實驗室常用分子生物學(xué)合集--精華版

1、一 細菌相關(guān)實驗技術(shù)1. 細菌分離鑒定1.1沙門氏菌分離鑒定1.1.1 食品樣前增菌取檢樣25g，加入225mL緩沖蛋白胨水于均質(zhì)杯內(nèi)。用均質(zhì)器以8000-10000r/min打碎1min，于36±1培養(yǎng)4h(干蛋品培養(yǎng)1824h)，取 10mL于100mL亞硒酸鹽骯氨酸（SC）增菌液內(nèi)，于36±1培養(yǎng)1824h。1.1.2 食品樣細菌分離取增菌液1環(huán)，劃線接種于DHL瓊脂平板，于36±1分別培養(yǎng)1824h(DHL)或4048h(BS)，觀察平板上生長的菌落，沙門氏菌、和沙門氏菌在各個平板上的菌落特征見表1。非食品樣直接取棉拭子在DHL瓊脂平板上劃線即可。表1沙門

2、氏菌屬各群在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌、沙門氏菌（即亞利桑那菌）DHL瓊脂無色半透明；產(chǎn)硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與沙門氏菌、相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心帶黑色a) 生化試驗: 自選擇性瓊脂平板上直接挑取數(shù)個可疑菌落，分別接種三糖鐵瓊脂。在三糖鐵瓊脂內(nèi)，腸桿菌科常見屬種的反應(yīng)結(jié)果見表2。表2腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果斜面底層產(chǎn)氣硫化氫可能的菌屬和種-+/-+沙門氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌、變形桿菌屬、緩慢愛德華氏菌+/-+沙門氏菌、弗勞地氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌-+-沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌、普

3、羅菲登斯菌屬-+-傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌、普羅菲登斯菌屬+/-大腸埃希氏菌、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌說明：在三糖鐵瓊脂內(nèi)只有斜面產(chǎn)酸并同時硫化氫(H2S)陰性的菌株可以排除，其他的反應(yīng)結(jié)果均有沙門氏菌的可能，同時也均有不是沙門氏菌的可能。在接種三糖鐵瓊脂的同時，再接種堿性蛋白胨水(供做靛基質(zhì)試驗)、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基和賴氨酸脫竣酶試驗培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基各1管，于36±1培養(yǎng)1824h，必要時可延長至48h，按表3判定結(jié)果。按反應(yīng)序號分類，沙門氏菌屬的結(jié)果應(yīng)屬于A1、A2和B

4、1，其他5種反應(yīng)結(jié)果均可以排除。表3腸桿菌科各屬生化反應(yīng)初步鑒別表-1反應(yīng)序號硫化氫靛基質(zhì)尿素氰化鉀賴氨酸判定菌屬A1+-+沙門氏菌屬A2+-+沙門氏菌屬（少見）緩慢愛德華氏菌A3+-+-弗勞地氏檸檬酸桿菌、奇異變形桿菌A4+-普通變形桿菌B1-+-沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、甲型傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、志賀氏菌屬B2-+-+-大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬B3-+/-+-克雷伯氏菌族各屬陰溝腸桿菌、弗勞地氏檸檬酸桿菌B4-+/-+-摩根氏菌、普羅菲登斯菌屬反應(yīng)序號A1：典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸3項中有1項異常，按表4可判定為沙門氏菌。如有2項異常，則按A3判定為弗勞地氏檸檬

5、酸桿菌。表4腸桿菌科各屬生化反應(yīng)初步鑒別表-2尿素氰化鉀賴氨酸判定結(jié)果-+-+-+甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）沙門氏菌或（要求符合本群生化特性）沙門氏菌個別變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）反應(yīng)序號A2：補做甘露醇和山梨醇試驗，按表5判定結(jié)果。表5腸桿菌科各屬生化反應(yīng)初步鑒別表-3甘露醇山梨醇判定結(jié)果+-+-沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）緩慢愛德華氏菌反應(yīng)序號B1：補做ONPG。ONPG（+）為大腸埃希氏菌，ONPG（-）為沙門氏菌。同時，沙門氏菌應(yīng)為賴氨酸（+），但甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸（-）。1.1.3 沙門氏菌PCR方法鑒定a) 煮沸法提取基因組DNA模板b) 引物

6、設(shè)計fliC-1: 5-GGCTATTATGAAGTTTCCGTTG-3fliC-2: 5-GGGCAGAAGTCAGGTTGTTTAC-3sefA-1: 5-AATTGTGCGAATGCTAATAGTTG-3sefA-2: 5-TGATACTGCTGAACGTAGAAGGTC-3c) 反應(yīng)體系：單重和二重PCR體系的總體積均為30mL，其中包括：1×PCR反應(yīng)緩沖液，dNTP 0.2mmol/L，引物各25 pmol/L，1.5U Taq plus聚合酶，3uL DNA模板。d) 擴增條件：優(yōu)化后的PCR反應(yīng)程序為 94預(yù)變性5min，然后進入循環(huán)程序：94變性30s，56退火30

7、s，72延伸50s，30個循環(huán)； 72繼續(xù)延伸5min。e) 結(jié)果擴增出了622bpfliC基因片段的為鼠傷寒沙門氏菌，擴增出534bp sefA基因片段的為腸炎沙門氏菌。1.2 豬鏈球菌的分離鑒定PCR方法培養(yǎng)基：1）TSB（Tryptone Soya Broth）選擇性平板：4%綿羊血、3%TSB、1.5%瓊脂粉及以上三種工作濃度試劑；2）BHI培養(yǎng)基：3%BHI、3%新生牛血清；3）BHI保存液：3%BHI、3%新生牛血清、15%甘油；1.2.1 操作步驟：a) 喉部棉拭采樣；b) 接種血平板（只接種一個區(qū)域，轉(zhuǎn)動棉拭）；c) 一次性接種環(huán)劃線（2-3個區(qū)域，以期獲得分散性較好的菌落）；

8、d) 37培養(yǎng)18-24小時；e) 牙簽挑選疑似菌落（溶血、針尖狀灰白色菌落）接種于BHI血清培養(yǎng)基，37培養(yǎng)18-24小時；f) 煮沸法取1ML菌液提DNA模板，其余菌液4保存；g) 雙重PCR擴增目的基因： 引物：gdh-1： GCTGCGTATTCTGTCAAACG gdh-2： CGATGGACAGATAAAGATGG cps2j-1： TGAGTCCTTATACACCTGTT cps2j-2： AGAAAATTCATATTGTCCACC反應(yīng)體系與條件：template 3µlddH2O 17µl2.5MdNTP 0.6µl10PCRbuffer 3.0&

9、#181;l25uM gdh primers 1.2µl25uM cps2j primers 2.4µlTap-plus 0.8µl總體積 30µlPCR擴增條件：94 5min，94 1min、50 40s、72 50s進行30循環(huán)后，72延伸10min；PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像結(jié)果中，兩條帶的為豬鏈球菌2型，一條帶的為豬鏈球菌，無條帶為非豬鏈球菌；h) 從豬鏈球菌2型和非2型PCR陽性管重新劃線接種于血平板37培養(yǎng)18-24小時，同時接種PCR陽性菌液-80甘油保存，以避免污染風(fēng)險；g) 鏡檢觀察豬鏈球菌2型疑似菌落形態(tài)特征是否單一；k

10、) 生化鑒定復(fù)核；l) 豬鏈球菌2型和非2型豬鏈球菌PCR陽性的菌株4保存管重新接種血清BHI，培養(yǎng)至對生長期后離下細菌，以 BHI保存液重懸，置-80保存。1.3副溶血弧菌分離鑒定PCR方法1.3.1 操作步驟a) 以無菌操作取25g或25mL樣品，液體搖勻或固體置于滅菌均質(zhì)袋經(jīng)攪拌均質(zhì)器攪拌均勻后加至225mL堿性蛋白胨中，置于37增菌培養(yǎng)8-12h，b) 用接種環(huán)取少許培養(yǎng)液到TCBS選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)8-10h，c) 挑取綠色菌落，純化培養(yǎng)d) 提取DNA模板：取37培養(yǎng)過夜的副溶血弧菌菌液1.5mL加入Eppendorf管中，12000rpm離心1min，棄上清；用滅菌ddH2O懸浮

11、細胞，12000rpm離心1min，棄去上清；加入2×TZ和ddH2O各40µl，充分混勻；-20放置45min;沸水浴10min后冰浴10min； 12000rpm離心1min，收集上清液即為模板DNA。e) 引物設(shè)計合成： gyrB-a： CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGT gyrB-b： TCCGCTTCGCGCTCATCAATA tlh-a： AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG tlh-b： GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGCf) PCR反應(yīng)體系PCR擴增均在30µL反應(yīng)體系中進行，每種物質(zhì)的濃度及加樣量如下：10

12、15;PCR buffer 3µl10mM dNTP 0.5µltlh-F(50µmol/L ) 0.5µltlh-R(50µmol/L) 0.5µlgyrB-F(50µmol/L ) 0.5µlgyrB-R(50µmol/L ) 0.5µltemplate 3.3µl2U/µl Taq Plus DNA聚合酶 0.7µlddH2O 20.5µlg) 擴增條件：94 3min；94 1min，58 1min，72 1min，30個循環(huán)；72 5min。擴增

13、產(chǎn)物用含0.5g/mL Goldview染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照記錄結(jié)果。k) 結(jié)果：在285bp及450bp處均有特異條帶的為副溶血弧菌。1.4 單增李斯特菌的分離鑒定PCR方法 培養(yǎng)基：1）EB1:TSB加萘啶酮酸 (18mg/l), 丫啶黃 (10.8mg/l) 2)EB2 TSB加萘啶酮酸 (16mg/l), 丫啶黃 (20mg/l) 3)李斯特菌選擇性培養(yǎng)基 購自科瑪嘉公司1.4.1 操作步驟a) 以無菌操作取25g或25mL樣品，液體搖勻或固體置于滅菌均質(zhì)袋經(jīng)攪拌均質(zhì)器攪拌均勻后加至225mLEB1增菌液中，置于37預(yù)增菌培養(yǎng)4h；b) 將樣品轉(zhuǎn)種至EB2

14、增菌液中, 37增菌培養(yǎng)18-24h；c) 用接種環(huán)取少許培養(yǎng)液到李斯特菌選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)18-24h；d) 挑取藍色菌落，純化培養(yǎng)；e) 煮沸法提取基因組DNA模板；f) PCR檢測 PCR擴增均在30µl反應(yīng)體系中進行，每種物質(zhì)的濃度及加樣量如下：10×PCRbuffer 3µl10mM dNTP 0.5µlLisA(50µmol/L ) 1µlMonoA(50µmol/L) 0.8µlLisB (50µmol/L ) 1µlHA-1(50µmol/L ) 0.6µlH

15、A-2 (50µmol/L ) 0.6µltemplate 3µl2U/µl Taq Plus DNA聚合酶 0.6µlddH2O 18.9µlg) 擴增條件：94 3min；94 1min，62 30sce，72 1min，30個循環(huán)；72 8min。擴增產(chǎn)物用含0.5g/mL Goldview染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照記錄結(jié)果。h) 結(jié)果：在720bp及400bp處均有特異條帶為單增李斯特菌。2. 細菌凍存2.1甘油冷凍保藏法: 本法適合于中、長期菌種保藏，保藏時間一般為2-4年左右。a) 挑取單菌落，接種

16、于裝5mL的15mL離心管中37振蕩培養(yǎng)8-12小時，至菌密度OD600為0.8-1.2。b) 按60%甘油：菌液為1：2（V/V）的量加入甘油和菌液分裝至事先滅菌的菌種保存管（1-2mL/管），混合后，-80保存。甘油量無須精確，終濃度達到15%-30%即可。3藥物敏感性試驗 原理：各種病原菌對抗生素藥物的敏感性不同，同種細菌的不同菌株對同一藥物的敏感性也有差異，檢測細菌對抗菌藥物的敏感性，可篩選最有效藥物，用于臨床治療，對控制細菌傳染病的流行至關(guān)重要。 材料： 試管、各種細菌、鑷子、標簽、藥敏片，棉試子、各種抗生素3.1檢測菌和標準菌的準備按細菌菌量計算標準準備接種菌量。生長后的菌液用MH

17、肉湯矯正濃度至0.5麥氏比濁標準，再用MH肉湯稀釋10倍（含菌量大約107CFU/mL），對生長條件要求較高的細菌,如鏈球菌屬和腸球菌屬等細菌需在MH瓊脂加5%脫纖維羊血或兔血中進行。稀釋后的菌液盡快在15分鐘內(nèi)接種。3.2接種用微量加樣器分別取0.18 mL檢測菌液到第一排的96孔聚苯乙烯U形微孔板中，其他孔中加0.18mL菌液。最終接種菌量約5*105CFU/mL。加樣時加樣器吸頭必須插到管內(nèi)面下加菌并注意避免與管內(nèi)壁接觸。3.3加抗菌藥物在第一排0.18 毫升檢測菌液的孔內(nèi)分別加入20L相應(yīng)抗菌藥物，混勻。3.4 稀釋用微量加樣器自第一排吸取100L液體加入第二排，充分混勻后，再自第二排

18、吸取100L液體加入第三排，混勻。以此類推，直至第8排，最后自第8排中吸取100L液體棄去。3.5 37培養(yǎng)14-18h后記錄結(jié)果無細菌生長的孔所含最低抗菌藥物濃度即為MIC。注：質(zhì)量控制：每批實驗時需根據(jù)檢測菌分別選用：金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希菌ATCC25922，糞腸球菌ATCC29212，和銅綠假單胞菌ATCC27853，等標準菌株在同一試驗條件下進行測定。常用抗菌藥物對這些標準菌株的MIC的預(yù)期取值范圍可參考有關(guān)資料判斷。超過或低于一個稀釋度以上時，應(yīng)檢查出錯的原因以及標準菌株被污染或變異的可能性。二 病毒相關(guān)實驗技術(shù)1.病毒分離1.1 糞便樣品處理取1g糞便加入9m

19、L RPMI1640培養(yǎng)液混勻后，加入500L氯仿，充分混勻后4000rpm離心15min，取上清過濾除菌，-70保存?zhèn)溆谩?.2 病毒分離將處理好的樣品按培養(yǎng)液體積的1/10同步接種剛消化分瓶的F81細胞，置37 5CO2中靜置培養(yǎng)。每隔12h觀察細胞的生長情況。待細胞病變達80以上時刮取細胞并離心收集，培養(yǎng)液重懸后反復(fù)凍融三次，12000rpm離心10min，取上清-70保存作為盲傳或鑒定用的病毒液。2.病毒鑒定2.1 PCR檢測：材料：PCR反應(yīng)所需試劑（見第三章PCR部分）、加樣器、槍頭、PCR儀。2.1.1 DNA提?。翰捎肬NIQ-10柱式病毒DNA小量抽提試劑盒，從病料中提取病毒

20、基因組DNA，具體操作如下：a) 取少量病料放入離心管內(nèi)，加入300L TE緩沖液混勻，12000rpm離心5min，取上清煮沸10 min，隨后冰浴5min；b) 取上清200L至eppendorf管中，依次加入400L DVI Buffer和3L Proteinase K（20mg/mL），混勻，55保溫5min；c) 加入260L無水乙醇，混勻，用1-mLTip頭將樣品全部轉(zhuǎn)移至UNIQ-10柱，柱子放入2mL收集管中，10000rpm室溫離心1min；d) 取下UNIQ-10柱子，倒掉收集管中的廢液，將柱子放回收集管，加入500L Wash Solution，10000rpm室溫離心1

21、min；e) 重復(fù)步驟4）一次；f) 取下UNIQ-10柱子，倒掉收集管中的廢液，將柱子放回收集管，10000rpm室溫離心1min，以除去殘留的Wash Solution；g) 將UNIQ-10柱子放入一新的eppendorf管中，在柱子中央加20L Elution Buffer，室溫放置2min；h) 12000rpm室溫離心1min，eppendorf管中的液體即作為PCR反應(yīng)模板。g) 進行PCR反應(yīng)（具體操作間分子生物版）2.2 HA-HI試驗-血凝(HA)及血凝抑制(HI)試驗 原理：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合形成復(fù)合物，在有電解質(zhì)存在下，復(fù)合物相互聚集形成肉眼可間的凝集小塊或沉淀物，根據(jù)

22、是否產(chǎn)生凝集現(xiàn)象來判定相應(yīng)抗體或抗原。 材料: 孔反應(yīng)板、移液器、滴頭、微型振蕩器、生理鹽水、0.5%雞紅細胞懸液、病毒液、陽性血清。2.2.1豬紅細胞懸液的制備a) 采集健康豬血液置滅菌離心管中，加入2倍體積的生理鹽水，2000rpm離心10min，棄上清，反復(fù)洗滌3次；b) 用0.02M PBS（pH7.0）重懸，制成10紅細胞懸液；c) 緩慢加入等量戊二醛，室溫攪拌醛化2-3h至紅細胞呈褐色；d) 用0.01M PBS（pH7.0）反復(fù)洗滌5次，并配成20紅細胞懸液；f) 加入硫酸汞使棄終濃度為0.1%，置于4保存?zhèn)溆?。g) 醛化后的紅細胞呈咖啡色，形態(tài)完好無自凝現(xiàn)象，在蒸餾水中不溶血。

23、2.2.2血凝（HA）試驗本試驗采用微量法在96孔V形板上進行，起始孔濃度為1：2，然后進行連續(xù)2倍稀釋，最后加入等體積紅細胞懸液，置于4作用1h，待對照孔紅細胞完全沉淀后再讀取結(jié)果，操作方法見表1。判定標準：紅細胞沉于板底呈點狀判為不凝，紅細胞呈松散狀判為凝集，根據(jù)凝集程度的不同可分為：100凝集(#)、75凝集(+)、50凝集(+)、25凝集(+)。其血凝價（凝集單位）以紅細胞100凝集的病毒液的最高稀釋倍數(shù)表示。表1.血凝試驗操作表Table 1 Procedure for hemagglutination test孔號123456789101112病毒液稀釋度2122232425262

24、72829210211空白對照0.02M PBS(mL)0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05病毒液(mL)0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05棄去0.050.5%紅細胞懸液（mL）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.052.2.3 血凝抑制（HI）試驗本實驗采用抗犬細小病毒單克隆抗體作為血凝抑制的抗體，起始孔濃度為1：2，然后進行連續(xù)2倍稀釋，分別加入等體積的病毒液（4個凝集單位）,37作用1h后，最后加入紅細胞懸液，置于4作用

25、1h，待抗體對照孔紅細胞完全沉淀后再讀取結(jié)果，操作方法見表2。判定標準：在抗體對照不發(fā)生凝集，抗原對照完全凝集的前提下進行判定。紅細胞沉于板底呈點狀判為不凝，紅細胞呈松散狀判為凝集，根據(jù)凝集程度的不同可分為：100凝集(#)、75凝集(+)、50凝集(+)、25凝集(+)。其血凝抑制效價以紅細胞凝集完全被抑制的抗體最大稀釋倍數(shù)表示。表2.血凝抑制試驗操作表Table 2 Procedure for hemagglutination inhibition test孔號123456789101112抗體稀釋度212223242526272829210抗原對照抗體對照0.02M PBS(mL)0.0

26、50.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05CPV單抗(mL)0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05棄去0.050.054單位病毒液（mL）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.0537作用1h0.5%紅細胞懸液（mL）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.052.3 間接免疫熒光(IFA)試驗 原理：通過熒光素對抗體或者抗原進行標記，然后用熒光顯微鏡觀察所標記的熒光以分析示蹤相應(yīng)抗原或抗體的方法材料：長滿F

27、81的細胞1瓶、胰酶、吸球、吸管、生長液、96孔細胞培養(yǎng)板、加樣器、槍頭、熒光顯微鏡、病毒液（PRV）2.3.1 操作步驟a) 將F81細胞以105/mL接種24孔板，500L/孔，并按培養(yǎng)液1/10體積同步接種病毒液，同時設(shè)不接毒的細胞孔作為陰性對照；b) 37 5CO2中靜置培養(yǎng)24h后，停止培養(yǎng)，用0.02M PBS洗滌三次；c) -20預(yù)冷80丙酮溶液固定15min；d) PBS洗滌3次，每次5min；e) 抗CPV單抗作為一抗，用含0.5脫脂奶粉的PBS進行100倍稀釋，加入培養(yǎng)孔中（300L/孔），37作用1h；f) PBS洗滌3次，每次5min；g) 每孔加入300L羊抗鼠IgG

28、-FITC（200倍稀釋），37避光作用45min；h) PBS洗滌3次，每次5min；i) 50甘油PBS封底，并置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。2.4 病毒感染力的滴定（TCID50的測定） 材料： 長滿單層的細胞1瓶、胰酶、吸球、吸管、生長液、96孔細胞培養(yǎng)板、加樣器、槍頭病毒液（PRV）2.4.1：測定病毒感染力的方法：半數(shù)致死量LD50( 50% lethal dose)：用動物或雞胚來檢測半數(shù)雞胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用雞胚來檢測半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量TCID50（50% tissue cLture infective dose)：用細胞來檢測蝕

29、斑形成單位（plaque forming unit，PFU）：用細胞來檢測2.4.2：TCID50的操作步驟a) 在每孔加入細胞懸液90µl，使細胞量達到23×105個/mL。b) 在EP管中用MEM將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1-10-5。c) 將稀釋好的病毒接種到24孔培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種8個空，每孔接種10µl。d) 設(shè)正常細胞做陰性對照。e) 3天后做間接免疫熒光。f) 結(jié)果按Reed-Muench法計算。三 分子生物學(xué)、免疫學(xué)及細胞生物學(xué)部分1. PCR技術(shù)1.1 基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引

30、物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：1:模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；2:模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；3:引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下

31、次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。1.2 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件標準的PCR反應(yīng)體系：10×擴增緩沖液 10L4種dNTP混合物 每個濃度 200umol/l引物 每個濃度10-100pmol模板DNA 0.1-2ug Taq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/l加雙或三蒸水至 100L 1.3 PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。 a) 引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序

32、列， 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則： 引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，在特定條件下可擴增長至10kb的片段。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特條 帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不

33、配對而導(dǎo)致PCR失敗。引物中能加上合適的酶切位點，或被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。b) 引物量： 每條引物的濃度0.11umol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。c) 酶及其濃度：目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100L時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。d) dNTP的質(zhì)

34、量與濃度：dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝， -20冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。e) 模板(靶基因)核酸：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與

35、否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。e) Mg2+濃度：Mg2+對PC

36、R擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。1.4 PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。a) 溫度與時間的設(shè)置:基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至40 60，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為10

37、0300bp時)可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。 變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，9394lmin足以使模板DNA變性，若低于93則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。 退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于

38、模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(510)在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異 性結(jié)合， 提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性： 7080 150核苷酸/S/酶分子 70 60核苷酸/S/酶分子 55 24核苷酸/

39、S/酶分子 高于90時， DNA合成幾乎不能進行。 PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。34kb的靶序列需34min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。b) 循環(huán)次數(shù):循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。2. 重組質(zhì)粒載體構(gòu)建載體是攜帶靶DNA片

40、段進入宿主細胞進行擴增好表達的工具。粒是細菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制子，對細菌的某些代謝活動和抗藥性表型具有一定的作用。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工改造拼接而成。質(zhì)粒DNA不但能在細菌中復(fù)制，而且在添加真核復(fù)制信號好啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒。構(gòu)建質(zhì)粒載體及鑒定工作可以分為七步基因組的獲取 目的片段的擴增與純化 目的片段和質(zhì)粒的雙酶切及純化(確保雙酶切的精確性) 目的片段與質(zhì)粒載體的連接 感受態(tài)的制備 轉(zhuǎn)化 重組質(zhì)粒的鑒定 以下將逐步介紹：2.1 基因組DNA的提取方法（提模板）2.1.1 煮沸法將細菌過夜培養(yǎng)物離心，用滅菌雙蒸水洗滌1次200ul，加

41、入40ul等體積滅菌雙蒸水和TZ（4% Triton X-100和5.0 mg/mLNaN3溶于pH 8.0 Tris-HCL）重懸，放置-20 0.5h后，沸水浴處理10min，冰浴10min，6000rpm離心3min，收集上清液用于PCR擴增。2.1.2 蛋白酶K法a) 3mL過夜培養(yǎng)物10000rpm離心1min ；b) 棄上清，用500L Solution I重懸c) 加入60L 50mg/mL溶菌酶（因用量比較小，注意將溶菌酶直接稱量在EP管內(nèi)配制。G-菌可適當(dāng)減少溶菌酶用量），37水浴作用30 min；d) 加入30L 10% SDS和2.5L 20 mg/mL 蛋白酶K，65水

42、浴作用3h（可延長時間，可水浴中過夜）；e) 加入等體積的酚/氯仿異戊醇抽提（1：1，大約各300L），10000rpm離心8min；（此處所指氯仿異戊醇是指氯仿：異戊醇=24：1）f) 取上清，重復(fù)3-4次；g) 小心吸取上清，并加入2倍體積的無水乙醇及1/10體積的NaAc, 室溫沉淀30min；h) 10000rpm離心12min，棄上清；i) 用70%乙醇淋洗沉淀，10000rpm離心8min；j) 37或室溫風(fēng)干沉淀；k) 用20L含10g/mL的TE溶液(pH8.0)溶解DNA，短暫離心，調(diào)終濃度至約200ug/ml備用。2.1.3 試劑盒法 (見說明書)2.2目的DNA的PCR擴

43、增 (見上敘PCR技術(shù))2.3 目的DNA純化 (AXYGEN試劑盒割膠回收)2.4 DNA雙酶切及雙酶切產(chǎn)物純化 2.4.1 50L 雙酶切體系 (以Pst和 Kpn為例 ) 10X M Buffer 5L Pst(10u) 3L Kpn(10u) 3L DNA（PCR純化產(chǎn)物或者質(zhì)粒） 10-18L 4-6ug 補加ddH2O至 50L2.4.2 短暫離心，37反應(yīng)3-5hrs或酶切過夜2.4.3 雙酶切產(chǎn)物純化a) 補加TE溶液至400L；a) 加入等體積的酚/氯仿抽提，12000rpm，4，離心6min；a) 上清加800L無水乙醇及50L 3M NaAc，室溫沉淀20min；a) 1

44、2000rpm，4，離心10min；a) 70%乙醇洗滌沉淀一次，12000rpm，4，離心10min；a) 烘干沉淀，并用一定量的TE溶解；a)取2L電泳，估計濃度，確定下一步連接需要量。2.5 雙片段的連接（用DNA Ligation Kit Ver.2進行）按下面體系依次加入溶液已純化PCR雙酶切產(chǎn)物 A 適量已純化質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物 B 適量 Sol I 5-10 L (等于A+B總體積) 混勻，短暫離心，16連接過夜。2.6 感受態(tài)的制備2.6.1大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備 (CPG法)a) 取-80凍存的E.coli (JM109、DH5、BL21、CP-RP)菌株，在新鮮的LB平板上劃

45、線，37溫箱過夜培養(yǎng)；b) 挑取單菌落，接種于5mL試管，37搖床振蕩過夜培養(yǎng)；c) 將過夜培養(yǎng)的菌液按1:100接種于一定體積的SOB中，37振蕩2-3h至OD600至0.5左右；d) 將細菌移入50mL離心管(預(yù)先4°C冰箱制冷)，冰上放置10-15min；e) 4，4500 rpm離心10min，倒扣離心管，去水滴；f) 加入一定量預(yù)冷的CPG（每管約2mL，輕輕懸?。?，4500 rpm，離心10 min；去上清，以預(yù)冷CPG懸浮（每50mL菌液加1.5-2mL CPG），0.1-0.2mL分裝-80°C冰箱保存;g) 此法可使感受態(tài)細胞保持3個月以上的穩(wěn)定活性。另

46、，分裝后在4°C靜置6-12h，可提高感受效率3-5倍。2.6.2 CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞a) 用接種環(huán)蘸取E.coli DH 5菌株，在不含Amp的LB平板上表面劃線，37靜置過夜；b) 培養(yǎng)16hrs后，從平板上挑取單菌落，接種于5mL 不含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜；c) 取1mL 加至100 mL 不含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)3-4小時至對數(shù)生長期；d) 取20mL培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入預(yù)冷50 mL 離心管中冰上放置20min（2管）；e) 4000rpm，4，離心8min；f) 棄上清，倒置離心管，用吸水紙吸干，每管加預(yù)冷的5 mL 75m

47、mol/L CaCl2溶液，輕輕吹打，冰上放置20min；g) 2000 rpm，4，離心8min；h) 棄上清，并用預(yù)冷的含15%甘油的75mmol/L CaCl2溶液重懸，分裝成200L 小份/eppendorf，-70保存。2.7 轉(zhuǎn)化a) 200 L感受態(tài)細胞，冰上解凍至剛好融化；b) 取10L 連接反應(yīng)液，加至感受態(tài)細胞中，輕彈管壁使其混勻，冰上放置30min；c) 42熱擊90sec，馬上冰淬滅2min；d) 馬上加入LB液體培養(yǎng)基（不含Amp）1mL，混勻，200rpm，37振蕩培養(yǎng)45min；f) 6000rpm，室溫離心5min，吸去1mL上清，用剩余的200L溶液重新懸浮細

48、菌沉淀；g) 將細菌懸浮液200L涂布到含100g/mL的氨芐平板上，37靜置培養(yǎng)過夜；h) 16hrs后，挑單菌落接種與5mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。2.8 重組質(zhì)粒鑒定2.8.1 堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNAa) 取1.5mL細菌培養(yǎng)液于Eppendorf管中，12000rpm，4離心 5min,棄上清；b) 沉淀菌體重懸于100L的SolutionI，振蕩混勻，室溫放置5min；c) 加入新鮮配制的SolutionII 200L，溫和顛倒數(shù)次，冰浴5min；d) 加入SolutionIII 150L，上下顛倒混勻，冰浴5min；e) 12000rpm，4離心6min；

49、f) 將水相轉(zhuǎn)入干凈的Eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)，上下顛倒混勻，12000rpm，4離心8min；g) 將水相轉(zhuǎn)入干凈的Eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3M NaAc，振蕩混勻，室溫放置30min；h) 12000rpm，4離心10min，棄上清，倒置于吸水紙上吸干；i) 加1mL 70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm，4離心 8min，棄上清，倒置于吸水紙上吸干液體；37或室溫風(fēng)干沉淀；j) 用20L含10g/mL的TE溶液(pH8.0)溶解DNA，短暫離心備用。 2.8.2 雙酶切鑒定重組質(zhì)粒利用外源基因引入的Pst

50、、Kpn酶切位點，對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定；同時用特異性引物進行PCR鑒定。反應(yīng)結(jié)束后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果并拍照。 3. 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達 基因工程的最終目的是在一個合適的系統(tǒng)中，使外源基因高效表達，從而產(chǎn)生有重要作用的蛋白產(chǎn)品?；蚬こ痰谋磉_系統(tǒng)有原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)，大腸菌表達系統(tǒng)屬于原核表達系統(tǒng)3.1重組菌的誘導(dǎo)表達a) 取測序正確的陽性菌以1:100接種于含硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)3h（OD600約等于0.5）；b) 加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1mM，培養(yǎng)4h；c) 室溫8000rpm離心10min收集菌體；d) 棄上清后加入適量50mM P

51、BS（pH7.4）懸浮細菌，反復(fù)吹打后，8000rpm離心10min；e) 棄上清，加入培養(yǎng)基1/10體積的50mM PBS（pH7.4）重懸細菌，取1mL超聲波破碎（300 W，4 S/4S，99次）；f) 12000rpm離心10min，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。3.2 重組蛋白可溶性分析a) SDS-PAGE電泳板的處理 用中性洗滌劑清洗后，再用雙蒸水淋洗，然后用酒精棉球擦拭，吹風(fēng)機吹干備用。b) 15分離膠的制備 在10 mL小燒杯中加入下列試劑：雙蒸水 1.1 mL30%丙稀酰胺溶液 2.5 mL1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 mL10% SDS 0.05 mL10%過硫酸銨 0.05 mLTEMED 0.005 mL充分混勻，立即緩慢倒入已固定好的兩電泳板之間的狹槽中，馬上輕輕覆蓋一層雙蒸水，室溫靜置至膠完全聚合，除去上層水相，用濾紙吸干水分。c) 濃縮膠的制備 在10 mL小燒杯中加入下列試劑： 雙蒸水 1.4 mL30%丙稀酰胺溶液 0.33 mL1.0 M Tris (p