人8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)

1、人 8 羥基脫氧鳥苷 (8-OHdG)酶聯(lián)免疫分析 (ELISA)試劑盒使用說明書本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定人血清，細(xì)胞上清及相關(guān)液體樣本中8 羥基脫氧鳥苷 (8-OHdG)的含量。實驗原理：本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人8 羥基脫氧鳥苷 （ 8-OHdG）水平。用純化的人8 羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入8 羥基脫氧鳥苷（8-OHdG），再與 HRP 標(biāo)記的8 羥基脫氧鳥苷（ 8-OHdG）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原 -酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB 顯色。 TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的

2、作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的8 羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（ OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人 8 羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）濃度。試劑盒組成 ：試劑盒組成48 孔配置96 孔配置保存說明書1 份1 份封板膜2 片（ 48）2 片（ 96）密封袋1 個1 個酶標(biāo)包被板1× 481× 962-8保存標(biāo)準(zhǔn)品： 360ng/L0.5ml × 1 瓶0.5ml × 1 瓶2-8保存標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml × 1 瓶1.5ml × 1 瓶2-8保存酶標(biāo)試劑3 ml 

3、5; 1 瓶6 ml × 1 瓶2-8保存樣品稀釋液3 ml × 1 瓶6 ml × 1 瓶2-8保存顯色劑 A液3 ml × 1 瓶6 ml × 1 瓶2-8保存顯色劑 B液3 ml × 1 瓶6 ml × 1 瓶2-8保存終止液3ml× 1 瓶6ml × 1 瓶2-8保存濃縮洗滌液（ 20ml× 20 倍）× 1 瓶（20ml ×30 倍）× 1 瓶2-8保存樣本處理及要求：1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右 （ 2000-30

4、00 轉(zhuǎn) /分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20 分鐘后，離心20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) /分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。3. 尿液：用無菌管收集，離心20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) /分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。14. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4 ）稀釋細(xì)胞懸液

5、，細(xì)胞濃度達(dá)到100 萬 /ml 左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持 2-8的溫度。加入一定量的 PBS（ PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) /分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于 -20保存

6、，但應(yīng)避免反復(fù)凍融 .7. 不能檢測含 NaN3的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（ HRP）活性。操作步驟：1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10 孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品 100l，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50l，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取 100l 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50l，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50l 棄掉，再各取 50l 分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul ，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取 50l 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品

7、稀釋液50l，混勻后從第七、第八孔中分別取50l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50l，混勻后從第九第十孔中各取50l 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50l，濃度分別為 240 ng/L ， 160 ng/L ， 80 ng/L ， 40 ng/L ， 20 ng/L ）。2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40l，然后再加待測樣品10l（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3.溫育：用封板膜封板后置37溫育 30 分鐘。4.配液：將

8、30（ 48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（ 48T的 20 倍）倍稀釋后備用。5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50l，空白孔除外。7. 溫育：操作同 3。8. 洗滌：操作同 5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 l，再加入顯色劑 B50l，輕輕震蕩混勻， 37避光顯色15 分鐘.10. 終止：每孔加終止液 50l，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色） 。11.測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。注意事項：1 試劑

9、盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。3 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好2控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n× 5）。5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6 底物請避光保存。7 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).8 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。9 本試劑不同批號組分不得混用。10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。計算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的