠近，發(fā)無靶標存在下，莖環(huán)結(jié)構(gòu)使得熒光基團和猝滅基團相互靠近，發(fā)生生FRETFRET，熒光猝滅，熒光背景極低。，熒光猝滅，熒光背景極低。 加入靶序列后，分子信標與完全互補靶序列形成剛性并且更加穩(wěn)加入靶序列后，分子信標與完全互補靶序列形成剛性并且更加穩(wěn)定的雙鏈雜交體，使得熒光基團和猝滅基團距離增大，阻止了定的雙鏈雜交體，使得熒光基團和猝滅基團距離增

4、大，阻止了FRETFRET的的發(fā)生，熒光恢復(fù)。發(fā)生，熒光恢復(fù)。影響分子信標的因素影響分子信標的因素熒光熒光猝滅基團間的距離的影響：猝滅基團間的距離的影響： 環(huán)境環(huán)境pHpH值的影響：值的影響：pHpH過高時，莖干區(qū)堿基對之過高時，莖干區(qū)堿基對之間的穩(wěn)定結(jié)合被破壞，分子信標變性，熒光基間的穩(wěn)定結(jié)合被破壞，分子信標變性，熒光基團與猝滅基團分開產(chǎn)生熒光。團與猝滅基團分開產(chǎn)生熒光。 E E：FRETFRET效率效率R R：熒光給體與受體之間的距離：熒光給體與受體之間的距離影響分子信標的因素影響分子信標的因素1 1、序列長度（環(huán)狀序列比莖桿序列長兩倍以上，、序列長度（環(huán)狀序列比莖桿序列長兩倍以上，莖桿序

5、列不能過長或過短）莖桿序列不能過長或過短）2 2、莖桿序列中、莖桿序列中G G和和C C的含量不能太高的含量不能太高3 3、5 5- -端的第一個堿基最好不要選擇端的第一個堿基最好不要選擇G G4 4、由于被測對象、由于被測對象DNADNA或或RNARNA是大分子，存在扭曲現(xiàn)是大分子，存在扭曲現(xiàn)象，因此要選擇被測對象的外圍堿基序列，即容象，因此要選擇被測對象的外圍堿基序列，即容易接近的那段序列來設(shè)計信標。易接近的那段序列來設(shè)計信標。分子信標設(shè)計原理分子信標設(shè)計原理 熒光猝滅依賴的是能量共振轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移的效率與熒熒光猝滅依賴的是能量共振轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移的效率與熒光基團發(fā)射光譜同猝滅基團激發(fā)光譜的完全

6、重疊有關(guān)。為光基團發(fā)射光譜同猝滅基團激發(fā)光譜的完全重疊有關(guān)。為了熒光能有效猝滅，熒光基團的發(fā)射光譜應(yīng)完全覆蓋猝滅了熒光能有效猝滅，熒光基團的發(fā)射光譜應(yīng)完全覆蓋猝滅基團激發(fā)光譜。符合此要求且較常用的熒光劑基團激發(fā)光譜。符合此要求且較常用的熒光劑- -淬滅劑有：淬滅劑有：1 1、EDANSEDANS（5- (2-5- (2-氨乙基氨基奈氨乙基氨基奈-1-1-磺酸磺酸) )和和DABCYLDABCYL（4-(4-4-(4-二甲基氨基疊氮苯二甲基氨基疊氮苯) )；2 2、苯甲酸、苯甲酸6-6-熒光素和熒光素和DABCYLDABCYL ；3 3、熒光素和羅丹明、熒光素和芘丁酸、熒光素和羅丹明、熒光素和芘

7、丁酸 、香豆素和乙錠、香豆素和乙錠 熒光素和伊紅熒光素和伊紅 、一些鋱螯合物和四甲羅丹明等。、一些鋱螯合物和四甲羅丹明等。 分子信標技術(shù)常用的熒光劑分子信標技術(shù)常用的熒光劑- -淬滅劑淬滅劑波長轉(zhuǎn)移分子信標波長轉(zhuǎn)移分子信標優(yōu)點：優(yōu)點： 如果對不同分子信標探針修飾以具有不同特征發(fā)射如果對不同分子信標探針修飾以具有不同特征發(fā)射波長的熒光發(fā)射基團，就可在同一激發(fā)光下，通過檢測這波長的熒光發(fā)射基團，就可在同一激發(fā)光下，通過檢測這些特征波長的熒光強度，些特征波長的熒光強度， 實現(xiàn)在同一體系中的多基因分析。實現(xiàn)在同一體系中的多基因分析。波長轉(zhuǎn)移分子信標波長轉(zhuǎn)移分子信標表面固定分子信標表面固定分子信標量子點

8、分子信標量子點分子信標分子信標的應(yīng)用分子信標的應(yīng)用 核酸的檢測分析核酸的檢測分析 實時定量實時定量PCRPCR測定靶標濃度測定靶標濃度 活體內(nèi)核酸的動態(tài)檢測活體內(nèi)核酸的動態(tài)檢測 同時檢測多個靶核苷酸同時檢測多個靶核苷酸 檢測雙鏈檢測雙鏈DNADNA分子信標的應(yīng)用分子信標的應(yīng)用 研究研究DNADNA蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用 用于核酸酶的研究用于核酸酶的研究 用于研究用于研究DNADNA蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用 用作生物芯片和生物傳感器用作生物芯片和生物傳感器應(yīng)用應(yīng)用1 1、實時定量、實時定量PCRPCR測定靶標濃度測定靶標濃度將分子信標簡單地密封在將分子信標簡單地密封在PCR P

9、CR 管中，在每個循環(huán)的退火階段分子信標與管中，在每個循環(huán)的退火階段分子信標與擴增產(chǎn)物結(jié)合產(chǎn)生熒光，未結(jié)合的分子信標不發(fā)熒光，這樣熒光信號隨擴增產(chǎn)物結(jié)合產(chǎn)生熒光，未結(jié)合的分子信標不發(fā)熒光，這樣熒光信號隨著反應(yīng)循環(huán)的增加而增強，從而反映出著反應(yīng)循環(huán)的增加而增強，從而反映出PCR PCR 過程中擴增產(chǎn)物濃度的增加。過程中擴增產(chǎn)物濃度的增加。由于加有分子信標的由于加有分子信標的PCR PCR 管在整個反應(yīng)中是密封的，因此可避免傳統(tǒng)管在整個反應(yīng)中是密封的，因此可避免傳統(tǒng)PCRPCR后擴增產(chǎn)物凝膠電泳過程帶來的污染，簡化檢測手段，檢測靈敏度高。后擴增產(chǎn)物凝膠電泳過程帶來的污染，簡化檢測手段，檢測靈敏度高

10、。應(yīng)用應(yīng)用2 2、活體內(nèi)核酸的動態(tài)檢測、活體內(nèi)核酸的動態(tài)檢測Perlette Perlette 利用微注射法在袋鼠腎細胞質(zhì)中引入分子信標，對單個活細胞中利用微注射法在袋鼠腎細胞質(zhì)中引入分子信標，對單個活細胞中的的RNA RNA 進行了檢測，并利用進行了檢測，并利用ICCD ICCD 成像系統(tǒng)得到了一系列反應(yīng)分子信標與成像系統(tǒng)得到了一系列反應(yīng)分子信標與RNA RNA 結(jié)合的熒光圖像。結(jié)果表明，利用分子信標可以有效地實時檢測活細胞中的結(jié)合的熒光圖像。結(jié)果表明，利用分子信標可以有效地實時檢測活細胞中的RNA RNA 及研究及研究RNA/ DNA RNA/ DNA 的雜交過程。的雜交過程。分子信標的應(yīng)

11、用分子信標的應(yīng)用-雙鏈雙鏈DNADNA檢測檢測Human osteosarcoma cell nucleus (U2OS cell line) vitally injected with a Cy3-labelled probe specific for chromosomal telomeric repeat sequenes. Note that some spots are relatively large suggesting association or clustering of multiple telomeres.分子信標的應(yīng)用分子信標的應(yīng)用WhitcombeWhitcombe

12、設(shè)計的一種將設(shè)計的一種將引物與分子信標相結(jié)引物與分子信標相結(jié)合的蝎狀引物熒光探針。合的蝎狀引物熒光探針。在該探針中在該探針中, ,引物與引物與分子信標之間有一間隔臂分子信標之間有一間隔臂, ,使反應(yīng)不能往分子使反應(yīng)不能往分子信標方向延伸。在信標方向延伸。在過程中過程中, ,非特異擴增產(chǎn)物不非特異擴增產(chǎn)物不會產(chǎn)生熒光信號會產(chǎn)生熒光信號, ,而當特異而當特異性擴增產(chǎn)物生成時性擴增產(chǎn)物生成時, ,分子信分子信標將立即與其進行分子內(nèi)標將立即與其進行分子內(nèi)雜交雜交, ,同時發(fā)出熒光信號。同時發(fā)出熒光信號。分子信標的應(yīng)用分子信標的應(yīng)用應(yīng)用應(yīng)用3 3、同時檢測多個靶核苷酸、同時檢測多個靶核苷酸 通過選擇不同

13、的熒光分子通過選擇不同的熒光分子- -猝滅分子對，可以猝滅分子對，可以設(shè)計出不同熒光的多個分子信標設(shè)計出不同熒光的多個分子信標( (又稱多色分子標又稱多色分子標) )，每個分子信標與其各自的靶標序列雜交后，每個分子信標與其各自的靶標序列雜交后， 熒光熒光檢測系統(tǒng)可以檢測到不同顏色的熒光，檢測系統(tǒng)可以檢測到不同顏色的熒光， 這樣多色這樣多色分子信標可對多個靶核苷酸同時定量測定。另外，分子信標可對多個靶核苷酸同時定量測定。另外，波長轉(zhuǎn)移分子信標同樣可以用于核酸的多組分同時波長轉(zhuǎn)移分子信標同樣可以用于核酸的多組分同時定量測定。定量測定。應(yīng)用應(yīng)用4 4、用于核酸酶的研究、用于核酸酶的研究應(yīng)用應(yīng)用4 4

14、、用于核酸酶的研究、用于核酸酶的研究應(yīng)用應(yīng)用5 5、用于研究、用于研究DNA-DNA-蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用 DNA DNA 和蛋白質(zhì)的相互作用的研究是目前分子生物學(xué)和和蛋白質(zhì)的相互作用的研究是目前分子生物學(xué)和生物技術(shù)研究中非常重要并迅速發(fā)展的領(lǐng)域。將分子信標生物技術(shù)研究中非常重要并迅速發(fā)展的領(lǐng)域。將分子信標用于用于DNA -DNA -蛋白質(zhì)相互作用的研究，蛋白質(zhì)相互作用的研究， 發(fā)揮了其簡單、靈敏發(fā)揮了其簡單、靈敏等特點，等特點， 又實現(xiàn)了對體系的實時監(jiān)測，又實現(xiàn)了對體系的實時監(jiān)測， 甚至可以用于活甚至可以用于活體細胞的動態(tài)研究。體細胞的動態(tài)研究。 Fang Fang 等以等以SS

15、BSSB、組蛋白、牛血清蛋白為對象研究了、組蛋白、牛血清蛋白為對象研究了3 3 者對分子信標的不同影響。結(jié)果表明，分子信標能夠很好者對分子信標的不同影響。結(jié)果表明，分子信標能夠很好地區(qū)分這地區(qū)分這3 3 種類型的種類型的DNA DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白; ;分子信標與分子信標與SSB SSB 具有具有很高的親和力，其結(jié)合引起的熒光上升與完全互補的靶相很高的親和力，其結(jié)合引起的熒光上升與完全互補的靶相近。并且他們進一步研究了近。并且他們進一步研究了SSB SSB 與分子信標的結(jié)合動力學(xué)，與分子信標的結(jié)合動力學(xué)，得出其結(jié)合常數(shù)與已經(jīng)報道的結(jié)合常數(shù)相符。得出其結(jié)合常數(shù)與已經(jīng)報道的結(jié)合常數(shù)相符。Wor

16、king mechanism of the fluorophorequencher-labeled MAB. The MAB exists at equilibrium between a nonstructured random coil and a compact intramolecular quadruplex. Addition of thrombin (gray ellipse) shifts the equilibriumin favor of the quadruplex structure, which draws the fluorophore (F) and quencher (Q) closer, leading to fluorescence quenching. The working mechanism of the donoracceptor-labeled MAB is similar to the quench-type MAB. The arrows of the backbone of the oligonucleotidesindicate the 53 polarity of DNA.分子信標的應(yīng)用分