2022年病原細(xì)菌的分離與鑒定

1、病原細(xì)菌的別離與鑒定.txt24生活如海，寬容作舟，泛舟于海，方知海之寬闊；生活如山，寬容為徑，循徑登山，方知山之高大；生活如歌，寬容是曲，和曲而歌，方知歌之動(dòng)聽。病原細(xì)菌的別離與鑒定 發(fā)布日期：2021-05-09 瀏覽次數(shù)：827 字號(hào)： 大 中 小 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康南到y(tǒng)學(xué)習(xí)獸醫(yī)臨床病原細(xì)菌的別離與鑒定技術(shù)，促進(jìn)學(xué)生系統(tǒng)掌握各類病原細(xì)菌的根本特性與實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)，增強(qiáng)學(xué)生應(yīng)用所學(xué)知識(shí)解決生產(chǎn)實(shí)踐過程中的傳染病的診斷和防控問題的能力，為預(yù)防、控制和消滅畜禽病原微生物，保障畜牧業(yè)生產(chǎn)的安康開展效勞。二、知識(shí)背景細(xì)菌別離是細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中的極其重要的環(huán)節(jié)。正確的別離有助于很快得到可疑的致病菌，對(duì)疫病的診斷

2、與防控至關(guān)重要。在細(xì)菌別離時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)：1病料采集1病料的種類主要決定于疫病的性質(zhì)，一般方法為：全身感染血液及內(nèi)臟；局部感染病患部位；特殊病例特殊處理。特殊情況的正確處理與操作者的專業(yè)知識(shí)有很大關(guān)系。無論全身或局部感染，均應(yīng)采含菌最多或病變明顯的組織2病料的采集時(shí)間也應(yīng)特別注意：活體病料應(yīng)考慮病原在疾病開展過程中部位的變化；患畜死后應(yīng)立即采集病料，越早越好。2無菌操作無菌操作是指在微生物研究過程中，既要防止各種外界的微生物進(jìn)入操作對(duì)象又要杜絕操作對(duì)象污染周圍環(huán)境的操作技術(shù)。無菌操作是對(duì)微生物學(xué)工作者最根本的要求，必須經(jīng)過嚴(yán)格訓(xùn)練才能形成無菌操作素養(yǎng)。不管何種情況下，頭腦中都應(yīng)該有這個(gè)概念。無

3、菌操作貫穿于整個(gè)別離過程，例如：病料的采集、器材的準(zhǔn)備、具體的操作。所用器械及物品均應(yīng)事先滅菌備用，金屬器具包裝后高壓滅菌或煮沸30min，玻璃器皿可高壓滅菌也可干熱滅菌，膠皮塞、培養(yǎng)基等那么要高壓滅菌。3培養(yǎng)基培養(yǎng)基是指由人工方法配合而成的，用于微生物培養(yǎng)、別離、鑒別、研究和保存菌種用的混合營養(yǎng)制品。1制作培養(yǎng)基的根本原那么依據(jù)細(xì)菌的物質(zhì)代謝要求和營養(yǎng)需要，必須含有細(xì)菌生長繁殖所需要的碳源、氮源、礦物質(zhì)以及生長環(huán)境條件。2制作培養(yǎng)基的根本要求適宜的水分和各種營養(yǎng)物質(zhì)；適宜的酸堿度與滲透壓；不含抑制細(xì)菌生長的物質(zhì)；應(yīng)均質(zhì)透明；應(yīng)徹底滅菌；對(duì)某些微生物必須提供一些特殊物質(zhì)。3培養(yǎng)基的種類 根底培

4、養(yǎng)基：含有一般細(xì)菌生長繁殖需要的根本營養(yǎng)物質(zhì)；可作為一些特殊培養(yǎng)基的根底成分。 加富培養(yǎng)基：在根底培養(yǎng)基中參加某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)如血液/血清、酵母浸膏或生長因子等；用以培養(yǎng)對(duì)營養(yǎng)要求高的微生物。 選擇培養(yǎng)基：利用細(xì)菌對(duì)某種或某些化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同；在培養(yǎng)基中參加這類物質(zhì)，利于所需別離的細(xì)菌生長，而抑制不需要的細(xì)菌生長，從而到達(dá)別離某種微生物的目的。 鑒別培養(yǎng)基：是一類含有某種特定化合物或試劑的培養(yǎng)基。某種細(xì)菌在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，能與這種特定化合物或試劑發(fā)生某種明顯的特征性反響；從而到達(dá)區(qū)分不同的微生物。 厭氧培養(yǎng)基：利用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法，去除氧氣后的培養(yǎng)基；可用于厭氧

5、性細(xì)菌的別離和培養(yǎng)。4細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長情況1固體培養(yǎng)基單個(gè)細(xì)菌在培養(yǎng)基外表生長、繁殖到一定程度時(shí)形成的肉眼可見的子細(xì)胞群落稱為菌落，它是由數(shù)以萬計(jì)一樣的細(xì)菌集合而成。眾多細(xì)菌在固體培養(yǎng)基外表密集生長所形成的細(xì)胞群體稱為菌苔。 菌落的形態(tài)特征大小、形狀露滴狀、圓形、菜把戲、不規(guī)那么等、突起或扁平、凹陷、邊緣光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等、顏色紅色、灰白色、黑色、綠色、無色、黃色等、外表光滑、粗糙等、透明度不透明、半透明、透明等和粘度等。據(jù)細(xì)菌菌落外表特征不同，可將菌落分為3型：光滑型菌落S型菌落：菌落外表光滑、濕潤、邊緣整齊，新別離的細(xì)菌大多呈光滑型菌落。粗糙型菌落R型菌落：菌落外表粗糙、枯燥

6、、呈皺紋或顆粒狀，邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細(xì)菌變異失去菌體外表多糖或蛋白質(zhì)形成。R型細(xì)菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型細(xì)菌弱。但也有少數(shù)細(xì)菌新別離的毒力株就是R型，如炭疽孢桿菌、結(jié)核分枝菌等。粘液型菌落M型菌落：菌落粘稠、有光澤、似水珠樣。多見于厚莢膜或豐富粘液層的細(xì)菌、結(jié)核桿菌等。 菌落溶血特征溶血：又稱草綠色溶血，菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)12mm的草綠色環(huán)，為高鐵血紅蛋白所致；溶血：又稱完全溶血，菌落周圍形成一個(gè)完全清晰透明的溶血環(huán)，是細(xì)菌產(chǎn)生的溶血素使紅細(xì)胞完全溶解所致；溶血：即不溶血，菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化，紅細(xì)胞沒有溶解或缺損。 色素有些細(xì)菌產(chǎn)生水溶性色素，使菌落和周圍的培

7、養(yǎng)基出現(xiàn)綠色、金黃色、白色、橙色、檸檬色等顏色，產(chǎn)生的色素有水溶性或脂溶性。 氣味某些細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長繁殖后可產(chǎn)生特殊氣味，如銅綠假單胞菌生姜?dú)馕?、變形桿菌巧克力燒焦的臭味、厭氧梭菌腐敗的惡臭味、白色假絲酵母菌酵母味和放線菌泥土味等。2液體培養(yǎng)基細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中有3種生長現(xiàn)象：大多數(shù)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基生長繁殖后呈均勻混濁；少數(shù)鏈狀排列的細(xì)菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等那么呈沉淀生長；枯草芽胞桿菌、結(jié)核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈外表生長，常形成菌膜。3半固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)，有鞭毛的細(xì)菌除了沿穿刺線生長外，在穿刺線兩側(cè)也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長。無鞭毛的細(xì)菌只

8、能沿穿刺線呈明顯的線狀生長，穿刺線兩邊的培養(yǎng)基仍然澄清透明，為動(dòng)力試驗(yàn)陰性。5別離細(xì)菌所要滿足的培養(yǎng)條件1適宜的培養(yǎng)基條件；2適宜的溫度條件；3適宜的氣體條件。三、細(xì)菌的別離方法細(xì)菌別離就是把病料中的病原菌或把目的菌從微生物的混合材料中別離培養(yǎng)出來，并獲得目的菌的單一生長材料，從而進(jìn)展診斷及有關(guān)研究工作。1待檢材料的處理無菌采集的病料不經(jīng)處理可直接用于別離；污染較嚴(yán)重的病料，接種前必須處理前方可進(jìn)展別離培養(yǎng)。1加熱處理法當(dāng)疑心病原菌為芽胞菌時(shí)，可參加5-10倍滅菌生理鹽水研磨(液體病料除外)，75水浴30min(或80 15-20min)，可殺死細(xì)菌繁殖體(包括雜菌及病原菌)；然后將處理過的病

9、料接種到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上。2接種易感動(dòng)物把病料接種易感動(dòng)物，待其發(fā)病死亡后，取其血液或組織器官，接種到培養(yǎng)基上。利用此方法不但可以從污染的材料中別離出病原菌，而且還可以確定病原菌的毒力。3化學(xué)藥品處理有些化學(xué)藥品對(duì)某些細(xì)菌有極強(qiáng)的抑制力，而對(duì)另一些細(xì)菌那么沒有抑制作用或很小。因此可將適宜的化學(xué)藥品參加培養(yǎng)基中。如龍膽紫那么可抑制許多G菌的繁殖，有利于G菌的別離培養(yǎng)；2平板劃線別離培養(yǎng)法1培養(yǎng)基平板的準(zhǔn)備取普通瓊脂培養(yǎng)基或含有特殊成分的瓊脂培養(yǎng)基，融化并讓其冷卻至50左右，傾入滅菌平皿中，每個(gè)平皿約15mL，使其分布均勻，冷卻凝固后即為固體平板培養(yǎng)基。2各種物品的準(zhǔn)備取出待檢病料，置于工作臺(tái)上；接

10、種前準(zhǔn)備好酒精燈、接種環(huán)、火柴、酒精棉球、試管架等。如有超凈工作臺(tái)，應(yīng)先翻開通風(fēng)機(jī)，過濾除塵，如有紫外線燈應(yīng)同時(shí)翻開，10-15min后可開場工作。不管在桌面上還是在超凈工作臺(tái)上接種，都要事先作好準(zhǔn)備工作，把所用的物品器械擺好。 3平板劃線以左手持平板，中指、無名指和小指托著平板底,拇指和食指翻開上蓋，使蓋與底成30o角，以便劃線。右手握接種環(huán)，先滅菌鉑絲局部，待絲燒紅后，再于火焰上滅菌金屬棒局部。把接種環(huán)上的病料涂在培養(yǎng)基一側(cè)，一般作5-8次劃線。將環(huán)上的多余細(xì)菌材料燒掉后，從第1次劃線引出第2次劃線；再從第2次劃線引出第3次劃線，如此反復(fù)3-4次劃線后，即可把整個(gè)平板外表劃滿，注意每一次劃

11、線只能與上一次劃線重疊，這樣就可在最后的1-2次劃線上出現(xiàn)多量的單個(gè)菌落，以便進(jìn)展純培養(yǎng)。4培養(yǎng)物的觀察病料在接種培養(yǎng)基后，經(jīng)過一段時(shí)間，應(yīng)取出來檢查其生長狀況。首先用肉眼檢查有無細(xì)菌生長；假設(shè)有，那么需進(jìn)一步檢查菌落是否純一。當(dāng)從臨床病料中別離細(xì)菌時(shí)：多數(shù)情況下，沿劃線生長較多的菌落，是待檢病原菌的可能性較大；少數(shù)零散分布或不在劃線上生長的菌落，多為雜菌。為慎重起見，可挑選假設(shè)干個(gè)可疑菌落分別進(jìn)展鑒定。3厭氧菌的別離培養(yǎng)法通常使用物理去氧、化學(xué)去氧和生物去氧，實(shí)驗(yàn)室常用：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧肉湯4細(xì)菌的純培養(yǎng)與移植接種 別離培養(yǎng)的目的就是要獲得純培養(yǎng)。細(xì)菌的純培養(yǎng)就是只含一種細(xì)菌的培養(yǎng)物，最理想

12、的純培養(yǎng)是一個(gè)細(xì)菌的后代。細(xì)菌的移植接種就是把某種細(xì)菌材料移種到一個(gè)新的培養(yǎng)基上，使它在其上生長。四、細(xì)菌的培養(yǎng)技術(shù)根據(jù)目的和要求的差異，可采取不同的培養(yǎng)方法1、外表培養(yǎng)又稱固體外表培養(yǎng)。將細(xì)菌液均勻地接種于固體培養(yǎng)基外表,平放靜置培養(yǎng)，然后收集菌苔。2、深層培養(yǎng)將細(xì)菌液接種于液體培養(yǎng)基進(jìn)展培養(yǎng)。包括液體靜置深層培養(yǎng)和生物反響器發(fā)酵罐深層培養(yǎng)。3、透析培養(yǎng)根據(jù)小分子能透過半透膜擴(kuò)散，而將不同分子量的物質(zhì)別離原理設(shè)計(jì)的一種細(xì)菌培養(yǎng)裝置進(jìn)展細(xì)菌培養(yǎng)。五、細(xì)菌的生化試驗(yàn)細(xì)菌由于其種類不同，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與排出，分解與合成的能力不同，這與細(xì)菌本身所固有的和環(huán)境誘導(dǎo)的酶有密切關(guān)系，細(xì)菌在自然界是一種巨

13、大的生化動(dòng)力，在它們的代謝過程中往往同時(shí)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，有些對(duì)人類有利，有些會(huì)引起動(dòng)植物和人類疾病，細(xì)菌的這些合成和分解代謝產(chǎn)物具有種的特異性，我們可借此來進(jìn)展細(xì)菌種的鑒定。1、氧化型與發(fā)酵型O/F的測定1原理不同細(xì)菌對(duì)不同的糖分解能力及代謝產(chǎn)物不同，這種能力因是否有氧氣的存在而異，有氧條件下稱為氧化，無氧條件下稱為發(fā)酵。這在區(qū)別微球菌與葡萄球菌、腸桿菌科成員中尤其有意義。2培養(yǎng)基成分：蛋白胨2g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀0.3g，瓊脂4g，葡萄糖10g，0.2%溴麝香草酚藍(lán)BTB12mL，蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、瓊脂、鹽類和水混合，加熱融解，調(diào)pH為7.2，然后加葡萄糖和指示劑，混

14、合加熱10min，分裝試管，加塞包裝，115高壓蒸汽滅菌20min，取出使成瓊脂柱。3試驗(yàn)方法 用18-24h斜面培養(yǎng)物接種于兩管O/F培養(yǎng)基，穿刺接種，距管底有一定距離。 加lmL滅菌的液狀石蠟油到一個(gè)O/F試驗(yàn)管作發(fā)酵試驗(yàn) 37下孵育48h或更長點(diǎn)時(shí)間4結(jié)果判定 只在沒有覆蓋石蠟油的一管發(fā)酵糖產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣者屬氧化型或呼吸型 兩管均發(fā)酵糖產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣者為發(fā)酵型2 、糖類分解發(fā)酵試驗(yàn)原理細(xì)菌分解糖的能力是受遺傳基因控制的，是細(xì)菌含有直接分解糖的酶或誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶作用的結(jié)果，是細(xì)菌種的特征的表現(xiàn)，可幫助細(xì)菌的鑒定，含糖培養(yǎng)基中含有指示劑，假設(shè)某細(xì)菌分解糖那么產(chǎn)酸發(fā)酵或產(chǎn)酸產(chǎn)氣氧化，會(huì)使培養(yǎng)基的

15、指示劑改變顏色，可判斷細(xì)菌是否分解某種糖或醇或其他碳水化合物。培養(yǎng)基需氧菌常用鄧亨氏Dunham蛋白胨水溶液加0.5%-0.7%的瓊脂1.6%溴甲酚紫酒精溶液+特定糖或醇見附錄有市售各種微量發(fā)酵管也可用。厭氧菌用含胨、鹽、硫羥代乙醇酸鈉、瓊脂的高層半固體培養(yǎng)基半指示劑同上。3試驗(yàn)方法 瓊脂斜面培養(yǎng)物用接種針挑取少量菌穿刺接種于糖發(fā)酵管深部勿穿到管底！。 假設(shè)所要接種的細(xì)菌營養(yǎng)要求高，那么需要先將糖發(fā)酵管加熱融化后，再加幾滴除菌的馬血清牛血清也可，搖勻待凝固后再行接種如巴氏桿菌、布魯氏菌等。 將接種管標(biāo)記清楚放人37孵育，24-48h觀察結(jié)果，有的菌對(duì)某一糖的發(fā)酵屬緩慢作用，那么需要培養(yǎng)一個(gè)月之

16、久。4結(jié)果判定無變化 培養(yǎng)基不變色產(chǎn) 酸 培養(yǎng)基變黃產(chǎn)酸產(chǎn)氣 培養(yǎng)基變黃并有氣泡3、淀粉水解試驗(yàn)1原理有的細(xì)菌具有淀粉酶，能水解培養(yǎng)基中的淀粉成麥芽糖。淀粉水解后遇碘液不再呈藍(lán)紫色反響。2培養(yǎng)基與試劑 3%可溶性淀粉瓊脂平板見附錄和革蘭氏碘溶液見附錄一3試驗(yàn)方法 將細(xì)菌劃線接種于3%可溶性淀粉瓊脂平板上，在37培養(yǎng)24h。 取出平板，在菌落處滴加碘液少許，觀察。 培養(yǎng)基呈深藍(lán)色，說明淀粉未被水解，即淀粉酶陰性。能水解淀粉的細(xì)菌其菌落周圍有透明的環(huán)即淀粉酶陽性。4、吲哚靛基質(zhì)試驗(yàn)1原理有些細(xì)菌如大腸埃希氏菌能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸生成吲哚，后者與對(duì)位二甲基氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈紅色。2培

17、養(yǎng)基：鄧亨氏蛋白胨水溶液見附錄。3試 劑：歐立希氏Ehrlich's試劑 Kovac's試劑對(duì)位二氨基苯甲醛 1g 對(duì)位二氨基苯甲醛 5g無水乙醇 95ml 戊醇或異戊醇 75ml濃鹽酸 20ml 濃鹽酸 25ml先用乙醇溶解試劑后加鹽酸，避光保存。4試驗(yàn)方法 試管試驗(yàn)法：以接種環(huán)將待檢菌新鮮斜面培養(yǎng)物接種于鄧亨氏蛋白胨水溶液中，置37培養(yǎng)24-48h 可延長4-5d。于培養(yǎng)液中參加戊醇或二甲苯2-3mL，搖勻，靜置片刻后，沿試管壁參加歐立希氏或Kovacs試劑2mL。在戊醇或二甲苯下面的液體變?yōu)榧t色者為陽性反響。 斑點(diǎn)試驗(yàn)法：將一片濾紙放在培養(yǎng)皿的蓋子上或一張載玻片上；滴加1

18、-1.5ml試劑液于濾紙上使其變濕；取18-24h血瓊脂平板培養(yǎng)物涂布于浸濕的濾紙上；在1-3min內(nèi)棕色的試劑由紫紅變?yōu)榧t色者為陽性。 加熱試驗(yàn)法：將一小指頭大的脫脂棉，滴上兩滴歐立希氏試劑，再在同一處加滴上兩滴高硫酸鉀K2S2O8飽和水溶液，置于含培養(yǎng)液的被檢試管中，離液面約半寸；將被檢試管放入燒杯或搪瓷缸水浴煮沸為止；脫脂棉上出現(xiàn)紅色者為陽性。5、甲基紅M.R試驗(yàn)維倍V-P二氏試驗(yàn)。1原理甲基紅是一種pH指示劑，pH的變色范圍為pH4.4紅色pH6.2黃色，當(dāng)細(xì)菌分解培養(yǎng)基中葡萄糖產(chǎn)酸，且產(chǎn)酸量大致使培養(yǎng)基在參加甲基紅指示劑后顯紅色為陽性。V-P試驗(yàn)?zāi)敲词悄承┘?xì)菌能使葡萄糖發(fā)酵而產(chǎn)生丙酮

19、酸，丙酮酸再變?yōu)橐阴＜谆状迹姨谆状加肿兂?,3,丁二烯醇，2,3,丁二烯醇在有堿存在時(shí)氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用產(chǎn)生粉紅色化合物。通常M.R和V-P試驗(yàn)是密切相關(guān)的，如果一個(gè)微生物M.R是陽性，那么V-P是陰性；或者相反。這個(gè)試驗(yàn)對(duì)區(qū)別大腸埃希氏菌與腸桿菌是特別有用的。2培養(yǎng)基 葡萄糖蛋白胨水溶液見附錄。3試劑 M.R試劑甲基紅 0.02g95%酒精 60mL蒸餾水 40mL V.P試劑甲液：萘酚酒精溶液萘酚5g無水乙醇100mL乙液：KOH溶液KOH 40g，水100mL將甲液和乙液分裝棕色瓶中，于4-10保存?；蛄蛩徙~ 1g濃氨水 40mI10%KOH 950mL蒸

20、餾水 10mL待溶解后分裝棕色瓶中備用。4試驗(yàn)方法? M.R試驗(yàn)：接種細(xì)菌于培養(yǎng)基中，在37培養(yǎng)24-48h后。于培養(yǎng)物中參加幾滴試劑，變紅色者為陽性反響，桔紅到黃色那么為陰性。? V-P試驗(yàn):取出培養(yǎng)24hV.P試驗(yàn)用葡萄糖蛋白胨溶液lmL。將6%小萘酚酒精溶液0.5mL參加，隨后加16%KOH 0.5mL，輕搖，然后讓其靜置10-15min。在15min內(nèi)出現(xiàn)紅色者那么為陽性，1h后可出現(xiàn)假陽性。6、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)1原理在這個(gè)培養(yǎng)基中檸檬酸鈉為唯一的碳源，磷酸銨是唯一的氮源，假設(shè)細(xì)菌利用這些鹽作為碳素和氮素來源而生長，利用檸檬酸鈉那么生成碳酸鹽以及銨鹽被利用所產(chǎn)生的NH3+轉(zhuǎn)變?yōu)镹H4O

21、H，使培養(yǎng)基變堿，pH升高，指示劑溴麝香草酚藍(lán)就顯出深藍(lán)色。2培養(yǎng)基西蒙氏Simmon's檸檬酸鈉瓊脂斜面培養(yǎng)基見附錄。3試驗(yàn)方法將被檢菌純培養(yǎng)物或單個(gè)菌落劃線于檸檬酸鈉瓊脂斜面并在37培養(yǎng)24-48h。腸桿菌、枸椽酸桿菌和一些沙門氏菌種產(chǎn)生陽性反響，可見菌體生長好或培養(yǎng)基顯為深藍(lán)色。7、石蕊牛乳試驗(yàn)1原理石蕊是一種指示劑，當(dāng)pH升至8.3時(shí)堿性顯藍(lán)色，pH降至4.5時(shí)酸性顯紅色；pH接近中性，未接種的培養(yǎng)基為紫藍(lán)色故稱紫乳。石蕊也是一種氧化復(fù)原指示劑，可以復(fù)原為白色，所以，石蕊牛乳紫乳是用來測定被檢細(xì)菌幾種代謝性質(zhì)的一種鑒別培養(yǎng)基。2培養(yǎng)基加石蕊酒精飽和溶液于新鮮脫脂乳中，分裝小管，

22、經(jīng)流通蒸汽滅菌而成。3試劑石蕊酒精溶液的制備：8g石蕊在30mL的40%乙醇中研磨，吸出上清液，加乙醇研磨，連續(xù)兩次。加40%乙醇總量100mL，并煮沸1min。取用上清液，必要時(shí)可加幾滴1mol/L鹽酸使呈紫色?，F(xiàn)多用溴甲酚紫代替石蕊，即于100mL脫脂乳中加1.2mL 1.6%溴甲酚紫酒精溶液。4試驗(yàn)方法與解釋將被檢菌接種于紫乳，置37溫箱培養(yǎng)，觀察結(jié)果。假設(shè)細(xì)菌分解乳糖產(chǎn)酸，指示劑變色石蕊為紅色，溴甲酚紫為黃色。假設(shè)產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使牛乳酸凝，氣體使凝塊中有裂隙，如產(chǎn)氣莢膜梭菌呈“暴烈發(fā)酵。假設(shè)為紫色，表示乳糖雖未分解；假設(shè)為藍(lán)色表示乳糖雖未發(fā)酵，但細(xì)菌分解培基中所出現(xiàn)的氮源物質(zhì)而產(chǎn)堿所致。假

23、設(shè)指示劑復(fù)原那么為無色，常出現(xiàn)在酸凝塊形成之后。8、硫化氫試驗(yàn)1原理凡細(xì)菌能分解含硫氨基酸，產(chǎn)生H2S者，其所產(chǎn)生的H2S會(huì)使培養(yǎng)基中的醋酸鉛或含醋酸鉛的濕潤濾紙條或FeCl3形成黑色的硫化鉛或硫化鐵。2培養(yǎng)基 醋酸鉛瓊脂見附錄。 三糖鐵瓊脂斜面見附錄。 營養(yǎng)肉湯，肝浸湯瓊脂斜面或血清葡萄糖瓊脂斜面。3試驗(yàn)方法與解釋 用接種針蘸取純培養(yǎng)物，沿試管壁作穿刺，37孵育24-48h或更長時(shí)間，培養(yǎng)基變黑者為陽性。 或?qū)⒓兣囵B(yǎng)物接種于肉湯，肝浸湯瓊脂斜面或血清葡萄糖瓊脂斜面，在試管壁和棉花塞間夾一6.5×0.6cm大小的試紙條浸有飽和醋酸鉛溶液，培養(yǎng)于37，觀察，紙條變黑者為陽性。9、硝酸鹽

24、復(fù)原試驗(yàn)1原理有些細(xì)菌能從硝酸鹽提出氧而將其復(fù)原為亞硝酸鹽偶而還會(huì)形成NH3+ N2、NO、NO2和NH4OH的其它產(chǎn)物，假設(shè)向培養(yǎng)物中參加對(duì)氨基苯磺酸和-萘胺，會(huì)形成紅色的重氮染料對(duì)磺胺苯-偶氮-萘胺，這對(duì)鑒定細(xì)菌是有用的試驗(yàn)鋅也可復(fù)原硝酸鹽為亞硝酸鹽，而且對(duì)區(qū)別假陰性反響和真陰性反響是有用的。2培養(yǎng)基 適用于需氧菌的硝酸鉀蛋白胨水。 適用于厭氧菌的硝酸鹽培養(yǎng)基。3試劑甲液：甲基-萘胺0.6g 5mo1/L冰醋酸100mL稍加熱溶解，用脫脂棉過濾，放棕色瓶中，4-10保存。乙液：對(duì)氨基苯磺酸0.8g 5mol/L冰醋酸100mL先用5mo1/L冰醋酸30mL溶解對(duì)氨基苯磺酸，再加冰醋酸至10

25、0mL。放入帶玻璃塞的玻璃瓶中4-10保存。4試驗(yàn)方法與解釋用純菌培養(yǎng)物接種到硝酸鹽培養(yǎng)基中，在37培養(yǎng)18-24h，再加試劑甲和乙各3-5滴，在30s內(nèi)出現(xiàn)紅色即為陽性。假設(shè)無顏色出現(xiàn)，加少量鋅渣，隨后出現(xiàn)紅色那么是真正的陰性試驗(yàn)。10、尿素酶試驗(yàn)1原理細(xì)菌分解尿素產(chǎn)生兩分子氨，使培養(yǎng)基pH升高，指示劑酚紅顯示出紅色，即證明細(xì)菌有尿素酶。2培養(yǎng)基 Christensen's尿素瓊脂培養(yǎng)基，內(nèi)含尿素，蛋白陳和酚紅指示劑見附錄。3試驗(yàn)方法用接種環(huán)將待檢菌培養(yǎng)物接種于尿素瓊脂斜面，不要穿刺到底，下部留作對(duì)照。置37培養(yǎng)，于1-6h檢查有些菌分解尿素很快，有時(shí)需培養(yǎng)24h到6d有些菌那么緩慢

26、作用于尿素。陽性反響，那么瓊脂斜面由粉紅到紫紅色。11、接觸酶試驗(yàn)1原理本試驗(yàn)是檢測細(xì)菌有無接觸酶的存在，過氧化氫的形成看作是糖需氧分解的氧化終未產(chǎn)物，因?yàn)镠2O2的存在對(duì)細(xì)菌是有毒性的，細(xì)菌產(chǎn)生酶將其分解，這些酶為接觸酶過氧化氫酶和過氧化物酶。2試劑 3%H2O2新配。3試驗(yàn)方法與解釋可用接種環(huán)將一菌落放于載玻片的中央，加一滴3%H2O2于菌落上，立即觀察有無氣泡出現(xiàn)，也可在菌落和H2O2混合物之上放一張蓋玻片，可幫助檢出輕度反響，還可降低細(xì)菌的氣溶膠顆粒的形成。也可直接將3%H2O2加到培養(yǎng)瓊脂斜面或平板上直接觀察有無氣泡出現(xiàn)血瓊脂平板除外。12、氧化酶試驗(yàn)1原理測定細(xì)菌細(xì)胞色素氧化酶的產(chǎn)

27、生。陽性反響限于哪些能夠在氧氣存在下生長的同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素氧化酶的細(xì)菌。2試劑1%四甲基對(duì)苯二胺Tetra-methy-p-phenylene diamine dihydrochloride，新鮮配制，裝棕色瓶貯存4，一個(gè)月。3試驗(yàn)方法加2-3滴試劑于濾紙上，用一攪拌簽挑取一個(gè)菌落到紙上涂布觀察菌落的反響。陽性反響在5-10s內(nèi)由粉紅到黑色，15min后可出現(xiàn)假陽性反響。也可將試液滴在細(xì)菌的菌落上，菌落呈玫瑰紅色然后到深紫色者為陽性。也可在菌落上加試液后傾去，再徐徐滴加用95%酒精配制的1%的-萘酚溶液，當(dāng)菌落變成深藍(lán)色者為細(xì)胞色素氧化酶陽性。4考前須知 作時(shí)只能使用攪拌簽或鉑金環(huán)，因?yàn)?/p>

28、鐵絲會(huì)出現(xiàn)假陽性反響。 不要使用含葡萄糖培養(yǎng)基上生長的菌落，因?yàn)樗陌l(fā)酵作用會(huì)抑制氧化酶的活性，可能給予假陰性結(jié)果。13、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)1原理假設(shè)細(xì)菌具有苯丙氨酸脫氨酶，能將培養(yǎng)基中的苯丙氨酸脫氨變成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化鐵指示劑變?yōu)榫G色。變形桿菌和普羅菲登斯菌以及莫拉氏菌有苯丙氨酸脫氨酶的活力。2培養(yǎng)基與試劑 培養(yǎng)基：DL-苯丙氨酸2g，氯化鈉5g，L苯丙氨酸1g，瓊脂12g，酵母浸膏3g，磷酸氫二鈉1g，蒸餾水1000mL，分裝于小試管內(nèi)，121高壓蒸汽滅菌10min，作成斜面。 試 劑：10% FeCl3水溶液3試驗(yàn)方法將被檢菌18-24h培養(yǎng)物取出，向試管內(nèi)注入0.2mL或4-5

29、滴10%FeCl3，溶液于生長面上，變綠色者為陽性。14、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)1原理這是腸桿菌科細(xì)菌的鑒別試驗(yàn)，用以區(qū)分沙門氏菌通常為陽性和枸椽酸桿菌通常為陰性，假設(shè)果細(xì)菌能從賴氨酸或鳥氨酸脫去羧基-COOH，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH變堿，指示劑溴麝香草酚藍(lán)就顯示出藍(lán)色，試驗(yàn)結(jié)果為陽性。假設(shè)細(xì)菌不脫羧，培養(yǎng)基不變那么為黃色。2培養(yǎng)基根底培養(yǎng)基：蛋白胨5g 酵母浸膏 3g葡萄糖1g 蒸 餾 水1000mL0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液 12mL? 調(diào)整pH至6.8，在每100mL根底培養(yǎng)基內(nèi)，參加需要測定的氨基酸0.5g，所加的氨基酸應(yīng)先溶解于1.5%NaOH溶液內(nèi)。L-賴氨酸0.5g1.5%NaOH溶液0.5mL

30、L-烏氨酸0.5g1.5%NaOH溶液0.5mL? 參加氨基酸后，再調(diào)整pH至6.8，分裝于滅菌小試管內(nèi)，每管1mL，121高壓蒸汽滅菌10min。3試驗(yàn)方法1從瓊脂斜面挑取培養(yǎng)物少許，接種于試驗(yàn)用培養(yǎng)基內(nèi)，上面加一層滅菌液狀石蠟。2將試管放在37培養(yǎng)4d，每天觀察結(jié)果。3陽性者培養(yǎng)液先變黃后變?yōu)樗{(lán)色，陰性者為黃色。15、-半乳糖苷酶ONPG試驗(yàn)Ortho-nitrophenyl-Dgalactopyranoside Test1原理細(xì)菌分解乳糖依靠兩種酶的作用，一種是-半乳糖苷酶透性酶-galactosidase permease，它位于細(xì)胞膜上，可運(yùn)送乳糖分子滲人細(xì)胞。另一種為-半乳糖苷酶-

31、galactosidase，亦稱乳糖酶Lactase，位于細(xì)胞內(nèi)，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。具有上述兩種酶的細(xì)菌，能在24-48h發(fā)酵乳糖，而缺乏這兩種酶的細(xì)菌，不能分解乳糖。乳糖緩慢發(fā)酵菌只有-D-半乳糖苷酶胞內(nèi)酶，而缺乏-半乳糖苷酶透性酶，因而乳糖進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞很慢，而經(jīng)培養(yǎng)基中1%乳糖較長時(shí)間的誘導(dǎo)，產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的透性酶后，始能較快分解乳糖，故呈緩慢發(fā)酵現(xiàn)象。ONPG可迅速進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，被半乳糖苷酶水解，釋出黃色的鄰位硝基苯酚Ortho-nitrphenyl，ONP，故由培養(yǎng)基液變黃可迅速測知-半乳糖苷酶的存在，從而確知該菌為乳糖緩慢發(fā)酵菌。2培養(yǎng)基ONPG培養(yǎng)基成分：鄰硝基酚半乳糖苷

32、0.6g，0.01mol/L pH7.5磷酸緩沖液1000mL，pH7.5的滅菌1%蛋白胨水300mL。制法：先將前兩種成分混合溶解，濾過除菌，在無菌條件下與1%蛋白胨水混合，分裝試管，每管2-3mL，無菌檢驗(yàn)后備用。購不到ONPG時(shí)，可用5%的乳糖，并降低蛋白胨含量為0.2%-0.5%，可使大局部緩慢發(fā)酵乳糖的菌在1d內(nèi)發(fā)酵。3試驗(yàn)方法取一環(huán)細(xì)菌純培養(yǎng)物接種在ONPG培養(yǎng)基上置37培養(yǎng)1-3h或24h，如有半乳糖苷酶，會(huì)在3h內(nèi)產(chǎn)生黃色的鄰硝基酚；如無此酶，那么在24h內(nèi)不變色。16、明膠液化試驗(yàn)1原理明膠是一種動(dòng)物蛋白質(zhì)，某些細(xì)菌具有明膠液化酶，明膠經(jīng)分解后，可呈現(xiàn)不同的特征，有利于細(xì)菌的

33、鑒定。2培養(yǎng)基明膠培養(yǎng)基見附錄。3試驗(yàn)方法與考前須知 分別穿刺接種被檢菌18-24h培養(yǎng)物于明膠培養(yǎng)基，置22下孵育，觀察明膠液化狀況。明膠低于20凝成固體，高于24那么自行呈液化狀態(tài)，因此孵育溫度最好在22，但有些細(xì)菌在此溫度下不生長或生長極為緩慢，那么可先放在37培養(yǎng)，再移置于4冰箱經(jīng)30min后取出觀察，具有明膠液化酶者，雖經(jīng)低溫處理，明膠仍呈液態(tài)而不凝固。明膠耐熱性差，假設(shè)在100以上長時(shí)間滅菌，能破壞其凝固性，此點(diǎn)在制備培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意。17、膽汁溶解試驗(yàn)1原理肺炎鏈球菌產(chǎn)生自溶酶，它能使正在生長的菌體溶解，使老齡菌落中心下陷，膽鹽通過降低培養(yǎng)基與菌體細(xì)胞膜之間的外表能力而加速這一過程。本試驗(yàn)常用以鑒別肺炎鏈球菌和甲型溶血性鏈球菌。2試劑 2%去氧膽酸鈉溶液3試驗(yàn)方法與解釋于被檢菌血瓊脂平板上找到單個(gè)分散的菌落，在其上加一滴試液。再置37培養(yǎng)箱中30min后取出觀察菌落，可見菌落消失，或尚有局部保存。培養(yǎng)菌在肉湯中生長，而且固體培養(yǎng)平板上菌落周圍一個(gè)黑洞孔者是D群鏈球菌的指示。六、細(xì)菌的毒力檢測1毒力的概念同種病原微生物不同菌株或毒