細胞病變抑制法方法學驗證

1、細胞病變抑制法測定干擾素生物學活性IFN- a 2b 經(jīng) PEG 修飾后其活性位點仍然保存，因而我們沿用經(jīng)典的細胞病變抑制法作為 PEG-IFN- a 2b 的生物學活性檢測方法，以?中華人民共和國藥典?2021年版三部附錄 X C 為檢測依據(jù)。細胞病變抑制法作為一項成熟的生物 學活性檢測技 術， 已經(jīng)廣泛用于多類 IFN 亞型的生物學活性檢測， 并被收錄入國 家藥典，目前國 內(nèi)上市 IFN 相關產(chǎn)品的活性檢測多采用的該方法， 多年的實踐證 明該方法檢測結果 穩(wěn)定，可靠，重現(xiàn)性好。在此根底上，我們將該方法運用于 PEG-IFN- a 2b 的生物學 活性檢測，并完成了專屬性、線性、準確性、精密

2、度和 耐用性的方法學驗證。具體操 作如下：WISH 細胞傳代培養(yǎng) 2? 3天后經(jīng) EDTA 消化，用含 10獅生牛血清的 MEM 培養(yǎng) 液, 配成3.0 X 105個細胞/ml ,接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100卩I,于37C, 5%C0 條件下培養(yǎng) 4? 6 小時；將 4 倍系列稀釋的標準品溶液和供試品溶液移入接 種 WISH 細胞的培養(yǎng)板中，每孔參加100卩I,于37C, 5%民3條件下培養(yǎng)18? 24小時；棄去 細胞培養(yǎng)板中的上清液， 參加 VSV 繼續(xù)培養(yǎng)， 待到達病變要求染色， 脫色，于 570nm 處測定吸光度,根據(jù)標準品和待測品稀釋度的差異,計算出待測樣品的生物活性。1. 專

3、屬性干擾素生物學活性測定法,依據(jù)干擾素可以保護人羊膜細胞WISH 免受水 泡性口炎病毒 VSV 破壞的作用,用結晶紫對存活的WISH 細胞染色,在波長570nm 處測定其吸光度,得到干擾素對 WISH 細胞的保護效應曲線,以此測定干 擾 素生物學活性。滿足專屬性要求。2. 線性干擾素對 WISH 細胞的保護效應與劑量相關,在干擾素活性為 0.01IU/mI ?250IU/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)典型的S型曲線，其相關系數(shù)R大于0.95以上，相關 系數(shù) 的平方R2大于0.90以上，滿足線性要求。 20210609.sda iFNjufvc Fit: 4-Par迪meCurve y =CurveParame

4、terEstimated Va>lueStd. ErrorCon fitle nfe In terval2 = 0.OT950-7 345Q.S527.3461.562O.WSO.S67D. &71,1.034S .4*6A.197110.011001000? STD i SuHdards:3.準確性vsCurve Fit Results |Ccmcentra Curve Fit 4-Parameier v tio n以小試制備IFNa 2b為樣品1,以小試制備PEG-IFNa 2b為樣品2 生物學 活性 標示量為1000IU/ml 進行準確性驗證。結果如下：20210603.s

5、da 樣品1樣品2效價IU/ml10751185偏差IU/ml75185準確度7.5%18.5%生物制品的生物學活性為相對活性，與同時測定的標準品比擬而得。由同時測定的IFN a 2b及PEG-IFNa 2b與標準品的劑量反響曲線可以看出，三條曲線具有平行性，即IFN a 2b及PEG-IFNa 2b與標準品的活性成分僅是量的不同而沒有質(zhì)的區(qū)別，可由此計算出相對活性結果。Plate#lFN45678910Curve| A Curve PitCurve0.0411.3421.3151.2821.2951.3081.2781.4150.0371.4441.3181.3581.2331.44S1.4

6、711.45?0.0341.4291.3451.3181.2471.3991.4751.5<B0.0051.1741.2871.3351.0971.1771.2901.4950.0000.8530.86S0.8340.8390.7520.9991.4620.0150.5300.6550.4700.4530.3810.5871.4CB0.0120.2560.4250.2810.2810.1370.2411.4590.0390.2730.2570.0000.10S-0.0890.0351.447Concen tratio nSTD ( Standards: MeanVal- vs Conce

7、nts.)P1ot#l ( Samplel: MeanVaL vs Concenrr.)Plot? 2 ( Pmpl? 2: M? >nV? L. vs CorKtntr.)IFM恐 SummaryDlease in put valueEvstd= 1000PDspl1= 1=C和吐1=-2std= 1Result as following :E50= D.675X50STD= 1.947Sam pie 1X50= 1.311Sample2X50= 1.643EVS3i nple仁 1075EVSa nn ple2= 11854.精密度由于生物活性或效價測定是生物制品質(zhì)控中的重要指標，該

8、方法的可靠性會直接影響產(chǎn)品的可控性，所以我們對生物活性測定方法的精密度驗證非常重視。分別對IFN和PEG-IFN進行了精密度研究，檢測結果下表，相對標準偏差 分別為7.0% 和14.7%，符合細胞實驗精密度要求小于30%要求。表IFN效價指標的精密度驗證IFN第一次第二次第三次效價(X 108IU)1.121.211.29平均值X 108IU1.21標準偏差X 108IU0.08相對標準偏差7.0%表PEG-IFN效價指標的精密度驗證PEG-IFN第一次第二次第三次效價(X 107IU/ml )2.122.591.96平均值X 107IU2.22標準偏差x 107IU0.33相對標準偏差14.

9、7%20210609.sdaS1: IFN (0.51mg/ml)S2: PEG-IFN( 1.43mg/ml )S3:其他樣品d jg W aS4: PEG-IFN (1.43mg/ml )IFMQ=i Plate41Platefll3456789101112 O.OC9L472.1.4901_522una1.5331.5251.431U2.L1-4711.457JL574o.? i口財1-M11364l.M :J.血自津1.5103 ?如1-49 :1.4S2 851575-L5431.5031.36B止嗎1.417141?1.4A151.3K2 5&SA0J?3JL3D81-25

10、03_3731_335D.9?L&W1235ura0171.2501L5BSo.ooaO-asi0.1041.12A1.1078O'.3SAO.A30o.asi.LOdO0.9A71一個a.0070 373Q3UQ.6BXascs0.223-0.225uas0.713Q.747斃5070.027Q.l?UEH0.3170-za?0.1320.1230.223D.2B30.410 .<449丄6 股0.A39CLClSJ0.-0250.091cumn .0 nC.0120.0300.U90.K01L585Read InfocnistionEm : axROM ? AOM S

11、un Rt? d : 1S : O3 20.10-6-9Aemngs InfcrmananEndpointE) AburbAtfieft Lml-Rtf570 ? ?30-VI ore Settings ShakeOff Calibrate OffOpTLBI DensityPlllrt* eitAk US*1|: Lffll- 0.3-ogW? W?ls-np : h Com 口 門-'ImlIfNLfl Cunre乂 Curve Pi t4-ParameierV J.Cuive和亡鞘nOJfS?L* PM 】S SamA eiFFN: Mea-nVal.vs Con £

12、?ntr.)? STD ( StandardsIFN:vs 匕 Dflcent 一)vs Ccneeritr-. )vs Concmtr_. )PIOKW J :幻 mpl 電旨色 I 豐札："eanVal.-* PlotfM : Samoie+glfN: MeanVal.Rsutt as follow ingIE5OA 0J71X50STD= 7.008SampkelX50= 1178Sampte2X50= 1 415Sample4X5O= 1.161EVSample1l= 1124 &271DEVSample2= 21244269EVSample4= 25SS737120

13、210611.sdaS1: IFN (0.51mg/ml )S2: PEG-IFN( 1.43mg/ml )S3: IFN (0.51mg/ml )IFN屋j Plat曲Plate#l23456789101112?0.0301.5511.5561A831.5721.5301.4861.321-5141.5241.361.6333.0391.5941.575U801.5661.4233623561.A601.4201.5441.6353.0351.5061.5471A471.4571.2971.3221.4491.4321.A311.5661.6053.0301.3451.3251.364l_5

14、B01.055ross1.3121.4781.4021-2? Sl.? 02).0001.0170.8941.0901.1240.6340.8S11.0180.9110.9193.8831.6019.0140.5S90.4S70.8180.6880.4SS0.4S20.SS60.SS0o.ess3.5401.6013.0410.2330.2360.4110.S260.2990.39S0.38S0.3S60.493D.2? 71.6093.0390.1960.1320.2630.3640.1900.2120.2880A130.3409.3071.M4Settings InformationEnd

15、point -Absorb""Lml-Ref 570-630 TMere Sowings ShakeOff Calib-axe OffRead InformationEmaxROM vROM Start Read : 16:35 2021-6-11Reduction SettingsOptical DensityPlate Blank Used : Lml = 0.314Waveength Combination :!LmlIFN辺 Curve二 Curve Fit 4-Parameterv £Curve1.81.61.41.2<*塔g1>u0.8c0

16、.60.40.2001110100100010000Concentration? STD ( StandBfdsIFN: MeanVal.vs Con centr? .)? P1ct#l( AamplelIFN:MeanValA.vs Concents.) vs? P1ct? 2(Sample2IFN -MeanVal.Concentr.)? P1ct#3(Ampl<3?IFN:MttnViL.vi Conctntr. ? ) vs? P1ctff4| Sampie4?lFNiMeanVal-Concents.)Result as followingE5t> 0.855X50STD= 6.627Sampl&lX5C= 2-805Sample2X5O= 1 443sample3X5O= 2.617EVSsmpleU 12Q51 75MEVSampie2A 19640957EVSampie3= 1291645325. 耐用性生物學測定