細(xì)胞的離體培養(yǎng)

1、第一篇 組成人體的細(xì)胞第四章 細(xì)胞培養(yǎng)人體是由多細(xì)胞構(gòu)成的整體， 在整體條件下要研究單個細(xì)胞或某一群細(xì)胞 在體內(nèi)in vivo的功能活動是十分困難的。但是如果把活細(xì)胞拿到體外in vitro 培養(yǎng)進(jìn)行觀察和研究， 那么要方便得多。 活細(xì)胞離體后于模擬體內(nèi)生理環(huán)境等特定 的體外條件下， 進(jìn)行孵育培養(yǎng)使之生存并增殖和進(jìn)行生理活動， 這一過程就稱為 細(xì)胞培養(yǎng)cell culture或細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)cell culture technique第一節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)概述一、細(xì)胞培養(yǎng)的根本概念 細(xì)胞培養(yǎng)是從體內(nèi)組織取出細(xì)胞并在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下， 使之生存、生長、繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。二、體外培

2、養(yǎng)細(xì)胞的條件模擬細(xì)胞在體外能否生存以及生活質(zhì)量的好壞嚴(yán)格依賴于所提供的這種人工模 擬環(huán)境是否與體內(nèi)的生理環(huán)境一致或相似。 概括說來，這種人工模擬的生存環(huán)境 主要包括營養(yǎng)、溫度、滲透壓、 pH 等幾方面的因素。一營養(yǎng)需求體外培養(yǎng)細(xì)胞時， 營養(yǎng)需求是滿足其生存、 生長增殖的首要條件。 而細(xì)胞培 養(yǎng)基便是在體外培養(yǎng)細(xì)胞時供應(yīng)細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞生長增殖的根底物質(zhì)。1細(xì)胞對營養(yǎng)的需求離體培養(yǎng)細(xì)胞對營養(yǎng)的需求根本上與在體相同，主要包括氨基酸、糖類、無機(jī)鹽類、維生素、蛋白質(zhì)、脂類等幾個方面。1氨基酸既是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料，也是細(xì)胞重要的能量來源，氨基 酸的種類及數(shù)量影響著細(xì)胞的密度、 增殖、活力等諸多方面

3、。 幾乎所有的細(xì)胞均 需要以下 12 種氨基酸：精氨酸、纈氨酸、酪氨酸、組氨酸、色氨酸、蘇氨酸、 苯丙氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、胱氨酸。 2用于細(xì)胞培養(yǎng)糖類物質(zhì)主要有葡萄糖和半乳糖，其中以葡萄糖最為多 用。糖類物質(zhì)是細(xì)胞最主要的能量來源，同時也是生物合成核酸、氨基酸、脂類 物質(zhì)重要的碳源。3無機(jī)鹽對于根底培養(yǎng)基滲透壓的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，同時還對細(xì)胞跨膜電 位的調(diào)節(jié)、 細(xì)胞附著以及一些酶的活性調(diào)節(jié)具有重要作用。 經(jīng)常添加的無機(jī)鹽離 子主要有鈉、鉀、鎂、磷、鈣等。4維生素是諸多細(xì)胞代謝活動重要的輔酶，嚴(yán)重影響著細(xì)胞的活力與增殖。生物素、葉酸、煙酰胺、核黃素、維生素 C、維生素B12、吡哆

4、醇等都是培養(yǎng) 基需要添加的成分，尤其以B族的維生素常見。5血清是一個包含大量蛋白以及多種生長因子、激素、氨基酸、糖、胰 蛋白酶抑制劑、脂類物質(zhì)、無機(jī)鹽、微量元素等的非常復(fù)雜的混合物。最常用的 血清主要有胎牛血清fetal bovine serum, FBS、新生牛血清newborn calf serum, NCS、小牛血清calf serum, CS、馬血清、豬血清以及人血清。6脂肪酸和脂類物質(zhì)也常有血清提供， 尤其被一些特定的細(xì)胞系所必需。 例如，用于培養(yǎng)膽固醇依賴的雜交瘤的培養(yǎng)基就需要添加一定量膽固醇。7微量元素常被添加給那些無血清培養(yǎng)基，以彌補(bǔ)因未添加血清所造成 的微量元素缺失或缺乏，主

5、要有鋅、銅、硒等。其中硒對于去除培養(yǎng)基中的由代 謝產(chǎn)生的自由基具有重要作用。2培養(yǎng)基 用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的種類很多，按其物質(zhì)狀態(tài)分為半固體 培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類；按其來源分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1天然培養(yǎng)基：在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)開展的早期，所用的細(xì)胞培養(yǎng)基多是來 自于淋巴液、血漿、血清以及各種組織提取液，常被稱為天然培養(yǎng)基。目前最普 遍使用的天然培養(yǎng)基是血清， 以胎牛血清、 新生牛血清和小牛血清最為常見。 但 這種天然的培養(yǎng)基常被作為添加劑與合成培養(yǎng)基合用，常見的血清添加比例為5% 20%。2合成培養(yǎng)基：是在對細(xì)胞培養(yǎng)時所需各種營養(yǎng)仔細(xì)研究的根底之上， 根據(jù)細(xì)胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量嚴(yán)格配制而

6、成的。 包括碳水化合物、 氨基酸、 脂 類、無機(jī)鹽、維生素、微量元素和細(xì)胞生長因子等。根本培養(yǎng)基。早期研制的 合成培養(yǎng)基單獨(dú)使用雖能使細(xì)胞生存但往往不能很好的生長增殖， 需要添加一定 量的血清才能成為真正的 “完全培養(yǎng)基 ，故常將其稱為根本培養(yǎng)基，常見的 MEM、DMEM、RPMI1640、199等均屬此類；無血清培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基是一種不需要添加血清就可維持培養(yǎng)細(xì)胞存活、 生長、增殖的合成培養(yǎng)基。 無 蛋白培養(yǎng)基。 目前，這種無蛋白培養(yǎng)基的研制是對通過添加植物水解物來代替動 物激素、生長因子等的作用來飼養(yǎng)細(xì)胞的； 限定化學(xué)成分培養(yǎng)基。 限定化學(xué)成 分培養(yǎng)基同樣是一種不含動物蛋白的培養(yǎng)基，

7、和無蛋白培養(yǎng)基不同點(diǎn)在于其沒有 添加植物水解物， 而是使用了一些結(jié)構(gòu)和功能的小分子化合物。 因此， 這種 培養(yǎng)基的所有成分都是明確的，是目前研究細(xì)胞分泌產(chǎn)物的一種最正確培養(yǎng)基。二溫度 體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要在一定的溫度條件下才能存活， 不同細(xì)胞適宜的培養(yǎng)溫 度常由動物種類所決定。 比方，哺乳類動物細(xì)胞包括人類細(xì)胞的理想培養(yǎng)溫度多 在36C37C；鳥類細(xì)胞適宜的培養(yǎng)溫度在385C ;昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)溫度在25C；冷血脊椎動物的培養(yǎng)溫度在 18C25C。培養(yǎng)溫度的不適當(dāng)會嚴(yán)重影響細(xì)胞的存活及生長狀態(tài)。 通常，細(xì)胞對低溫可 有較長時間的忍耐限度， 甚至可在低于適宜溫度一定范圍內(nèi)生長， 但如果培養(yǎng)溫 度高于

8、適宜溫度時如在39C條件下培養(yǎng)人類細(xì)胞，細(xì)胞常會在幾 h內(nèi)便死 亡。因此，定期檢查細(xì)胞培養(yǎng)箱的溫度非常重要。三滲透壓 離體的細(xì)胞必須生長在等滲的液體環(huán)境中才能維持細(xì)胞的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)， 并 有助于細(xì)胞對出入細(xì)胞的物質(zhì)進(jìn)行調(diào)控。 滲透壓的大小主要由培養(yǎng)基中各種鹽成 分的濃度決定。 盡管大多數(shù)細(xì)胞對滲透壓都有一定的耐受性， 但適宜的滲透壓常 會因細(xì)胞的種類及物種來源不同而異。例如，培養(yǎng)人類細(xì)胞的理想滲透壓為 290 mOsm/kg;培養(yǎng)大多數(shù)哺乳類動物細(xì)胞的理想滲透壓多在 260mOsm/kg320 mOsm/kg范圍內(nèi)；培養(yǎng)小鼠細(xì)胞的理想滲透壓多在 320 mOsm/kg左右。四氣相及 pH體外培

9、養(yǎng)的細(xì)胞對氣體環(huán)境也有一定的要求。多數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)時需要O2的存在，但O2的分壓多維持在略低于大氣中的 O2分壓的水平，這是因?yàn)檫^高的 O2分壓會造成細(xì)胞的損傷。CO2也是細(xì)胞培養(yǎng)所需要的，其與培養(yǎng)基 pH值的維 持密切相關(guān)，CO2濃度的升高會引起培養(yǎng)基pH值降低。體外培養(yǎng)細(xì)胞時的氣體 環(huán)境常由95%的空氣和5%的CO2構(gòu)成，針對培養(yǎng)對象的不同，CO2的濃度常在 2 10之間變化。適宜大多數(shù)細(xì)胞生長的培養(yǎng)基pH多維持在之間，而細(xì)胞在培養(yǎng)過程中 所釋放出的代謝產(chǎn)物尤其是C02會造成培養(yǎng)基pH值的迅速下降，很不利于細(xì)胞的 繼續(xù)生長。為了盡可能長時間的將培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定在適當(dāng)范圍，常借助 C02-碳

10、酸氫鹽緩沖體系或有機(jī)緩沖體系 如HEPES來解決這一問題。下面的反響 式可以用來說明C02-碳酸氫鹽緩沖體系的作用原理。+ -NaHC03 + H2O <-> Na + 0H + H2O+CO2 T上式說明，只要維持C02的濃度處于一個相對恒定的狀態(tài)，上述反響就會 保持平衡，此時培養(yǎng)基中的 0 H -的濃度也就會相對穩(wěn)定，換言之，培養(yǎng)基的pH也相對恒定。同時，這也是為什么在培養(yǎng)細(xì)胞時要維持一定濃度C02的重要原因之一。五無毒無污染體外培養(yǎng)的細(xì)胞必須生長在無毒無污染的環(huán)境中， 這時因?yàn)轶w外生長的細(xì)胞 一般情況下對有毒有害物質(zhì)無任何解毒能力， 抵抗力也極差。 細(xì)胞毒性物質(zhì)的存 在常會導(dǎo)

11、致培養(yǎng)細(xì)胞的死亡。除有毒化學(xué)物質(zhì)的污染危害外， 細(xì)菌等微生物的污染， 以及不同細(xì)胞間的交 叉污染也是細(xì)胞培養(yǎng)時必須要防止的事情?？赏ㄟ^嚴(yán)格的過濾除菌或滅菌處理， 并使用抗生素來降低污染的發(fā)生機(jī)率。 在細(xì)胞培養(yǎng)中最常使用的抗生素是青霉素常用濃度是25ug/ml100g/ml與鏈霉素25卩g/ml100卩g/m。不同類型細(xì)胞間的交叉污染主要由操作不當(dāng)引起， 在對不同細(xì)胞進(jìn)行操作時 應(yīng)防止使用同一瓶培養(yǎng)基或使用同一個吸管。第二節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性一、體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型體外培養(yǎng)細(xì)胞時， 主要有兩種培養(yǎng)體系： 一種是貼附依賴型， 一種是懸浮型。一貼附依賴型大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長， 屬于貼壁依賴型細(xì)胞

12、， 依據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞在體外的形 態(tài)大致可將其分為以下四種類型。1上皮細(xì)胞型 細(xì)胞多呈扁平不規(guī)那么多角形，中央有圓形細(xì)胞核，細(xì)胞彼 此緊密相連成單層膜。 生長時呈膜狀移動， 處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連， 很少 單獨(dú)行動。 此型細(xì)胞多起源于內(nèi)、 外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、 消化管 上皮、肝胰、肺泡上皮等。例如，來源于人類胚腎的 HEK293 細(xì)胞，來源于人類 肝臟組織的 HEPG2 細(xì)胞，來源于人類子宮頸的 Hela 細(xì)胞就屬此類。2成纖維細(xì)胞型 胞體多呈梭型或不規(guī)那么三角形，中央有卵圓形細(xì)胞核， 呈放射狀生長。 除真正的成纖維細(xì)胞外， 起源于中胚層間充質(zhì)的組織的心肌、 平 滑肌、成骨細(xì)胞、血

13、管內(nèi)皮等均呈本型形態(tài)。另外，也常將一些與成纖維細(xì)胞形 態(tài)類似的培養(yǎng)細(xì)胞歸為此類。常見的成纖維性細(xì)胞如源自小鼠胚胎的NIH 3T3、小鼠結(jié)締組織的L929、中國倉鼠卵巢的CHO、敘利亞地鼠腎臟的BHK-21等。3游走細(xì)胞型 多呈散在生長，一般不連成片，具有活潑的游走或變形運(yùn) 動能力，且方向不確定。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細(xì)胞進(jìn)行嚴(yán)格區(qū)別。4多型細(xì)胞型 一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞由于難以確定其穩(wěn)定的形態(tài)，常歸 于此類。二懸浮型有一些類型的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時不需要貼附， 而是懸浮生長。 這些細(xì)胞的胞 體常呈圓形，多見于一些造血系腫瘤細(xì)胞，其特點(diǎn)是生長速度較快、傳代方便。 常見的U937、HL60、K5

14、62造血系腫瘤細(xì)胞均屬此類。二、體外培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)細(xì)胞的差異細(xì)胞離體后， 失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互作用的影響， 生活在缺乏 動態(tài)平衡的相對穩(wěn)定環(huán)境中， 體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞已成為一種在特定條件下生長 的細(xì)胞群體。 它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的根本結(jié)構(gòu)和功能， 也出現(xiàn)了一些不 同于機(jī)體細(xì)胞的性狀，主要表現(xiàn)在：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。如，體外 培養(yǎng)的肌肉細(xì)胞表現(xiàn)出纖維化的特點(diǎn)； 分化減弱或不顯， 出現(xiàn)類似 “返祖現(xiàn)象 去分化，細(xì)胞的形態(tài)功能趨向單一化，或在生存一定時間后衰退死亡；發(fā) 生轉(zhuǎn)化獲得不死性， 變成可無限生長的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系， 或變成具有惡 性性狀的細(xì)胞群。三、培養(yǎng)細(xì)胞的

15、生長特點(diǎn)一貼附大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞在體外生長時需附著在一定底物如塑料、 膠原、玻璃或 其他細(xì)胞做成的飼養(yǎng)層細(xì)胞上才能生長、分裂。貼附之前的細(xì)胞一般為球體樣，在一些特殊的能促進(jìn)細(xì)胞貼附的物質(zhì)如川型膠原、血清擴(kuò)展因子的幫助下，細(xì)胞先吸附到底物上，隨后與底物附著并伸展成一定的形狀。不同細(xì)胞的貼附能力不同， 如巨噬細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞等的貼附能力較強(qiáng)， 能 在數(shù) min 至數(shù) 10min 內(nèi)貼附到固相外表；而神經(jīng)元、羊水細(xì)胞等的貼附能力那么 較弱，一般需要數(shù) h 乃至更長的時間才能貼附到固相外表。(二)接觸抑制與密度依賴性 對于相當(dāng)一局部體外培養(yǎng)的貼附細(xì)胞來說，隨著細(xì)胞不斷的生長與分裂，當(dāng) 相鄰兩個細(xì)胞彼

16、此靠近時，其中之一或兩個細(xì)胞便會停止移動而不至于重疊起 來，轉(zhuǎn)而朝向未生長有細(xì)胞的空間生長，這種現(xiàn)象被稱為接觸抑制(contactinhibition )。而進(jìn)一步的生長會使細(xì)胞密度變得越來越大直至形成一個細(xì)胞單層， 在此過程中， 細(xì)胞與培養(yǎng)基接觸的面積也會因此而減少， 此時，細(xì)胞的分裂便會 停止，但細(xì)胞還會存活一段時間，這種現(xiàn)象被稱為密度抑制(density inhibition )或密度依賴性。通常，細(xì)胞的這種密度依賴性與培養(yǎng)基中血清的濃度關(guān)系密切。與體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞不同， 轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡變的腫瘤細(xì)胞的接觸抑制特性降 低或喪失， 導(dǎo)致細(xì)胞重疊生長。 同時， 轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡變的腫瘤細(xì)胞的密度依

17、賴性 調(diào)節(jié)也常常降低，對血清的依賴性也降低， 可以生長到一個較高的終末細(xì)胞密度。四、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程體外生長的培養(yǎng)細(xì)胞受營養(yǎng)條件、 生長空間等因素的限制， 當(dāng)細(xì)胞增殖到達(dá) 一定密度后， 那么需要別離出一局部細(xì)胞和更新營養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)， 此過程稱傳 代(subculture)。每次傳代以后，細(xì)胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。 加之很多細(xì)胞特別是正常細(xì)胞， 其在體外的生存也不是無限的過程， 這就使得細(xì) 胞在體外培養(yǎng)時的生長過程與體內(nèi)有著一系列不同的生存特點(diǎn)。(一) 培養(yǎng)細(xì)胞的生命期培養(yǎng)細(xì)胞生命期(life span of culture cells)是細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長 的時間

18、。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與完整機(jī)體的死亡衰老根本一致。 體外培養(yǎng)細(xì)胞 的生命期與細(xì)胞的種類、 性狀和原供體的年齡等情況密切相關(guān)。 比方，來源自人 胚的二倍體成纖維細(xì)胞可在體外連續(xù)傳代 3050代，約150300個細(xì)胞增殖周 期，相當(dāng)于一年左右的生存時間。 相比之下， 那些來自成體或衰老個體的細(xì)胞的 生存時間那么較短，如體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞或腎細(xì)胞一般僅能傳幾代或十幾代。通常，體外培養(yǎng)細(xì)胞的全部生命期大致可被分為三個階段。1原代培養(yǎng)期 原代培養(yǎng)也稱初代培養(yǎng)，是從機(jī)體中取出細(xì)胞接種培養(yǎng)到 第一次傳代之前的這一階段。 此期的細(xì)胞呈現(xiàn)出活潑移動的特點(diǎn)， 可見細(xì)胞分裂， 但不旺盛。處于原代培養(yǎng)階段的細(xì)胞與體內(nèi)

19、原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上有很 大的相似性。 細(xì)胞群具有明顯的異質(zhì)性， 細(xì)胞間的相互依存性強(qiáng)， 在軟瓊脂培養(yǎng) 基培養(yǎng)時細(xì)胞集落形成率很低。2傳代期 傳代期通常是培養(yǎng)細(xì)胞全生命期中持續(xù)時間最長的時期，原代 培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)傳代后常被稱做細(xì)胞系(cell line)。一般情況下，正常體細(xì)胞在 傳代 10-50 次左右后，細(xì)胞分裂的能力就會逐漸減弱，甚至完全喪失，細(xì)胞便進(jìn) 入衰退期。3衰退期 處于衰退期的培養(yǎng)細(xì)胞，增殖速率已經(jīng)變得很慢或不再增殖， 直至最后衰退死亡。以上主要是針對體外培養(yǎng)的機(jī)體正常細(xì)胞， 對于體外發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和腫瘤 細(xì)胞而言，永生性(immortality )或惡型性(maligna

20、ncy)的獲得使得這類細(xì)胞 獲得持久性的增殖能力，這樣的細(xì)胞群體常被稱為無限細(xì)胞系( infinite cell line ) 或連續(xù)細(xì)胞系( continuous cell line)。(二) 培養(yǎng)細(xì)胞的一代生存期所謂培養(yǎng)細(xì)胞的 “一代生存期 ，是從細(xì)胞接種后到再次傳代培養(yǎng)之前的這 一段時間，它與細(xì)胞世代(gen eration)或倍增(doubli ng)時間不同。例如，某 一細(xì)胞系為第 60 代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代了 60次。就培養(yǎng)細(xì)胞的一代生存 期而言，細(xì)胞通?？梢员对?6次。培養(yǎng)細(xì)胞的一代生存期，一般可被分為三個階段。1潛伏期 以貼壁生長的培養(yǎng)細(xì)胞為例，剛剛經(jīng)歷傳代接種的細(xì)胞，常

21、在 培養(yǎng)基中呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)，此時細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。緊接著，懸浮 細(xì)胞便會貼附于底物外表上， 此過程稱貼壁。 各種細(xì)胞貼附速度并不相同， 這與 培養(yǎng)細(xì)胞的種類、 培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。 待細(xì)胞貼附于支持 物后，細(xì)胞便開始進(jìn)一步伸展成極性細(xì)胞， 但這距離細(xì)胞進(jìn)入生長和增殖期還有 一定時間，稱為潛伏期(late nt phase。細(xì)胞潛伏期的長短與細(xì)胞接種密度、細(xì) 胞種類以及培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。通常，原代培養(yǎng)細(xì)胞的潛伏期較長，約需2496h或更長時間，而連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞的潛伏期那么較短，僅624h。另外，細(xì)胞接種密度大時潛伏期常會變短。2對數(shù)生長期 當(dāng)細(xì)胞分裂相開始

22、出現(xiàn)并逐漸增多，便標(biāo)志著潛伏期的結(jié) 束和對數(shù)生長期logarithmic growth phase的開始。對數(shù)生長期是細(xì)胞增殖分 裂最旺盛的階段。 對數(shù)生長期細(xì)胞分裂相數(shù)量的多少常作為判定細(xì)胞生長旺盛與 否的一個重要標(biāo)志，一般用分裂指數(shù)mitotic index , Ml來表示：分裂相在整 個細(xì)胞群中所占的百分比。體外培養(yǎng)細(xì)胞的分裂指數(shù)受細(xì)胞種類、培養(yǎng)液成分、 營養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)多介于 0.1%0.5%之間，原代細(xì)胞分裂指數(shù)較低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高 達(dá) 3%5%。對數(shù)增生期是細(xì)胞一代生存期中活力最好的時期， 因此是進(jìn)行各種 實(shí)驗(yàn)最好的和最

23、主要的階段。3停滯期當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期stagnatephase。此時細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺期plateau phase 。處于此期的細(xì)胞雖不增殖， 但仍有代謝活動， 但隨著培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡， 代 謝產(chǎn)物的積累、 pH 值的降低，此時需要進(jìn)行及時的傳代培養(yǎng)，否那么細(xì)胞會因營 養(yǎng)匱乏、中毒等原因，發(fā)生形態(tài)改變，重那么從底物脫落死亡。第三節(jié) 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)一、原代培養(yǎng)將動物機(jī)體中待培養(yǎng)組織從機(jī)體中取出， 然后用各種消化性酶 如胰蛋白酶 消化，或用機(jī)械方法處理，將組織別離成單細(xì)胞，最后添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基培養(yǎng)， 使細(xì)胞得以生存、 生長和繁殖， 這一過程稱原代

24、培養(yǎng)。 原代培養(yǎng)的細(xì)胞由于其和 機(jī)體細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)、 功能等方面非常接近， 常被用作藥理實(shí)驗(yàn)重要的研究材料。一所需設(shè)備與試劑超凈工作臺、 細(xì)胞培養(yǎng)箱、 離心機(jī)、離心管、 倒置顯微鏡、 普通光學(xué)顯微鏡、 吸管、廢液缸、培養(yǎng)瓶、平皿、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計(jì)數(shù)板、水浴鍋37C、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng) 基添加有20%的FBS、Hanks液、75%酒精溶液、碘酒等。培養(yǎng)對象：新生小鼠的肝細(xì)胞。(二) 操作步驟 1胰蛋白酶消化法(1) 將新生小鼠拉頸椎致死，置 75%酒精泡2-3s,再用碘酒消毒腹部，用 紗布將小鼠包裹后帶入超凈臺內(nèi)，解剖取肝

25、臟，放入一玻璃平皿中。(2) 用Hanks液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物，然后用 手術(shù)剪將肝臟剪成1mm3大小的組織塊，再用Hanks液洗三次。(3) 將組織塊轉(zhuǎn)移至一小青霉素瓶中，視組織塊的多少參加56倍體積的 0.25% 37C預(yù)溫的胰蛋白酶消化液中消化。( 4)待大局部細(xì)胞被消化成為單細(xì)胞后， 參加 3 5ml 培養(yǎng)液及時終止胰酶 的消化作用。(5) 將上述細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至一離心管中，lOOOrpm,離心5min，棄上清液。(6) 參加Hanks液5ml，重懸細(xì)胞，然后重復(fù)上一步驟。( 7)參加 1 2ml 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。(8)在細(xì)胞計(jì)數(shù)的根底之上，

26、利用培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整到5X105個/ml左右，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移(分裝)至相應(yīng)大小的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱 中37r培養(yǎng)。2組織塊法(1) 第 1、2步與胰酶消化法相同。(2) 將用Hanks洗滌后的組織塊直接轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附在培養(yǎng)瓶的底面 (凹面，生長面)。(3) 將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)， 使培養(yǎng)瓶的生長面朝上， 然后參加適量培養(yǎng)基至瓶中， 應(yīng)防止培養(yǎng)液與組織塊接觸。(4) 將培養(yǎng)瓶小心轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37C靜置23h，然后輕輕翻轉(zhuǎn) 培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)瓶的生長面組織浸入培養(yǎng)液中(勿使組織漂起)，繼續(xù)培養(yǎng)。3考前須知( 1 )自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件，細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán) 境中進(jìn)

27、行。2) 75%酒精泡消毒的時間不宜過長，以免酒精從口和肛門浸入小鼠體內(nèi)3待到組織塊周圍長出單細(xì)胞層后將組織塊剔除，便可收獲細(xì)胞或進(jìn)行 傳代培養(yǎng)。4胰蛋白酶消化的時間長短與組織細(xì)胞的幼嫩程度、 數(shù)量以及酶的活力 等因素密切相關(guān)，另外在消化過程中應(yīng)密切觀察，及時吹打，防止消化過度。二、細(xì)胞傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密的單層后， 通常已經(jīng)沒有足夠的生長空間和營養(yǎng)條 件滿足細(xì)胞進(jìn)一步生長的需求。為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時使細(xì)胞的數(shù)量擴(kuò)大， 就必須進(jìn)行傳代再培養(yǎng)。 同時，傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法， 也 是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。 通常，懸浮型細(xì)胞可通過直接補(bǔ)充培 養(yǎng)基后再分瓶

28、的方法進(jìn)行傳代， 方法相對簡單， 而貼壁細(xì)胞那么需經(jīng)消化后才能分 瓶培養(yǎng)。一所需設(shè)備與試劑 超凈工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)、離心管、倒置顯微鏡、吸管、廢液缸、 培養(yǎng)瓶、移液管、添加有 0.02%EDTA 的 0.25%胰蛋白酶消化液、 RPMI 1640 細(xì) 胞培養(yǎng)基添加有 10FBS、 Hanks 液等。二操作步驟1貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)1將長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。2參加12ml 0.25%胰酶溶液，使所有細(xì)胞都能被浸入到溶液中，室溫 或37C消化。 3利用倒置顯微鏡或肉眼觀察細(xì)胞的消化狀況。隨著時間的推移，原本 貼壁的細(xì)胞會逐漸變圓，并開始脫落。4待到消化充分后，及時參加 10ml

29、 Hanks 液終止消化。5 用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，轉(zhuǎn)移至一離心管中，1000rpm,離 心5min，棄上清液。6用 1015ml 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并將其分裝到兩至三個培養(yǎng)瓶中，37 C下繼續(xù)培養(yǎng)。7過夜觀察細(xì)胞的貼壁及生長狀況。2懸浮生長細(xì)胞的傳代培養(yǎng)懸浮生長細(xì)胞的傳代培養(yǎng)要比貼壁細(xì)胞簡單得多，通常有兩種方法。1直接給帶傳代的培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充一定量的新鮮培養(yǎng)基， 然后將進(jìn)行分裝。2先通過離心棄掉營養(yǎng)匱乏的舊培養(yǎng)基，然后再用適量的新鮮培養(yǎng)基重 懸細(xì)胞沉淀，最后將其分裝至培養(yǎng)瓶中即可。3考前須知1傳代的比例取決于細(xì)胞的生長狀態(tài)、生長速度以及實(shí)驗(yàn)的目的要求等 因素，通常按照 1：2 或 1

30、：3 的比例進(jìn)行傳代。2防止消化過度。三、附錄一胰蛋白酶消化液的配制精確稱取0.25克胰酶蛋白酶活力為1: 250,參加100ml不含Ca2+、Mg2+ 的Hanks液溶解，濾器過濾除菌，4C保存。胰酶溶液中也可參加EDTA，其終 濃度為 0.02。二Hanks液的配制KH 2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄 糖 1.0g, Na2HPO4H2O 0.06g,酚紅0.02g,力卩H2O至1000ml，過濾除菌或高壓滅菌， 分裝后4 °C保存。三血清的滅活與融化1 血清的滅活方法1將水浴鍋的溫度設(shè)置在56C，待水溫恒定后將血清瓶放

31、入到水浴鍋中， 勿使瓶子倒置和淹沒在水中。2待水溫重回56C后，計(jì)時滅活30min，每隔10min輕輕晃動血清瓶。3無菌分裝，-20 C凍存4注意：滅活時間不要超過30mi n；滅活后的血清外觀會發(fā)生改變；2滅活后血清的融化1將水浴鍋的溫度設(shè)置在 30C。2從冰箱取出凍存的滅活血清，室溫條件下先放置10min(3) 將分裝有滅活血清的瓶子放入到 30°C水浴鍋中，勿使瓶子倒置和淹沒 在水中。每 10min 輕輕晃動瓶子有助于使其均勻融化并減少沉淀的形成。(4) 待其完全融化后，按一定用量將其參加到相應(yīng)的培養(yǎng)基中。(5) 注意：有人選擇37C融化血清，但一般而言，溫度越高，營養(yǎng)成分 降

32、解得越厲害；滅活后的血清不宜反復(fù)凍融。第四節(jié) 細(xì)胞系或細(xì)胞株的建立、鑒定、管理原代代培養(yǎng)物經(jīng)第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，常被稱為細(xì)胞系( cell line) 。 由某一細(xì)胞系別離出來的、 在性狀上與原細(xì)胞系有一定差異的細(xì)胞系， 常被稱為 該細(xì)胞系的亞系(subline)。從一個經(jīng)過鑒定的細(xì)胞系采用選擇法或單細(xì)胞克隆 進(jìn)一步所得到的細(xì)胞群，常被稱細(xì)胞株(cell strai n)。由原細(xì)胞株進(jìn)一步別離培 養(yǎng)出的與原株性狀不同的細(xì)胞群，又被稱為亞株(substrain)。一、細(xì)胞建系的一般程序細(xì)胞建系的一般程序包括原代培養(yǎng)、 第一次傳代、常規(guī)傳代、 凍存與復(fù)蘇等 過程。所涉及的原代培養(yǎng)、第一次傳代、

33、常規(guī)傳代、凍存與復(fù)蘇等過程的具體方 法與常規(guī)的原代培養(yǎng)等技術(shù)并無二樣。相對于那些只需要提供供體性別、 年齡、取材部位、 組織種類以及幾項(xiàng)簡單 指標(biāo)的僅用作原代培養(yǎng)的細(xì)胞而言，對于用于建系的細(xì)胞通常有以下一些要求：(一) 細(xì)胞的組織來源應(yīng)詳細(xì)說明細(xì)胞供體所屬物種、供體的年齡、性別、取材的器官或組織，如 系腫瘤組織，還應(yīng)說明臨床病理診斷結(jié)果，組織來源以及病例號等。(二) 培養(yǎng)條件和方法各種細(xì)胞都有自己比擬適應(yīng)的生存環(huán)境， 因此應(yīng)指明適合該細(xì)胞系生長的培 養(yǎng)基、血清種類、用量以及細(xì)胞生存的適宜pH 值等。(三) 細(xì)胞生物學(xué)檢測這局部工作常放在對細(xì)胞系的鑒定這一環(huán)節(jié)進(jìn)行。二、對已建立細(xì)胞系的鑒定、管理

34、(一)對已建立細(xì)胞系的鑒定要求能提供細(xì)胞的一般和特殊的生物學(xué)性狀指標(biāo)。 一般特性指標(biāo)包括： 細(xì)胞 的一般形態(tài)、特異性結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生長曲線和分裂指數(shù)、倍增時間、接種率、染色 體分析、同工酶檢查、 DNA 指紋圖譜等。1對正常細(xì)胞系的鑒定對正常細(xì)胞系的鑒定主要圍繞以下四個方面進(jìn)行：鑒定細(xì)胞的種系來源：常用方法主要有染色體分析、同工酶分析、DNA指紋圖譜等技術(shù)； 鑒定細(xì)胞的組織來源： 可通過形態(tài)學(xué)手段、 檢測組織特異性抗原 等進(jìn)行鑒定； 細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)化和惡變： 主要通過核型分析、 細(xì)胞生長行為觀 察是否喪失接觸抑制 、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行鑒定； 細(xì)胞有無發(fā)生交叉污染， 主要通過同工酶及 DNA 指紋圖

35、譜技術(shù)進(jìn)行鑒定。2對腫瘤細(xì)胞系的鑒定 對腫瘤細(xì)胞系的鑒定主要圍繞其惡型性展開，染 色體的異常、接觸抑制和密度依賴生長特性的改變、集落形成能力、裸鼠成瘤、 動物體內(nèi)的侵襲生長， 以及某些基因、分子水平的特征均是腫瘤細(xì)胞鑒定的方向。二已建立細(xì)胞系的管理 對已建立的和經(jīng)過鑒定的細(xì)胞系， 一般除保存在建立者的實(shí)驗(yàn)室外， 為了科 研交流的方便和保證細(xì)胞系的穩(wěn)定性，國際上通行的慣例是將其保存在細(xì)胞庫 中。在國際上， 美、英和日本等國已建有細(xì)胞庫。 其中，美國的 ATCCamerican type culture collecion作為美國國立癌癥研究所NCI和美國衛(wèi)生研究所中NIH 的細(xì)胞資源庫，是世界衛(wèi)

36、生組織 WHO的國際培養(yǎng)細(xì)胞文獻(xiàn)中心。 同時， ATCC 不僅是美國也是世界上最大的細(xì)胞庫，現(xiàn)存細(xì)胞系超過數(shù)千種。 ATCC 接納來自世界各國已經(jīng)鑒定的細(xì)胞予以貯存， 同時也向世界各國的研究者 或?qū)嶒?yàn)室免費(fèi)提供研究用細(xì)胞。 ATCC 接納入庫細(xì)胞時，必須符合其入庫標(biāo)準(zhǔn)， ATCC入庫細(xì)胞時所要求的根本檢測工程主要有：培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、 物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等； 凍存液的組成；細(xì)胞活力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長特性；培養(yǎng)液： 培養(yǎng)基的名稱一般要求不含抗生素 、血清來源和含量； 細(xì)胞形態(tài)； 核型： 二倍體或多倍體，有無標(biāo)記染色體；無污染檢測：包

37、括細(xì)菌、真菌、支原體、 原蟲和病毒等；物種檢測：檢測同工酶，主要為G6PD6-磷酸葡萄糖脫氫酶 和LDH 乳酸脫氫酶，以證明細(xì)胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測；免疫 檢測：一兩種血清學(xué)檢測； 細(xì)胞建立者相關(guān)信息： 包括建立者、 檢測者姓名等。此外，對于已建立的各種細(xì)胞系或細(xì)胞株習(xí)慣上都給以名稱。 細(xì)胞的命名無 嚴(yán)格統(tǒng)一規(guī)定， 大多采用有一定意義縮寫字或代號表示。 以以下舉幾種代表性的 細(xì)胞名稱以供參考：如HeLa :為供體患者的姓名縮寫；CHO:中國地鼠卵巢細(xì) 胞chinese hamster ovary，為英文單詞的首位字母組成；宮 -743:意為1974 年3月建立的宮頸癌上皮細(xì)胞；NIH3

38、T3 :美國國立衛(wèi)生研究所NIH建立， 每3天傳代，每次接種3X105細(xì)胞/毫升。除美國的ATCC :/ 之外，歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中 心 ECACC 也 是重要 的 細(xì) 胞 庫， 建 立 于 1984 年 ， 其 網(wǎng) 址 為: :/ 。第五節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性分析一、培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)觀察 培養(yǎng)細(xì)胞在體外的生長過程是一個動態(tài)的連續(xù)過程， 細(xì)胞的數(shù)目、形態(tài)以及 培養(yǎng)基的顏色、 澄明度等在一定程度上都是細(xì)胞生長狀況的表現(xiàn)。 借助于肉眼或 顯微鏡的幫助， 通過對上述常規(guī)指標(biāo)的觀察， 可以有效地幫助我們及時把握細(xì)胞 的生長信息，適時、適當(dāng)采取相關(guān)措施培養(yǎng)好細(xì)胞。一培養(yǎng)基的觀察培養(yǎng)基的顏

39、色和澄明度是肉眼觀察的兩個重要指標(biāo)。 新鮮的培養(yǎng)基一般呈現(xiàn) 桃紅色，pH約為7.27.4，培養(yǎng)過細(xì)胞后的培養(yǎng)基由于含有大量細(xì)胞代謝產(chǎn)物 而使得 pH 降低，顏色也逐漸變黃。培養(yǎng)基顏色的這種變化是由其所含有的酚紅 指示劑來顯示的，酚紅會隨溶液的 pH 變化而改變顏色，成為指示培養(yǎng)基 pH 的 最直觀指標(biāo)。 培養(yǎng)基顏色變黃是細(xì)胞需要更換培養(yǎng)液的信號。 一般情況下， 大多 數(shù)細(xì)胞需要每 2 3 天換液一次。需要注意的是，如果細(xì)胞在換液或傳代后培養(yǎng) 液很快就會變黃，這可能是細(xì)菌污染或培養(yǎng)瓶不干凈造成的。正常情況下， 無論顏色如何變化， 培養(yǎng)基都能保持澄明。 一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基變 混濁，就應(yīng)注意是否有污染發(fā)

40、生。 上述情況多適用于貼壁生長的細(xì)胞， 對于懸浮 生長的細(xì)胞來說， 隨著細(xì)胞密度的升高， 培養(yǎng)基也會在一定程度上變渾， 判斷其 是否污染應(yīng)結(jié)合溶液顏色變黃的速度、 細(xì)胞增殖的速度、 顯微鏡下是否可觀察到 污染以及其他一些方法進(jìn)行判斷。二顯微鏡檢查 利用光的衍射與干預(yù)原理制造的相差顯微鏡是觀察透明活細(xì)胞的最正確工具， 可以清晰地幫助我們看到生活狀態(tài)下細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)， 并動態(tài)觀察和記錄細(xì) 胞的附著、貼壁、伸展、移動、分裂等過程。在不具備相差顯微鏡的實(shí)驗(yàn)室， 普通的倒置顯微鏡也不失為一種好的觀察工 具。生長狀況良好的細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察時較為明亮、 折光性也強(qiáng)， 細(xì)胞的 輪廓不清但形態(tài)規(guī)那么。

41、生長狀況不佳的細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察時折光性變?nèi)酢?輪廓變得清晰， 細(xì)胞形態(tài)也變得不規(guī)那么， 細(xì)胞間的間隙變大， 細(xì)胞中常出現(xiàn)顆粒 樣物質(zhì)，情況更嚴(yán)重時，還可見到脫落死亡的細(xì)胞增多。二、細(xì)胞活力測定一臺盼蘭染色測定細(xì)胞活力 死細(xì)胞和受損細(xì)胞的細(xì)胞膜通常因缺損而不完整， 這樣某些染料分子便可穿 過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部并使細(xì)胞被染上相應(yīng)的顏色。與死細(xì)胞和受損細(xì)胞不 同，活細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞而拒染dye exclusion。臺盼蘭便是這樣的染料， 經(jīng)臺盼蘭染色的死細(xì)胞或受損細(xì)胞常為淺蘭色。 除臺盼 蘭外，伊紅、苯胺黑也是常用的鑒定細(xì)胞活力的染料，所不同的是，經(jīng)伊紅和苯 胺黑染色

42、的死細(xì)胞或受損細(xì)胞分別為紅色和黑色。1儀器、用品與試劑血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、顯微鏡、微量加樣器、 0.4%臺盼蘭溶液用 PBS 溶液配制。2操作步驟1將貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化后再經(jīng) Hanks 液洗滌后制備單細(xì)胞懸液， 并適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞密度在106個/ml左右。2取細(xì)胞懸液 0.5ml 參加一小試管中，參加 0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染 色 23min。3用微量加樣器吸取少量細(xì)胞懸液參加到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上的小室中。4顯微鏡下計(jì)數(shù) 500 個細(xì)胞，分別數(shù)出死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞 活力。5結(jié)果判定：死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見其為淺蘭色的細(xì)胞， 活細(xì)胞不能被染色，鏡下呈無色透明狀。細(xì)胞活力=總

43、計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)著色的死細(xì)胞數(shù)-總計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)X100% 3考前須知1和臺盼蘭溶液混合后的細(xì)胞懸液不可放置時間過長，因?yàn)榛罴?xì)胞對染 料也有一定攝取能力，假設(shè)時間太長，活細(xì)胞也會被染色。2細(xì)胞懸液和臺盼蘭溶液的用量可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件及要求進(jìn)行必要調(diào)整。 3血細(xì)胞計(jì)數(shù)板用完后要及時用雙蒸水、 70酒精認(rèn)真清洗計(jì)數(shù)板和蓋 玻片并用擦鏡紙擦干后保存。二MTT 法測細(xì)胞相對數(shù)目和相對活力 四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)是一種常用的檢測細(xì)胞存活與生長狀況的方法， 實(shí)驗(yàn)所用之 顯色劑是一種能接受氫原子的染料，化學(xué)名為 3- 4，5-二甲基噻唑 -2 -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽，商品名是噻唑藍(lán)，簡稱MTT 。活細(xì)胞，特別是增殖期的細(xì)胞

44、可通過線粒體代謝過程中產(chǎn)生的的琥珀酸脫氫酶的作用， 使外源性淡黃色的四 甲基偶氮唑鹽MTT被復(fù)原為藍(lán)紫色的結(jié)晶物formazan并沉積在細(xì)胞中， 其形成量與活細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。利用 DMSO 或酸化異丙醇進(jìn)一步溶解細(xì)胞中的 紫色結(jié)晶物formazan,在酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)下測定570nm波長處的光吸收值， 可間接反映出活細(xì)胞數(shù)量的變化情況。1儀器、用品與試劑 超凈工作臺、酶標(biāo)儀、微量加樣器、 RPMI 1640培 養(yǎng)基添加10% FBS、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、5mg/ml MTT 溶液、酸化異丙醇給異丙醇中參加 HCI使最終達(dá)0.04 mol/L或純的DMSO。2操作步驟1接種

45、細(xì)胞：取對數(shù)期生長的貼壁細(xì)胞經(jīng)消化、洗滌后以一定密度接種 在平底96孔板上,每組設(shè)3個平行孔，每孔200卩。2培養(yǎng)細(xì)胞：將96孔板移入細(xì)胞培養(yǎng)箱，在 37C、5%CO2、飽和濕度 條件下培養(yǎng)。3呈色：至收獲前4h每孔參加20卩l(xiāng) MTT溶液5mg/ml ，繼續(xù)孵育4h 后終止培養(yǎng)，從每孔小心吸棄上清液 100卩，再參加DMSO 150卩，置酶聯(lián)免疫 檢測儀上振蕩10min，以使結(jié)晶物充分溶解。4比色：選擇 570nm 波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值， 記錄結(jié)果。3考前須知1設(shè)空白對照?？瞻讓φ諡椴患蛹?xì)胞只加培養(yǎng)基，其他步驟與實(shí)驗(yàn)組相 同，比色時以此孔調(diào)零。2依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?xì)胞種類、

46、細(xì)胞的生長習(xí)性選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種密度 和培養(yǎng)時間長短。一般情況下，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔最多可以生長 1X105個細(xì)胞， 切不可接種密度太高，致使培養(yǎng)終止前細(xì)胞過滿，影響實(shí)驗(yàn)的區(qū)分度。3高濃度的血清會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)本底增加，應(yīng)盡量選擇不超過10 FBS 的培養(yǎng)條件。4附錄5mg/ml MTT 溶液的配制： 準(zhǔn)確稱取 MTT 0.5 克，溶于 100 ml 的 0.01 mol/L pH值7.4的PBS溶液中，0.22卩曲微孔濾膜過濾除菌，分裝后，4C下保存，兩 周內(nèi)有效或-20r凍存。三、細(xì)胞的分裂指數(shù)分裂指數(shù)是衡量體外培養(yǎng)細(xì)胞生長增殖狀況的重要指標(biāo)， 常用細(xì)胞群體中分 裂細(xì)胞所占的百分比來表示。 分

47、裂指數(shù)是測定細(xì)胞周期的一個重要指標(biāo)， 與生長 曲線有一定的聯(lián)系，如隨著分裂指數(shù)的不斷提高，細(xì)胞也就進(jìn)入了指數(shù)生長期。 同時，分裂指數(shù)也是不同實(shí)驗(yàn)研究選擇細(xì)胞的重要依據(jù)。一儀器、用品與試劑 超凈工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)箱、普通顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)皿、蓋玻片、吸管、細(xì)胞培養(yǎng)基 如添加有10% FBS的RPMI1640、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋 白酶消化液、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、PBS溶液。二操作步驟1將消化、洗滌后培養(yǎng)細(xì)胞以一定密度接種至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中。2. 置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，使細(xì)胞貼附在蓋玻片上生長。3 取出蓋玻片，按以下順序操作：PBS漂洗3min-固定液甲醇：冰醋

48、酸 =3: 1體積比固定30minGiemsa染液染色10min自來水沖洗。4. 待蓋玻片晾干后將其反扣在載玻片上，鏡檢。5 計(jì)算結(jié)果：分裂指數(shù)=分裂細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)X100%三考前須知1 操作時動作要輕，以免使蓋玻片上的細(xì)胞脫落。2細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)時間有細(xì)胞的種類及生長習(xí)性決定。四附錄Giemsa染液配制：1 Giemsa 原液的配制：稱 Giemsa 粉末 0.5 克，加幾滴甘油研磨，再加 入甘油使參加的甘油總量為 33ml, 56C中保溫90-120min后再參加33ml甲 醇，置棕色瓶中保存。2使用時按要求用PBS稀釋，常用的稀釋比例為1: 10。四、集落形成實(shí)驗(yàn)集落克隆 形成實(shí)驗(yàn)是

49、檢驗(yàn)細(xì)胞存活率和增殖能力的有效指標(biāo)。 集落或克 隆是指單個細(xì)胞在體外經(jīng) 6 代以上增殖后所形成的細(xì)胞群體，直徑大小常在 左右。正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)時由于常需附著在堅(jiān)硬的玻璃或塑料外表 才能生長， 而轉(zhuǎn)化的或惡變的腫瘤細(xì)胞卻常常喪失附著依賴生長的特性， 可在軟 瓊脂或甲基纖維素中以集落的方式生長。 通過對集落的計(jì)數(shù)， 不僅可以了解細(xì)胞 的生存增殖能力， 而且還可用于評價(jià)腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性、 腫瘤放射 生物學(xué)研究。常用的集落形成實(shí)驗(yàn)主要有平板集落形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)， 此處 主要介紹軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)。一儀器、用品與試劑超凈工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、吸管

50、、細(xì)胞培養(yǎng) 基如添加有10%FBS的RPMI1640、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶 消化液、瓊脂粉等。二操作步驟1 制備細(xì)胞懸液：取對數(shù)期生長貼壁細(xì)胞經(jīng)消化、洗滌后用培養(yǎng)基根據(jù)實(shí) 驗(yàn)要求稀釋調(diào)整細(xì)胞密度，待用。2 制備底層瓊脂：用三蒸水配制5%的瓊脂，高壓滅菌后待溫度降至50C, 參加預(yù)溫的 9倍體積培養(yǎng)基稀釋，混勻后迅速給 24 孔培養(yǎng)板每孔中參加 0.8ml ， 室溫凝固瓊脂。3. 制備上層瓊脂：取0.6ml保溫于50E的5%的瓊脂與9.6ml細(xì)胞懸液迅速 混勻后立即參加到鋪有底層瓊脂的 24孔培養(yǎng)板中，每孔0.8ml，室溫凝固瓊脂。4將培養(yǎng)板置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 714天。

51、5. 倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)集落數(shù)目，按下面公式計(jì)算結(jié)果。集落數(shù)=n個孔的細(xì)胞集落數(shù)總和 勻孔數(shù)n集落形成率=集落數(shù) 我種細(xì)胞總數(shù)X100%三考前須知1. 制備瓊脂凝膠時盡量防止氣泡和局部結(jié)塊的產(chǎn)生。2瓊脂與完全培養(yǎng)基混合溫度不要超過 50C，與細(xì)胞懸液混合時的溫度不 要超過40C，以免降解培 養(yǎng)基 的營養(yǎng)成分和損傷細(xì)胞。五、細(xì)胞生長曲線的繪制 生長曲線是測定細(xì)胞生長根本規(guī)律的重要指標(biāo)， 常通過每日或隔日連續(xù)計(jì)數(shù) 細(xì)胞來繪制。廣泛用于比擬和評價(jià)各種藥物、營養(yǎng)條件對細(xì)胞生長的影響。一儀器、用品與試劑 超凈工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)箱、顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶、微量加樣器、細(xì)胞培養(yǎng)基如添加有10% F

52、BS的RPMI 1640、添加有0.02%EDTA 的 0.25%胰蛋白酶消化液、 0.4%臺酚蘭溶液等。二操作步驟1. 取旺盛生長對數(shù)期的細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化、洗滌、計(jì)數(shù)后，以一 定密度準(zhǔn)確接種在不同組別的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中。2每隔24h或48h，取樣3瓶孔細(xì)胞消化后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞 密度，結(jié)果取其均值。連續(xù)計(jì)數(shù) 7-10天。3.以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。三考前須知1接種細(xì)胞的密度取決于細(xì)胞的生長特性和培養(yǎng)時間的長短。通常，所接 種的細(xì)胞密度不宜太大， 否那么細(xì)胞很快就會進(jìn)入增殖穩(wěn)定期， 短期內(nèi)就的進(jìn)行傳 代，所得曲線不能準(zhǔn)確反映細(xì)胞的生長情況。2般需在培養(yǎng)35天

53、后給為計(jì)數(shù)的細(xì)胞統(tǒng)一進(jìn)行換液。3生長曲線作為一種常規(guī)方法的缺陷是數(shù)值不夠精確，對細(xì)胞生長規(guī)律的 準(zhǔn)確評價(jià)需結(jié)合其他方法進(jìn)行， 利用 MTT 法測定生長曲線就是一種較好的選擇。六、細(xì)胞周期的測定細(xì)胞周期指細(xì)胞一個世代所經(jīng)歷的時間， 即從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分 裂結(jié)束所經(jīng)歷的時間，它反響了細(xì)胞增殖速度。測定群體細(xì)胞周期的方法很多， 主要有同位素標(biāo)記法、 細(xì)胞計(jì)數(shù)法、 流式細(xì)胞儀測定等。 這里主要介紹利用 BrdU 滲入測定細(xì)胞周期的方法。BrdU 5-溴脫氧尿嘧啶核苷參加培養(yǎng)基后，可代替胸腺嘧啶核苷摻入到所 復(fù)制的 DNA 新鏈中，經(jīng)過一輪復(fù)制，在每條染色單體的一條 DNA 鏈均含有 BrdU

54、，但經(jīng)染色后染色體卻仍為深染。經(jīng)過兩個細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈 均含BrdU的DNA將占總數(shù)的1/2，反映在中期染色體上表現(xiàn)為其中的一條單體 淺染。但假設(shè)經(jīng)歷了三個周期， 那么約一半的染色體的兩條單體均淺染， 另一半為一 深一淺。這樣，通過統(tǒng)計(jì)分裂相中各期的比例，就可算出細(xì)胞周期的值。一儀器、用品與試劑 超凈工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)箱、顯微鏡、吸管、廢液缸、培養(yǎng)瓶、移液管、離心機(jī)、離心管、30W紫外燈、水浴鍋、飯盒、擦鏡紙、添加有0.02%EDTA的0.25% 胰蛋白酶消化液、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基添加有10% FBS、Hanks液、BrdU1.0mg/ml溶液，甲醇、冰醋酸，Giemsa染液

55、，秋水仙素，2XSSC液等。二操作步驟 1取對數(shù)期生長的細(xì)胞經(jīng)消化、洗滌后以一定密度種植在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板 中。2 細(xì)胞生長至指數(shù)期時，向培養(yǎng)液中參加 BrdU，使最終濃度為10卩g/ml3 .培養(yǎng)4454h參加秋水仙素，終濃度為0.1 g/ml。4繼續(xù)培養(yǎng)46h后，常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì) 胞也要收集到離心管中。5按照常規(guī)染色體制備方法制片。6染色體玻片有細(xì)胞一面向下放在一飯盒中的玻璃支架上，參加2XSSC 液以不超過標(biāo)本外表為宜，然后在標(biāo)本上覆蓋一張擦鏡紙，使紙的兩邊浸入2七SC液中，以保持標(biāo)本的濕潤。7 .將飯盒放在56C水浴鍋中，濕育，上面用 30w的紫外燈管6-10

56、cm垂直 照射 30min。8. 棄去2>SSC液和擦鏡紙，立即用4C左右的流水沖洗。9. Giemsa液染色5-10min，流水沖洗，枯燥后鏡檢。10. 鏡檢 100 個分裂相，統(tǒng)計(jì)第一、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。11 .根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞周期細(xì)胞周期 Tc =48/ M1+2M2+3M3+4M4 /100h三考前須知1. 秋水仙素的參加時時機(jī)因細(xì)胞的類型、生長速度有所差異。2. 參加 BrdU 后應(yīng)避光培養(yǎng)。四附錄1. BrdU的配制： 稱取BrdU 10mg，無菌條件下溶于滅菌生理鹽水中，定容10ml，4C下避光保存，宜現(xiàn)用現(xiàn)配。2.2XSSC溶液的配制：NaCI 1.75g，檸檬酸三鈉2H2O 0.885g，加水至100ml，4C保存。第六節(jié) 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度為-196C，將細(xì)胞收集至凍存管中參加含保護(hù)劑 一般為二甲