大腸桿菌檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、1 目的：規(guī)范大腸桿菌檢查操作，保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。2 范圍：本程序適用于藥品大腸桿菌的檢查。3 責(zé)任者：QC員、QC復(fù)核人員、QC主任。4 程序：4.1試藥與試液 除特別注明外，試驗(yàn)中所用的試劑均為分析純?cè)噭?，水為純化水?.1.1 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液取氯化鈉NaCl9.0g，加水使溶解成1000ml，121滅菌20分鐘。4.1.2 無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液(pH7.2)取磷酸氫二鈉Na2HPO4·12H2O25.8g和磷酸二氫鈉NaH2PO4·H2O4.4g，加水使溶解至1000ml，121滅菌20分鐘。4.1.3 萘酚乙醇試液取萘酚6.0g，加無(wú)水乙醇溶解使成100ml。

2、4.1.4 40氫氧化鉀試液取氫氧化鉀40g，加水溶解使成100ml。4.1.5 靛基質(zhì)試液取對(duì)二甲氨基苯甲醛C9H11NO1g，加入95%乙醇C2H5OH95ml，充分振搖，使完全溶解后，取濃鹽酸HCl20ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導(dǎo)致溶液色澤變深，置冰箱保存，備用。4.1.6 甲基紅試液取甲基紅C15H15N3O20.1g，加95%乙醇C2H5OH300ml與水適量，使溶解，再加水至500ml，即得。4.1.7 V-P試液取-萘酚C10H7OH6.0g，加無(wú)水乙醇C2H5OH使溶解成100ml。另取氫氧化鉀40.0g，加水使溶解成100ml。分別將試藥與各溶劑混合即得。4.1.8

3、革蘭染色液4.1.8.1 沙黃染液取沙黃0.25g，加95%的乙醇C2H5OH10ml，使完全溶解后，加水至100ml。4.1.8.2 結(jié)晶紫染液取結(jié)晶紫C25H30ClN31.0g，加95%的乙醇C2H5OH20ml，使溶解，加1%的草酸銨溶液80ml，混勻。靜置48小時(shí)使用，置密閉棕色瓶中儲(chǔ)存。4.1.8.3 碘試液取碘化鉀KI2.0g，加水35ml使溶解，加入碘片I21.0g，使全部溶解后，加水稀釋至300ml，置密閉棕色瓶中儲(chǔ)存。4.1.8.4 95乙醇。4.1.9 溴麝香草酚藍(lán)指示液4.2 培養(yǎng)基的種類4.2.1 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基4.2.2 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4.2.3 膽鹽乳糖培養(yǎng)基（B

4、L）4.2.4 4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(MUG)4.2.5 乳糖培養(yǎng)基4.2.6 5%乳糖培養(yǎng)基4.2.7 蛋白胨水培養(yǎng)基4.2.8 磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基4.2.9 枸櫞酸鹽培養(yǎng)基4.2.10 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）4.3對(duì)照用菌液 取大腸桿菌CMCC (B) 44102的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，36±1培養(yǎng)1824小時(shí)后，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至1:106，使對(duì)照菌液加入量含菌50100個(gè)（一般用量為0.1m1），其菌數(shù)在做陽(yáng)性對(duì)照的同時(shí)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)確定。4.4儀器與設(shè)備4.4.1 菌檢室。4.4.2 凈

5、化工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱（36±1），微波爐，恒溫水?。?5±1），高壓蒸汽滅菌器，電冰箱，勻漿儀，離心機(jī)（5004000轉(zhuǎn)/分鐘），顯微鏡（1500倍），紫外燈（366nm）。4.4.3 薄膜過濾裝置：微孔濾膜直徑約50mm，孔徑0.45±0.02mm。8.4 錐形瓶（250300ml，內(nèi)裝玻璃珠若干），研缽（陶瓷制，直徑l012cm）、培養(yǎng)皿（9cm），量筒（100ml），試管（18´180mm）及塞，吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1），注射器（20ml或30ml），注射針頭，載玻片，蓋玻片、玻璃消毒缸（帶蓋）。4.4.4 玻璃器皿用前應(yīng)洗滌

6、干凈，無(wú)殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距0.5cm處塞入約2cm的適宜疏松棉花，置吸管桶內(nèi)或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應(yīng)加棉塞或硅膠塞，若用振蕩器制備混懸液時(shí)，尚需用玻璃紙包裹瓶塞，以免振蕩時(shí)供試液污染瓶塞，再用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于160干熱滅菌2小時(shí)或高壓蒸汽121滅菌30分鐘，烘干備用。4.4.5 大、小橡皮乳頭（放于干凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用7075%乙醇溶液浸泡）。4.4.6 無(wú)菌衣、帽、口罩、手套。洗凈后配套，用牛皮紙包嚴(yán)，滅菌，備用。4.4.7 接種環(huán)（白銥金或鎳鉻合金，環(huán)徑45mm、長(zhǎng)度610cm），乙醇燈，乙醇棉球或碘伏棉球，滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌鑷子，滅菌鋼錐，滅

7、菌稱樣紙，不銹鋼藥匙，試管架，火柴，記號(hào)筆，白瓷盤，洗手盆，陶瓦蓋（12cm）等。 所有進(jìn)入無(wú)菌室的物品必須經(jīng)過消毒或滅菌，應(yīng)嚴(yán)格按照菌檢室物品進(jìn)出標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP QC-003-00）進(jìn)行操作。4.5 準(zhǔn)備4.5.1 供試品的檢驗(yàn)量4.5.1.1 所有劑型的檢驗(yàn)量均需取2個(gè)以上包裝單位。4.5.1.2 固體制劑檢驗(yàn)量為l0g。4.5.1.3 液體制劑檢驗(yàn)量為l0ml。4.5.1.4 特殊貴重或微量包裝的藥品，檢驗(yàn)量可酌減。除另有規(guī)定外，口服固體制劑不低于3g，液體制劑采用原液者不得少于6ml，采用供試液者不得少于3ml，外用藥品不得少于5g。4.5.2 供試液的制備4.5.2.1 液體供

8、試品。取供試品l0ml，置滅菌錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，搖勻，作為1:10供試液。4.5.2.2 固體供試品。稱取供試品10g，置于勻漿杯或適當(dāng)滅菌容器中，加入0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液100ml，用勻漿儀，振蕩器或乳缽研磨等方法分散混勻。4.5.2.3 含抑菌成分供試品。供試品按常規(guī)檢查法，加入規(guī)定量的對(duì)照菌。不能檢出時(shí)，該供試液須按以下方法之一或兩種以上方法聯(lián)合處理后，依法檢查。同時(shí)做陽(yáng)性和陰性對(duì)照。4.5.2.3.1 稀釋法。取規(guī)定量的供試液種入較大體積的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。4.5.2.3.2 離心沉淀集菌法。取規(guī)定量的供試液于無(wú)菌刻度離心管中，3000轉(zhuǎn)/分鐘

9、離心30分鐘，移去上清液，留底部集菌液約2ml，并稀釋該供試液至原規(guī)定量。如有不溶性藥渣，可先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取全部上層液，再按上述方法集菌處理。4.5.2.3.3 薄膜過濾法。取規(guī)定量的供試液于稀釋劑100ml中，搖勻，以無(wú)菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大于0.45±0.02m微孔濾膜的薄膜過濾器內(nèi)，過濾，用稀釋劑沖洗濾膜，每次不少于100ml，將培養(yǎng)基加入濾器或取出濾膜，加入增菌培養(yǎng)基中。4.5.2.3.4 沉降法。取規(guī)定量供試液，自然沉降5分鐘，取上層液于100ml增菌液中，本法適用于難溶于水的抗菌制劑。供 試 品供 試 液BL增菌培養(yǎng)液MUG蛋白胨MUG陽(yáng)性

10、、靛基質(zhì)陽(yáng)性MUG陰性、靛基質(zhì)陰性MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性EMB或麥康凱瓊脂平板疑似菌落純培養(yǎng)革蘭染色、乳糖、靛基質(zhì)、甲基紅、V-P、枸櫞酸鹽利用36±1 1824小時(shí)36±1 4、24小時(shí)報(bào)告36±1 1824小時(shí)36±1 1824小時(shí)36±1 2448小時(shí)報(bào)告4.6 檢驗(yàn)程序4.7 增菌培養(yǎng) 取膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）3瓶，每瓶各100ml。2瓶分別加入規(guī)定量的供試液，其中1瓶加入對(duì)照菌50100個(gè)作陽(yáng)性對(duì)照，第3瓶加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對(duì)照。37培養(yǎng)1824小時(shí)（必要時(shí)可延至48小時(shí)）。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。 搖勻

11、上述BL增菌培養(yǎng)液，以滅菌吸管取供試品膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)液、供試品陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)液、陰性對(duì)照培養(yǎng)液各0.2ml，分別加入4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）管，37培養(yǎng)4、24小時(shí)后，將各管置366nm紫外燈下觀察有無(wú)藍(lán)白色熒光，然后靛基質(zhì)試液45滴于上述MUG管內(nèi)，觀察液面顏色。MUG陽(yáng)性（有熒光）、靛基質(zhì)陽(yáng)性（玫瑰紅色），報(bào)告檢出大腸桿菌；MUG陰性（無(wú)熒光）、靛基質(zhì)陰性（無(wú)色），報(bào)告未檢出大腸桿菌。4.8 分離培養(yǎng) 如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性時(shí)，將上述供試品BL。增菌培養(yǎng)液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)沾取12環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察EMB平板有無(wú)可疑大

12、腸桿菌菌落生長(zhǎng)。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照的平板呈典型菌落生長(zhǎng)時(shí)，供試品分離平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，或有菌落但不同于表1所列特征，可判為供試品1g或1ml未檢出大腸桿菌。表1 大腸桿菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌 落 形 態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）典型菌落呈紫黑色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，有金屬光澤。非典型菌落呈淺紫色、粉紅色，或菌落中心紫色或無(wú)明顯暗色中心，無(wú)金屬光澤。麥康凱瓊脂典型菌落呈鮮桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)。非典型菌落呈微紅色，或菌落中心呈紅色。 當(dāng)陽(yáng)性菌對(duì)照平板未生長(zhǎng)或生長(zhǎng)菌落經(jīng)檢查不是大腸桿菌，應(yīng)研究原因，重新試驗(yàn)或重新制備供試液，以消除供試品抑菌成分的影響。有疑似菌落生長(zhǎng)者

13、，挑取可疑菌落做革蘭染色、鏡檢、IMVic試驗(yàn)。4.9 純培養(yǎng) 如生長(zhǎng)菌落與表1所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個(gè)疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選23個(gè)以上疑似菌落，分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)1824小時(shí)，作以下檢查。 如平板上無(wú)單個(gè)可疑菌落，但有可疑菌團(tuán)（紫黑色，或有金屬光澤），應(yīng)沾取可疑菌團(tuán)培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液劃線接種于EMB瓊脂平板，培養(yǎng)1824小時(shí)，再挑選單個(gè)疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。4.10 革蘭染色、鏡檢4.10.1 以接種環(huán)沾取無(wú)菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過火焰23次（載玻片不燙手

14、）固定。4.10.2 滴加結(jié)晶紫染液，染色1分鐘，水洗。4.10.3 滴加碘液，媒染1分鐘，水洗，以濾紙吸干余水。4.10.4 滴加95%乙醇，脫色2030秒鐘，水洗。4.10.5 滴加沙黃染液，復(fù)染1分鐘，待干后，鏡檢。4.10.6 染色結(jié)果 革蘭陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色；革蘭陰性菌呈紅色。大腸桿菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。4.10.7 注意事項(xiàng)4.10.7.1 玻片必須潔凈，涂片菌量宜少，菌不可濃。否則，菌細(xì)胞成堆或連成片。染色反應(yīng)難于判斷，菌細(xì)胞形態(tài)難于觀察。4.10.7.2 培養(yǎng)物的菌齡以1624小時(shí)為宜。培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)的革蘭陽(yáng)性菌易染成紅色。4.10.7.3 脫色是關(guān)鍵，脫色時(shí)間

15、不足菌細(xì)胞易染成陽(yáng)性，脫色時(shí)間過長(zhǎng)易染成陰性。4.11 生化試驗(yàn)4.11.1 乳糖發(fā)酵試驗(yàn) 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)2448小時(shí)，觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色；指示劑為溴麝香草酚藍(lán)者為黃色），產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無(wú)論大?。?為避免遲緩發(fā)酵乳糖產(chǎn)生假陰性，亦可接種5%乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，可于24小時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性?；蜻m當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。4.11.2 靛基質(zhì)試驗(yàn)（1） 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)2448小時(shí)，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)試管，液面呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。98%的大腸桿菌靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽(yáng)性。一般24小時(shí)即可出

16、現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，以無(wú)菌操作先從管中取出1或2ml培養(yǎng)液進(jìn)行檢查，如靛基質(zhì)是陰性，余下的蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng)24小時(shí)，作靛基質(zhì)試驗(yàn)。4.11.3 甲基紅試驗(yàn)（M） 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2小時(shí)，于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液23滴（約每ml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕微搖動(dòng)，立即觀察，呈鮮紅色或桔紅色為陽(yáng)性，呈黃色為陰性。4.11.4 乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（V-P） 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2小時(shí)，于2ml培養(yǎng)液中加入-萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40%氫氧化鉀試液0.4ml，充分振搖，在4小時(shí)（通常在30分鐘）

17、內(nèi)出現(xiàn)紅色應(yīng)判為陽(yáng)性，無(wú)紅色反應(yīng)為陰性。4.11.5 枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C） 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24天，培養(yǎng)基斜面有菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽(yáng)性，培養(yǎng)基顏色無(wú)改變、無(wú)菌苔生長(zhǎng)為陰性。4.12 結(jié)果判斷4.12.1 當(dāng)陰性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)MUG呈陽(yáng)性，供試晶MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸桿菌。MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸桿菌。4.12.2 MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性、IMVic試驗(yàn)為 + 、革蘭陰性桿菌，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸桿菌；MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性、IMViC試驗(yàn)為 + + 、革蘭

18、陰性桿菌，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸桿菌。4.12.3 供試品培養(yǎng)物檢查不符合9.6.2二項(xiàng)中的任一項(xiàng)，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸桿菌。4.12.4 當(dāng)陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)或陽(yáng)性對(duì)照未生長(zhǎng)或生長(zhǎng)菌落不是大腸桿菌，不能作出檢驗(yàn)報(bào)告。4.13 注意事項(xiàng)4.13.1 MUG法不必從混合菌中分離單個(gè)菌落。除大腸埃希菌外，尚有部分志賀菌屬、沙門菌屬的菌株；以及少數(shù)革蘭陽(yáng)性球菌、桿菌和芽孢菌，其MUG為陽(yáng)性。因此，在MUG培養(yǎng)基成分中增加丁去氧膽酸鈉，可排除革蘭陽(yáng)性菌的干擾。至于志賀菌、沙門菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中較難生長(zhǎng)，即使有生長(zhǎng)，本法能檢出。既然藥品中不得檢出大腸桿菌，更不允許檢出志賀菌、沙門菌。4.13.2 配制MUG培養(yǎng)基時(shí)，務(wù)必校正pH值，滅菌后pH不得過7.4，否則pH值偏高，MUG分解，本身則顯熒光；分裝MUG培養(yǎng)基的試管應(yīng)挑選，試管、蛋白胨不得顯熒光。4.13.3 培養(yǎng)時(shí)間 供試品培養(yǎng)液接種于MUG培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間，一般在4小時(shí)、24小時(shí)觀察是否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能準(zhǔn)確判斷時(shí)，可延長(zhǎng)培養(yǎng)至48小時(shí)再觀察結(jié)果。由于大腸埃希菌各菌株間的GUD的活性不完全相同，對(duì)底物和底物的濃度反應(yīng)的差異；培養(yǎng)基中選擇因子的影響；培養(yǎng)時(shí)間、溫度；pH的改變；大量競(jìng)爭(zhēng)菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾等，對(duì)結(jié)果的判斷亦有影響。4.13.4 結(jié)果觀察 取供試品的MUG