解毒通絡(luò)調(diào)肝散對(duì)胰島素抵抗大鼠肝臟NF

1、解毒通絡(luò)調(diào)肝散對(duì)胰島素抵抗大鼠肝臟NF kB及MCP 1表達(dá)的影響(一)【摘要】目的觀察解毒通絡(luò)調(diào)肝散對(duì)糖尿病(DM)胰島素抵抗(IR)模型大鼠肝臟中核因子(NF) kB及單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP) 1表達(dá)的影響。方法采用高脂飲食加鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo) DMIR 大鼠模型。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、吡咯列酮組和解毒 通絡(luò)調(diào)肝組。給藥 8w 后進(jìn)行各指標(biāo)檢測。結(jié)果解毒通絡(luò)調(diào)肝散能升高 DMIR 大鼠胰島素敏 感性指數(shù)，降低大鼠肝臟中NF kB蛋白、MCP 1蛋白表達(dá)。結(jié)論解毒通絡(luò)調(diào)肝散對(duì)大鼠IR有顯著改善作用，其機(jī)制可能與其減少 DM大鼠肝組織中NF kB MCP 1表達(dá)，

2、發(fā)揮抑 制肝內(nèi)炎癥的作用?！娟P(guān)鍵詞】胰島素抵抗(IR)；解毒通絡(luò)調(diào)肝散 核因子(NF) k B單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP) 1【Abstract 】ObjectiveToinvestigatetheeffectofJieDuTongLuoTiaoGanSan(JDTLTGS)onnuclearfactor(NF) k Ban dmonocytechemoattractantprotein(MCP)1ofliverininsulinresistant(IR)rats.MethodsIRmodelratsinducedbyhighfatandglucosefoodandSTZwererandomly

3、dividedintomodel ， metformin ， pioglitazone，andJDTLTGSgroups.After8weeks，thevariousindexeswereobserved.ResultsInsulinsensitivityindexwassignificantlyelevated，besidesNF k BandMCP 1ofliverwerereducedintheJDTLTGSgroup.ConclusionsJDTLTGScouldatte nuateIRinrats，itspharmaceuticalmechanismsmightbecloselyre

4、latedwiththeoverexpressionofNF kB，MCP 1inDMmodelgroupliver ， andinhibitingtheinflammatorypathogenesisinliver.【 Keywords 】 Insulinresistance;JieDuTongLuoTiaoGanSan;Nuclearfactor(NF) k B;Monocytechemoattractantpro tein(MCP) 1 胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)的重要發(fā)病機(jī)制之一，但其具體的病理根底較為復(fù)雜， 國內(nèi)已有中醫(yī)藥防治IR的臨床及試驗(yàn)報(bào)道。前期工作說明1，解毒

5、通絡(luò)調(diào)肝散能改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IR,為進(jìn)一步探討其改善IR的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察了解毒通絡(luò)調(diào)肝散對(duì)實(shí)驗(yàn)性DM大鼠肝組織核因子 k B(NF k B、) 單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP 1)及 MCP 1mRNA 表達(dá)的影響，探討肝組織 NF kB與MCP 1途徑與T2DM、IR之間的關(guān)系。1 材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)8周齡雄性 Wistar大鼠60只(體重150170g)，購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，根底飼料(熱量15J/g)由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，高脂飼料由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心新鮮配制：根底飼料63%, 15%牛油，20%蔗糖，2%膽固醇，提供熱量約20J/g，其中脂肪提供熱量占總熱量30

6、%。 60 只大鼠按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組 8 只和 DM 模型組 52只。正常對(duì)照組給予根底飼料， 模型組給予高熱量飼料。 4w 后，模型組腹腔注射 (ip)1.2%STZ 溶液 30mg/kg ，于注射 STZ1w 后測定糖耐量。按照國際通用大鼠 DM 診斷標(biāo)準(zhǔn)：血糖峰 值16.8mmol/L和120min血糖11.1mmol/L為DM，具備上述一條為糖耐量減低(IGT)2。取DM或IGT模型組動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。將造模成功大鼠48只按血糖峰值分層，隨機(jī)分為模型組(n=12)，中藥組(n=12),二甲雙胍組(n=12)，吡格列酮組(n=12)。3個(gè)治療組分別每日定 時(shí)灌服解毒通絡(luò)調(diào)肝散懸混液5

7、g kg-1 d-1、二甲雙胍水溶液 0.5g kg-1 d-1、吡格列酮懸混液5mgkg-1d-1，動(dòng)物自由進(jìn)食飲水，正常對(duì)照組喂普通飼料，其他組喂高熱量飼料。治療周 期為8w。治療結(jié)束時(shí)，納入統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的動(dòng)物數(shù)為：正常對(duì)照組8只，模型組8只，二甲雙胍組 9只，吡格列酮組 10只，中藥組 10只。1.2 藥物及試劑解毒通絡(luò)調(diào)肝散由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)研究所提供;鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊 (君力達(dá) )：北京圣永制藥;鹽酸吡格列酮片 (瑞彤 )：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。鏈脲佐菌素 (STZ：) 美國 Sigma 公司 ;末端全血葡萄糖測試條：北京怡成生物電子技術(shù)。胰島素放免試劑盒購自北京東亞生

8、物技術(shù)。兔抗大鼠NF kB MCP 1多克隆抗體購自武漢博士德公司。1.3 檢測指標(biāo)及方法生化指標(biāo)的檢測血糖：怡成血糖儀檢測；血清胰島素：磁酶免分析儀1(美國Bio Rad)檢測;胰島素敏感指數(shù)(ISI): Ln(1/空腹血糖 空腹胰島素)。SP法檢測。一抗分別為1 : 100)；二抗均為山羊抗SP 試劑盒。嚴(yán)格按試劑肝組織 NF k Bp65 MCP 1 蛋白表達(dá)測定采用免疫組織化學(xué) 兔抗大鼠NF k Bp65工作濃度1 : 100), MCP 1多抗(工作濃度:兔IgG,生物素標(biāo)記來自抗兔的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素 盒說明書進(jìn)行。1.3.3 免疫組化染色半定量評(píng)分所有切片均由有經(jīng)驗(yàn)的

9、病理科醫(yī)師盲法閱片作出診斷,每張切片觀察5個(gè)X 400視野。結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：著色程度：不著色者為0分，著色淡者為1分，中等著色為 2 分,著色深者為 3 分。著色細(xì)胞陽性范圍：無著色 0 分,著色陽性細(xì)胞小于 1/3為1分，著色陽性細(xì)胞1/31/2為2分，著色陽性細(xì)胞大于 1/2為3分。將每張切片著 色程度與著色細(xì)胞陽性范圍得分各自相加為其最后計(jì)分。肝組織MCP 1mRNA表達(dá)測定按Trizol試劑說明書。根據(jù)文獻(xiàn)3合成MCP 1寡核 苷酸(PCR引物。MCP 1 引物序列：上游 5/ CACCTGCTGCTACTCATTCAC3T ;下游 5/GTTCTCTGTCATACTGGTCACTT3C

10、 。 GAPDH 引 物 序 列 ： 上 游 5 ACCACAGTCCATGCCATCAC7 ;下游 5/ TCCACCACCCTGTTGCTGTA/ 弓 I物由北京鼎國 生物技術(shù)開展公司合成。擴(kuò)增條件為：94 C預(yù)變性 2min后進(jìn)入如下循環(huán)：94 °C 45s,55C 45s, 72 C 45s,循環(huán)數(shù)為30個(gè)，最后于72 C延伸10min。擴(kuò)增的MCP 1長度為 349bp, GAPDH長度為450bp。擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行紫外光成像分析，以GAPDH密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)值以兩者之吸光度(Int)面積(Pix)比值表示，以對(duì)照組的比值作為標(biāo)準(zhǔn) 1.0,計(jì)算 MCP 1 基因相對(duì)表達(dá)量。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以 x 土表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析。2 結(jié)果2.1 各組大鼠空腹血糖、空腹胰島素、 ISI 比擬大鼠飼養(yǎng) 4w 時(shí),造模組大鼠平均空腹血糖顯 著高于正常組(P0.01)，但未到達(dá)DM診斷標(biāo)準(zhǔn)。注射 STZ后大鼠空腹血糖、1及2h血糖水 平那么明顯升高。12w末，治療組大鼠血糖較模型組明顯降低(P0.05, P0.01)，中藥組與