Transwell是檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)方法

1、Transwell是檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)方法我們所使用的是Chemicon公司的ECM554,基質(zhì)膠已經(jīng)包被好了,買(mǎi)來(lái)就可以用,很便利,而且我們算過(guò),跟自己買(mǎi)膠來(lái)包被價(jià)格相差不大。這種膠4度下很軟,37度那么變得比擬堅(jiān)硬,因此用前應(yīng)先放在培育箱中10分鐘作用,使膠完全凝固。該試劑盒對(duì)穿過(guò)膜的細(xì)胞進(jìn)行熒光染色,再用裂解液裂解細(xì)胞后檢測(cè)熒光值。我們?cè)趯?shí)際使用的時(shí)候?qū)Υ┻^(guò)膜的細(xì)胞接受1%結(jié)晶紫染色,鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。結(jié)晶紫也可以用33%醋酸溶解,再用酶標(biāo)儀570nm檢測(cè),同樣可以反響穿過(guò)細(xì)胞數(shù)由于基質(zhì)膠的厚度直接影響穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù),因此建議有條件的話還是買(mǎi)這類(lèi)已經(jīng)鋪好膠的試劑盒,比擬牢靠。說(shuō)明書(shū)該

2、公司網(wǎng)上可以下載,對(duì)原理也有比擬簡(jiǎn)略的闡述,可以去查一下。我們做的時(shí)候,上室用0.5%BSA的培育液,下室用5%血清的培育液,下室血清的濃度可依據(jù)細(xì)胞類(lèi)型的不同進(jìn)行調(diào)整,如果細(xì)胞侵襲能力強(qiáng),可適當(dāng)降低血清濃度,否那么可適當(dāng)提高血清濃度。需要注意的是:1。上室內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目要適當(dāng),過(guò)多,穿過(guò)膜的細(xì)胞會(huì)過(guò)多過(guò)快,如果用計(jì)數(shù)法的話將難以計(jì)數(shù);最少也要保證在收樣的時(shí)候,上室內(nèi)還要有細(xì)胞存在。簡(jiǎn)略細(xì)胞密度需要自己摸索。2。細(xì)胞計(jì)數(shù)的精確性對(duì)結(jié)果影響很大,各組間最好不要分開(kāi)計(jì)數(shù)。盡量用同一密度的細(xì)胞懸液給予不同處理,保證各組細(xì)胞量全都3。對(duì)細(xì)胞的處理不行影響細(xì)胞生存。否那么難以肯定是細(xì)胞量的轉(zhuǎn)變還是侵襲能力

3、轉(zhuǎn)變侵襲小室其實(shí)不止是transwell的,其它像Boyden chamber、Thincert也挺好用的。我用過(guò)Thincert,個(gè)人感覺(jué)不錯(cuò),而且價(jià)格廉價(jià),是grelner的,孔徑8微米用于24孔板的一個(gè)才45塊人民幣,而且可以零買(mǎi),不想transwell,總是一箱一箱的賣(mài),實(shí)在是太貴了!侵襲實(shí)驗(yàn)要結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)康?不肯定非要包被的。下面奉上用Thincert做侵襲實(shí)驗(yàn)的步驟(摘自?A quantitative cell migration assay using ThinCert cell culture inserts?,大家如需要,可用google搜之:1. Prepare cell c

4、ultures according to standard cell culture procedures2. Starve cells overnight in serum-free medium with 0.2 % BSA3. Harvest cells and wash them twice in PBS4. Resuspend cells in serum-free medium with 0.2 % BSA to an appropriate final cell concentration (e.g. 106/ml5. Place 24 well ThinCertTM cell

5、culture inserts in the wells of a CELLSTAR® 24 well cell culture plate6. Add 600 µl culture medium with or without chemoattractant to each well of the cell culture plate7. Add 200 µl cell suspension to each cell culture insert8. Incubate the cell culture plate for 3-24 h in a cell cul

6、ture incubator at 37°C and 5 % CO29. Remove the cell culture medium from each well of the cell culture plate and replace it by 450 µl serum-free culture medium with 8 µM Calcein-AM10. Incubate for 45 min in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO211. Remove the culture medium

7、 from the cell culture inserts12. Transfer the cell culture inserts into a freshly prepared 24 well cell culture plate containing 500 µl prewarmed Trypsin-EDTA per well13. Incubate for 10 min in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO2, agitate the plate from time to time14. Discard th

8、e cell culture inserts and transfer 200 µl of the Trypsin-EDTA solution (now containing the migratory cells from each well into a black flat bottom 96 well plate15. Read fluorescence in a fluorescence plate reader at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 520 nm從第9步開(kāi)頭計(jì)

9、數(shù)侵襲細(xì)胞時(shí),這份說(shuō)明書(shū)用的是熒光標(biāo)記,但這種方法本錢(qián)高而且繁瑣。我做的時(shí)候改為giemsa染色,發(fā)現(xiàn)效果不錯(cuò),簡(jiǎn)略如下:9.侵襲實(shí)驗(yàn)完成后,取出小室,用棉簽當(dāng)心將膜上外表的細(xì)胞擦拭去除;10.用手術(shù)刀片當(dāng)心沿小室邊緣將膜切下;11.把膜下外表向上放在一個(gè)潔凈的24孔板的孔中;12.甲醇:冰醋酸(3:1固定10min后用10%giemsa染色;13.在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞(即染成紫紅色的點(diǎn),未著色的多為細(xì)胞碎屑計(jì)數(shù)并拍照留念Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)概述目的:總結(jié)并改良細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)的操作閱歷。方法:接受改良后細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)分別商量不同濃度TNF刺激下的HCCC2981

10、0 膽囊癌細(xì)胞體外侵襲能力的強(qiáng)弱;粉防己堿對(duì)HUVEC 人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的抑制作用;VEGF 對(duì)人結(jié)腸癌HT229 細(xì)胞體外侵襲能力的影響。結(jié)果:改良后侵襲試驗(yàn)定位精確,結(jié)果清晰。結(jié)論:依據(jù)作者建議的方法操作,能夠縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間,有助于提高細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量。細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用于各種細(xì)胞因子對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及一些抑制血管生成的新藥商量,但在簡(jiǎn)略實(shí)驗(yàn)中獲得真實(shí)、最正確實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖像,并借以說(shuō)明問(wèn)題并非簡(jiǎn)潔。很多商量人員在此方面花費(fèi)了很多時(shí)間和科研經(jīng)費(fèi),從刺激實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞到蘇木素染色,看似簡(jiǎn)潔的實(shí)驗(yàn)步驟中有很多環(huán)節(jié)需要商量者注意.材料與方法1. 1Matrigel:

11、Becton Dickinson Compary, - 20 保存;Tanswell plate:Costar ,USA , # 3422 ,聚碳酯膜微孔直徑為8m;蘇木素染液,梯度乙醇,二甲苯溶液。1. 2 趨化因子的制備取傳代其次天長(zhǎng)勢(shì)良好的NIH3T3細(xì)胞,無(wú)血清培育基輕柔漂洗兩次; 參加無(wú)血清培育基,37,5 %CO2 培育24 h48h,收集細(xì)胞培育上清;4 ,12 000rpm 離心,10 min ,取上清;0.22 m 濾膜過(guò)濾除菌;分裝,在- 20 保存。1. 3transwell 培育板籌備全部操作均需無(wú)菌操作。-20保存的Matrigel 在冰上保28過(guò)夜融化。在冰上用預(yù)冷

12、的槍頭吸取100l Matrigel 參加冰預(yù)冷的300l 無(wú)血清培育基中,充分混均。取上述稀釋的Matrigel 25 l 參加transwell 板上室,掩蓋整個(gè)聚碳酯膜,37 ,30 min ,使Matrigel 聚合成膠。已鋪好Matrigel的transwell 培育板置于37可保存2 周。1. 4Matrigel 侵襲實(shí)驗(yàn)(Matrigel Invasion Assay刺激后的各組細(xì)胞用PBS 漂洗3 次。以常規(guī)方法用無(wú)血清培育基制備單細(xì)胞懸液,5 ×105個(gè)細(xì)胞/ ml ,每組細(xì)胞各分為兩局部。胎盤(pán)蘭拒染實(shí)驗(yàn),細(xì)胞活力需大于95 %。Transwell 培育板上室參加1

13、00l 細(xì)胞懸液( 5 ×104 個(gè) 并參加無(wú)血清培育基200 ul 。Transwell 培育板下室參加500l 趨化因子,37,5 %CO2 培育24 h。用濕棉簽輕輕擦去Matrigel 凝膠和聚碳酯膜上外表的細(xì)胞。當(dāng)心取出上室,用線拴住,并做好標(biāo)記,用冰預(yù)冷的甲醇固定30 min。蘇木素染色1 min。梯度乙醇脫水(80 % ,95 % ,100 % ,二甲苯透明。當(dāng)心將聚碳酯膜自上室基底切取下來(lái),置載玻片上中性樹(shù)脂封片。附著于聚碳酯膜下外表的細(xì)胞在高倍鏡下( ×400 隨機(jī)取6 個(gè)視野1 計(jì)數(shù),取平均數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)兩次。考前須知2. 1NIH3T3 細(xì)胞制備的趨化因

14、子與胎牛血清趨化因子是能使細(xì)胞產(chǎn)生趨化運(yùn)動(dòng)的一類(lèi)細(xì)胞因子2 。目前利用NIH3T3 細(xì)胞制備趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室比擬多,時(shí)間較長(zhǎng)且實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣。眾所周知,胎牛血清中有趨化因子,我們?cè)诓煌瑵舛萒NF刺激下的HCCC29810 膽囊癌細(xì)胞體外侵襲能力的強(qiáng)弱實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用胎牛血清和用NIH3T3 細(xì)胞制備的趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)效果是一樣的,兩組遷移的細(xì)胞數(shù)很接近。在實(shí)驗(yàn)時(shí)間上,用NIH3 T3細(xì)胞制備趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)周期為1 周,而用胎牛血清作趨化因子做細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)周期為2 d ,實(shí)驗(yàn)時(shí)間節(jié)省了很多。因此認(rèn)為可以用胎牛血清來(lái)代替NIH3T3 細(xì)胞制備的趨化因子。2.

15、2 細(xì)胞的籌備所需細(xì)胞應(yīng)處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞活力需大于95 %。如果細(xì)胞活力小,就會(huì)造成細(xì)胞穿透能力下降,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2. 3 擦去Matrigel 凝膠和聚碳酯膜上外表的細(xì)胞先用干棉簽將上室內(nèi)液體吸去,再用蒸餾水浸濕的棉簽輕輕擦去Mat rigel 凝膠和聚碳酯膜上外表的細(xì)胞,如果沒(méi)有擦凈聚碳酯膜上外表的細(xì)胞,在細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)就會(huì)將沒(méi)擦掉的細(xì)胞也計(jì)進(jìn)來(lái)。尤其是細(xì)胞為圓形的時(shí)候,就會(huì)分辨不出是穿過(guò)去的細(xì)胞還是沒(méi)穿過(guò)去的細(xì)胞,對(duì)于長(zhǎng)梭形細(xì)胞來(lái)說(shuō),穿過(guò)去的細(xì)胞為長(zhǎng)梭形,沒(méi)穿過(guò)去的細(xì)胞多為圓形。2. 4 蘇木素染色上室浸泡在新蘇木素中的時(shí)間為1 min ,用過(guò)屢次的蘇木素為2 min。在商量粉防己堿對(duì)

16、HUVEC 人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的抑制作用沒(méi)有將多余蘇木素洗去,直接脫水、透明,造成細(xì)胞圖片背景模糊,細(xì)胞不清晰。在作不同濃度TNF刺激下的HCCC29810 膽囊癌細(xì)胞體外侵襲能力的強(qiáng)弱實(shí)驗(yàn)時(shí)我們將其置于盛有自來(lái)水的燒杯中,反復(fù)漂洗幾次,將多余蘇木素洗去再行脫水、透明;這樣做出的細(xì)胞圖片背景潔凈,細(xì)胞清晰。2. 5 脫水和透明時(shí)間脫水時(shí)間各為1 min ,在二甲苯中的時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng),以2 min3 min 為宜;尤其是同時(shí)操作多個(gè)樣本時(shí),時(shí)間過(guò)長(zhǎng)就會(huì)造成局部聚碳酯膜從上室基底部自動(dòng)脫落下來(lái),上室間粘連在一起,造成樣本混淆,實(shí)驗(yàn)失敗。建議在最后一步實(shí)驗(yàn)時(shí)需二人協(xié)做,一人區(qū)分并取出樣本,一人當(dāng)心將聚碳酯膜自上室基底切取下來(lái),置載玻片上中性樹(shù)脂封片并及時(shí)編號(hào)。2. 6 細(xì)胞計(jì)數(shù)當(dāng)實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞為圓形時(shí),實(shí)驗(yàn)人員容易將聚碳酯膜上小孔誤認(rèn)為細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。我們?cè)谧鱒E