自由基的檢測

1、自由基檢測方法自由基檢測方法收稿日期：20070430趙寶洪1高洪1*(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201 ; 2.海關(guān)總署緝私局瑞麗緝毒犬基地,云南瑞麗 678600)摘 要：自由基是含有未成對電子的原子、 分子或原子團(tuán)，它是線粒體在電子傳 遞的過程中產(chǎn)生的，正常情況下，機(jī)體的自由基清除系統(tǒng)可使自由基的產(chǎn)生與消 除保持在極低的動態(tài)平衡水平上，對機(jī)體是有利的，但當(dāng)體內(nèi)蓄積過量自由基時， 它能損傷細(xì)胞，導(dǎo)致動物組織或細(xì)胞的氧化，損害細(xì)胞膜上的脂類和蛋白質(zhì)等， 從而使細(xì)胞膜黏度增加，流動性下降，抗氧化酶喪失活性，造成膜內(nèi)外離子交換 紊亂等，致使細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，黃嘌呤氧化酶活性

2、升高，又進(jìn)一步加速自由基 的產(chǎn)生。為提高自由基對動物機(jī)體損傷的診斷效率， 近年來自由基檢測方法在病 理學(xué)、生物學(xué)中發(fā)展迅速，并得到了廣泛應(yīng)用。關(guān)鍵詞：自由基；檢測方法；概述自由基(free radicals, FRs)化學(xué)反應(yīng)性極強(qiáng)，極不穩(wěn)定，半衰期短，其化學(xué) 反應(yīng)性的特點(diǎn)是連鎖反應(yīng)，一經(jīng)啟動即可連續(xù)發(fā)生。從生物學(xué)角度講，通常所說 的FRs主要是指活性氧(active oxygen)，即氧的某些代謝產(chǎn)物和一些反應(yīng)的含氧 產(chǎn)物。由于FRs具有活潑的化學(xué)反應(yīng)特性，因而在生物體內(nèi)具有重要的生理及 病理功能，具有重要的生物學(xué)意義14。自1900年，Gomberg M首次證實(shí)三苯甲 基自由基以來，自由基

3、參與生命過程中許多重要的生化反應(yīng)逐步為人們所認(rèn)識， 特別是隨著現(xiàn)代檢測分析技術(shù)的日新月異，自由基在生物和病理學(xué)領(lǐng)域的作用研 究迅速發(fā)展。而尋求簡便、快速、準(zhǔn)確、高效的自由基檢測方法成為研究自由基 生物學(xué)作用的關(guān)鍵5。與醫(yī)學(xué)密切相關(guān)的自由基是氧自由基(oxygen free radical, OFR)，包括超氧 陰離子和羥自由基，大量研究結(jié)果表明自由基與許多疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián) 系，特別是與生物膜損傷的關(guān)系更是目前研究的熱點(diǎn)69。自由基已日益受到人們的重視，現(xiàn)將自由基的檢測方法介紹如下。1自由基相關(guān)酶的測定機(jī)體內(nèi)清除自由基的酶系統(tǒng)主要有超氧化物歧化酶(Superoxide dimutaseSO

4、D)、過氧化氫酶(catalase，CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase GSH Px)等酶類組成。在正常情況下，機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的超氧陰 離子自由基被細(xì)胞的SOD歧化為H2O2，后者再由細(xì)胞漿的CAT和GSHPx催 化降解為水和氧。作者簡介：趙寶洪(1982 -)，男，云南紅河州人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)分子病理學(xué)與比較病理學(xué)研究通訊作者1.1 超氧化物歧化酶的測定SOD屬于金屬酶， 分CuZnSOD、MnSOD、FeSOD 3種。由于SOD的底 物超氧陰離子自由基壽命極短， 目前除了應(yīng)用脈沖射解技術(shù)或快速冰凍結(jié)合電 子自旋共振(electron s

5、pin resonance ESR)波譜直接獲得SOD與超氧陰離子自由 基反應(yīng)的動力學(xué)信息外， 一般都采用間接的活力測定法來測定 SOD。 下面介 紹幾種重要的測定方法。1.1.1 鄰苯三酚自氧化法 國外多使用經(jīng)典的鄰苯三酚自氧化法 (簡稱 Marklund 法)，Marklund法是采用420 nm處光吸收測定。酶活力定義為：在一定條件下1mL的反應(yīng)液中，每分鐘控制鄰苯三酚在 420 nm波長的自氧化速率達(dá)50%的酶 量定為 1 個活力單位。顧孔書等對鄰笨三酚自氧化法的測定結(jié)果影響因素進(jìn)行了 探討，結(jié)果鄰苯三酚自氧化法受到溶液的酸堿性、 溫度、 存放時間及鄰苯三酚的 濃度的影響。1.1.2

6、亞硝酸鹽形成法 通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子 自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽， 在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色， 用可見光 分光光度計測其吸光度。當(dāng)被測樣品中含 SOD 時，則對超氧陰離子自由基有專 一性的抑制作用， 使形成的亞硝鹽減少， 比色時測定管的吸光度低于對照管吸光 度，通過公式計算可求出被測樣品中的 SOD 活力。1.1.3 極譜氧電極法 極譜氧電極法利用了系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基過程中 消耗O2, 定量的SOD又會使超氧陰離子自由基歧化產(chǎn)生 O2,從而使耗氧量 減少的特性，使用極譜氧電極儀精確測出耗氧量而推算出酶活力。 SOD 活力單 位定義為：25 C, pH 8

7、.4,使每分鐘產(chǎn)生1卩L O2的SOD量定為1個酶活力 單位。張繼全等在極譜氧電極法測定超氧化物歧化酶活性的改進(jìn)一文中， 對此方 法進(jìn)行了如下修改：室溫測定；酶活性用標(biāo)準(zhǔn) SOD標(biāo)定；反應(yīng)在磷酸鹽 緩沖液中進(jìn)行； 增大鄰苯三酚的用量， 從而克服了易在電極薄膜表面產(chǎn)生氣泡 的問題，測定靈敏度及線性范圍增大。1.2 過氧化氫酶的測定CAT的作用是降解細(xì)胞內(nèi)的H2O2。測定CAT的方法有滴定法、極譜氧電 極法等。高錳酸鉀滴定法，其原理是定量的細(xì)菌同定量的H2O2 發(fā)生反應(yīng)，定時加酸終止反應(yīng)，爾后用高錳酸鉀滴定剩余 H2O2量，從而求得細(xì)菌H2O2酶的量。 唐明忠等在滴定法定量測定細(xì)胞菌過氧化氫酶及在

8、腸桿菌科的應(yīng)用一文中， 采用 高錳酸鉀滴定法定量測細(xì)胞過氧化氫酶， 結(jié)果測得沙雷菌屬、 變形桿菌屬、 摩根 菌屬、耶爾森菌屬、哈夫尼亞菌屬和產(chǎn)氣桿菌的過氧化氫酶活性較高， 普羅菲 登菌屬、一些沙門菌屬、 部分腸桿菌屬和部分克雷伯菌屬的活性居中， 埃希菌屬、 志賀菌屬的活性較低。1.3 谷胱甘肽過氧化物酶的測定GSH Px是一種含硒酶，主要分布在細(xì)胞的胞液及線粒體基質(zhì)中， 測定GSH- Px活力常用的方法是Hafeman法及其改良法，可以直接測定酶促反應(yīng)中GSH的 減少量，以此來計算GSHPx的活力單位，還可用偶聯(lián)法測 GSH Px活力，但該 法對試劑要求較嚴(yán)，難以推廣。2 化學(xué)發(fā)光測定早在10

9、0多年之前，Dubois(1885)已提出生物發(fā)光是由熒光素酶與熒光素的 化學(xué)反應(yīng)引起的。Harvey經(jīng)過40多年的研究，于1952年發(fā)表了生物發(fā)光”專著 隨著生物發(fā)光研究的不斷深入， 發(fā)現(xiàn)機(jī)體的器官、 組織、細(xì)胞乃至大分子物質(zhì)都 在發(fā)光，不過其發(fā)光強(qiáng)度很弱，稱之為超弱發(fā)光或低水平的化學(xué)發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光的原理是從一個化學(xué)反應(yīng) (一般是氧化反應(yīng) )中獲得能量，使反應(yīng)物 或產(chǎn)物分子的電子激發(fā)， 形成電子激發(fā)態(tài)， 當(dāng)返回基態(tài)時， 以發(fā)射光子的形式釋 放能量，這一過程稱為化學(xué)發(fā)光(chemiluminescenee CL)。因其不需外來光源激 發(fā)便能發(fā)光，特稱為化學(xué)冷光， 可以用發(fā)光檢測裝置定量測定。

10、魯米諾 (luminol,3 - 氨基苯二甲酰肼 )及其衍生物，如異魯水諾，是常用的化學(xué)發(fā)光劑，在有氧化劑， 如氧、出02、陰離子自由基以及其他過氧化物存在下，化學(xué)發(fā)光劑可以被氧化， 產(chǎn)生電子激發(fā)態(tài)的中間產(chǎn)物，當(dāng)其返回基態(tài)時，即產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。 Allen R C 等 (1972) 首先發(fā)現(xiàn)了吞噬細(xì)胞在其吞噬活動中產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，自此開創(chuàng)了 化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)研究中的新局面。國外學(xué)者Kato T等早在1981 年就進(jìn)行了全血化學(xué)發(fā)光分析法的研究， 發(fā)現(xiàn)血液粒細(xì)胞在全血化學(xué)發(fā)光中居首 要地位，其次是血小板，井證實(shí)環(huán)氧酶不參與粒細(xì)胞產(chǎn)生的CL，而參與血小板產(chǎn)生的CL。隨后，Heher

11、er M等應(yīng)用該方法對急性炎癥患者和惡性腫瘤患者的 全血進(jìn)行了化學(xué)發(fā)光的分析，結(jié)果表明，這兩組患者的比CL(即每103個粒細(xì)胞 的 CL 活性)均較正常人顯著升高， 其中急性炎癥患者的總 CL 活性高于惡性腫瘤 組。 0kuda M 等用魯米諾溶液灌注離體的大鼠心臟和肝臟， 以檢查缺血再灌注期 間心和肝的魯米諾增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化， 結(jié)果表明，注入魯米諾并不影響 器官生理參數(shù)， 但缺血會即刻引起化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度下降， 爾后增高， 再灌注后使化 學(xué)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，然后逐漸下降。 S0D 能抑制心臟缺血再灌注期化學(xué)發(fā) 光強(qiáng)度的增高， 而 CAT 則不能。 對于肝臟， S0D 既能抑制缺血期化學(xué)

12、發(fā)光強(qiáng)度 的增高，也能抑制再灌注期化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的增強(qiáng)， 使肝臟的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度連續(xù)保 持在低水平狀態(tài)，而 CAT 只能抑制再灌注期化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的增高 1314。3 熒光分光光度法測定自由基的中間產(chǎn)物不飽和脂肪酸是自由基的易攻目標(biāo)之一， 氧自由基作用于脂質(zhì)的不飽和脂肪 酸，生成過氧化脂質(zhì) .后者在酸性條件 (最適 pH 4.0)，加熱分解成丙二醛 (malondialdehyde， MDA) ，作為脂質(zhì)過氧化的次級產(chǎn)物， MDA 再與硫代巴比妥 酸(thiobarbituric acid，TBA)縮合，生成紅色產(chǎn)物，然后進(jìn)行比色，以此來估測樣 品中過氧化脂質(zhì)的含量，進(jìn)而了解體內(nèi)如某組織，細(xì)胞或血清

13、脂質(zhì)過氧化狀況。 以上方法稱為硫代巴比妥酸法， 因為硫代巴比酸具有熒光， 故在比色基礎(chǔ)上發(fā)展 成為熒光法，靈敏度提高了 10倍以上，所需樣品量減少，激發(fā)波長為 515 nm， 熒光波長為553 nm。此法主要用于檢測脂質(zhì)自由基。4 電子自旋共振技術(shù)與自旋捕捉法由于自由基具有生物半衰期極短、在生物體內(nèi)的濃度很低等特點(diǎn)，故要直接 檢測它們非常困難。目前只有電子自旋共振(ESR)技術(shù)能直接檢測到自由基，該 技術(shù)是最常用、最有效的檢測方法，該方法的原理比較復(fù)雜，簡要地說，因為自 由基具有1個或1個以上不成對的電子，ESR法就是依賴于樣品中存在的未配對 電子，其基本概念可用1個未配對的電子來描述，即1個

14、帶電而且自旋的電子猶 如一個小磁鐵，具有一個磁偶極矩，根據(jù)量子力學(xué)理論，未配對電子在外磁場只 可能有與外磁矩平行與反平行的兩種不同取向的磁矩，其相應(yīng)能量一個為高能 級，一個為低能級，當(dāng)外加一個特定的高額磁場時，低能級的未配對電子則從高頻磁場吸收能量躍遷至高能級，這就產(chǎn)生電子能與輻射能場共振， 將這種能量吸 收變?yōu)殡娦盘栠M(jìn)行放大檢測，則得到ESR信號，獲得的譜圖稱為ESR波譜。測定健康的和患子宮癌的子宮頸和子宮內(nèi)膜樣品的ESR波譜表明，正常子宮和內(nèi)膜的冰凍粉末樣品均產(chǎn)生很強(qiáng)的 ESR信號，而子宮癌樣品的相應(yīng)信號則很弱， 甚至不能檢出。自從1954年美、法學(xué)者將ESR技術(shù)首次引入生物學(xué)研究領(lǐng)域以

15、來，ESR分析方法在生命科學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用，尤其是在氧自由基檢測方面多見報道。肖華山等人應(yīng)用ESR和自旋捕捉劑相結(jié)合直接測定了過硫酸胺N，N, N', N四甲基二胺(APTEMED)體系產(chǎn)生的氧自由基，經(jīng)計算機(jī)波譜模擬和計 算渡譜參數(shù)證實(shí)該體系產(chǎn)生的氧自由基是超氧陰離子自由基和羥自由基。陳越等15應(yīng)用ESR技術(shù)觀察了 Ge132對機(jī)體免疫器官氧自由基含量的影響，證實(shí)了 Ge- 132能降低健康雛雞胸腺、法氏囊和脾臟中氧自由基含量，Ge132是體內(nèi)氧自由基的清除劑。于玲范等16在低溫下應(yīng)用ESR技術(shù)直接檢測了大劑量維生素 D2 致大鼠心肌損傷時肌中氧自由基含量變化，并觀察到L甲硫氨

16、酸對受損心肌具有保護(hù)作用。廖維靖等17等首次報道了用ESR技術(shù)檢測到坐骨神經(jīng)受損時氧自 由基含量升高。馬杰等以家兔為模型，通過ESR波譜儀觀察到實(shí)驗動物發(fā)生遲發(fā)性腦血管痙攣時腦脊髓液中氧自由基含量增高，并且腦脊髓液氧自由基的ESR檢測結(jié)果與腦脊髓液丙二醛(MDA)含量測定結(jié)果之間有高度相關(guān)性(r= 0.88, P<0 01)。5熒光法Paritam K D等18應(yīng)用熒光法顯示了潮藻 chatlonellaanttiqua產(chǎn)生的O 需 要熒光探針 3,7dihydro64(2(N(5fluroresceinyl)thioureido)ethory)phenyl2- methylimidaz

17、o(1,2a)pyrazi n3o ne(FCLA)作為超氧陰離子自由基和氧自由基的特異 性檢測試劑，在20 C與潮藻共同孵育10 min之后，將之涂于載玻片上，加蓋玻片，在氬氣激光掃描顯微鏡下現(xiàn)察發(fā)熒光 的部位，即超氧陰離子自由基的產(chǎn)生部位。 FCLA在532 nm處有一吸收帶，氬 氣激光，488 nm作為激發(fā)光。這一過程可被 SOD完全抑制。6分析羥化產(chǎn)物法羥自由基(hydroxy radical，OH-)能與許多有機(jī)化合物，尤其芳香族化合物發(fā) 生羥化反應(yīng)，通過測定反應(yīng)體系的羥化產(chǎn)物生成量，間接檢測OH含量19。例如， 在OH作用下，苯甲酸被羥化為水楊酸(羥基苯甲酸)，后者產(chǎn)量可通過分光光

18、度 法、熒光法等測得，從而間接得到 OH含量，該法被認(rèn)為是檢測OH比較專一的 方法。賈之慎等應(yīng)用比色法通過測得 OH與水楊酸反應(yīng)生成的羥基化產(chǎn)物 2,3二 羥基苯甲酸含量（5l0nm），間接測得反應(yīng)體系的0H生成量，并認(rèn)為該方法使用 簡便，易為一般實(shí)驗室采用。周建政等2021應(yīng)用高效液相色譜電化學(xué)聯(lián)合法檢 測反應(yīng)體系產(chǎn)生的0H，即利用水楊酸捕獲0H，通過測得生成物二羥基苯甲酸 間接測定0H的含量。方法簡便，靈敏度高，專一性好。7氣相色譜法自由基的檢測中，氣相色譜法主要用于測定 0H含量。0H與甲硫基丙醛反 應(yīng)產(chǎn)生乙烯，或與二甲基亞砜反應(yīng)產(chǎn)生甲烷，因此可以將甲硫基丙醛或二甲基亞 砜加入到一定的反應(yīng)體系。應(yīng)用氣相色譜儀檢測所生成的乙烯或甲烷， 判斷該反 應(yīng)體系有無0H生成以及測定0H的相對含量，但是，甲硫基丙醛也能與其他自 由基如超氧陰離子自由基反應(yīng)產(chǎn)生乙烯， 二甲基亞砜與0H作用生成的甲烷量也 降低，因此，許多學(xué)者注意到氣相色譜法測定 0H的專一性問題。Ric