苔蘚植物對重金屬污染的響應機理和生物指示的研究

1、苔蘚植物對重金屬污染的響應機理和生物指示的研究摘要隨著人類活動對環(huán)境干擾程度的日益加劇，利用生物對環(huán)境污染進行指示和檢測成為當前對環(huán)境生物學研究的熱點之一。苔蘚植物作為一類良好的指示植物，被世界各國廣泛應用為環(huán)境污染和變化的指示生物。但有關苔蘚植物對環(huán)境污染的響應及機理研究僅有少數(shù)研究和報道。本論文在成功利用組培技術大量擴繁小立碗蘚、細葉小羽蘚和葡枝青蘚配子體的基礎上，采用先進的同步輻射熒光分析技術和生理生化測定分析，開展了組培條件下試管內(nèi)苔蘚植物的重金屬脅迫實驗，深入研究了重金屬脅迫下種蘚類植物的重金屬及營養(yǎng)元素的積累規(guī)律及其生理生化響應，探討蘚類植物對環(huán)境污染的響應機理及其生物指示作用。主

2、要的研究結果如下：（1）在大量的比較實驗基礎上，系統(tǒng)完成了細葉小羽蘚和葡枝青蘚的組培研究工作并建立了兩種蘚類配子體植株高效的人工快繁系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，對于兩種蘚類植物配子體在試管內(nèi)快繁而言，基本培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)基中外源蔗糖濃度、激素條件以及培養(yǎng)瓶內(nèi)外狀況都會對試管內(nèi)生長的配子體產(chǎn)生重要影響。本研究最終確定的兩種蘚類配子體試管內(nèi)快繁的最佳條件是：改良的基本培養(yǎng)基添加的蔗糖；值調(diào)整在至；培養(yǎng)瓶內(nèi)空氣相對濕度保持在至之間；培養(yǎng)瓶要具有適度的透氣性；培養(yǎng)溫度為±；光照時間為；光照強度為至。上述相關研究成果獲得了項國家發(fā)明專利的授權，同時獲得了重金屬脅迫實驗所需的兩種蘚類配子體材料。上海師范大

3、學博士學位論文體對元素累積能力和吸收敏感性都非常強，其植株體中的元素含量適合于作為評估環(huán)境污染程度的量化指標。同樣的比較分析表明，細葉小羽蘚對元素和元素的累積能力和吸收敏感性都很強，其配子體內(nèi)元素和元素的含量適合于作為這指示環(huán)境中兩種重金屬污染的量化指標。重金屬復合脅迫對蘚類配子體中重金屬的累積能力有顯著影響。以與形成的三種不同重金屬復合污染處理時發(fā)現(xiàn)，較低濃度的對三種蘚類吸收均具有強烈的拮抗作用，在很大程度上緩解了此三類重金屬對蘚類的毒害作用。采用微探針掃描分析技術研究了配子體莖葉中重金屬元素微區(qū)分布，在組織和細胞水平上揭示了蘚類植物莖葉吸收累積重金屬的機制。同時，進一步證實，供試三種蘚類均

4、具有強烈的重金屬累積能力和敏感的生物響應特性，可作為監(jiān)測環(huán)境重金屬污染的生物指示植物。（2）深入分析了重金屬脅迫對蘚類植物營養(yǎng)元素吸收的影響。結果表明，一定濃度的重金屬離子對配子體生長所需的多種營養(yǎng)元素的吸收產(chǎn)生拮抗作用并抑制配子體對營養(yǎng)元素的吸收利用。在重金屬單一污染條件下，隨著污染濃度的增高，供試三種蘚類植物配子體中營養(yǎng)元素的累積量呈現(xiàn)出兩種變化趨勢。第一種是營養(yǎng)元素累積量先升高后降低，即低污染濃度的重金屬促進了蘚類配子體中營養(yǎng)元素的累積，而過高污染濃度則會降低元素的累積量。第二種是營養(yǎng)元素累積量隨污染濃度增高呈直接下降趨勢。重金屬種類不同，蘚種不同，配子體中各種營養(yǎng)元素吸收和累積的受抑制

5、強度不同。供試的四種重金屬離子污染下，細葉小羽蘚配子體中六種營養(yǎng)元素的最大降幅均低于小立碗蘚，表明細葉小羽蘚對上述種重金屬污染的耐受性都很強，最適合于作為環(huán)境重金屬污染長期監(jiān)測的指示植物。污染下，在最低污染濃度和最短污染時間的處理組，匐枝青蘚配子體中六種營養(yǎng)元素的含量就表現(xiàn)出顯著的變化。說明匐枝青蘚植株對鉛污染產(chǎn)生的營養(yǎng)元素累積響應非?？焖?，適合作為鉛污染的指示植物。在污染濃度至污染濃度之間，匐枝青蘚配子體中四種元素含量與污染濃度之間均呈現(xiàn)顯著線性回歸關系。說明在供試污染濃度范圍內(nèi)，污染濃度與匐枝青蘚配子體中四種營養(yǎng)元素含量之間存在劑量效應關系，建議利用匐枝青蘚中的這四種營養(yǎng)元素含量作為監(jiān)測環(huán)

6、境重金屬污染（3）通過組培條件下的重金屬脅迫實驗，運用技術，測定分析了不同濃度等重金屬離子單一或復合脅迫下，種蘚類的重金屬元素的積累規(guī)律。單一重金屬污染時，隨著重金屬離子污染濃度的增高，配子體中相應重金屬元素的累積量呈現(xiàn)顯著增高趨勢。蘚類植物種類不同，其配子體對重金屬的累積能力和吸收敏感性也有差異。供試三種蘚類比較，匐枝青蘚植株上海師范大學博士學位論文摘要的輔助生理指標。不同種類重金屬復合脅迫對于配子體不同種類營養(yǎng)元素吸收和累積表現(xiàn)出三種不同的脅迫效應，一種是緩解累積抑制效應，一種是增強累積抑制效應，一種是顯著促進累積效應。（4）采用生理生化分析方法，測定分析了不同重金屬脅迫下種蘚類植物的生理

7、響應和變化。結果表明，三種供試蘚類總葉綠素含量對重金屬污染的生物響應均非?？焖伲f明三種蘚類植物對重金屬污染反映敏感，適合于作為指示重金屬污染的指示生物。污染導致三種蘚類葉綠素的降低幅度最大，說明葉綠素含量的降低是污染導致植物光合作用受抑制的重要原因之一。不同種類單一重金屬污染脅迫下，三種蘚類植物酶活性響應表現(xiàn)出兩種變化規(guī)律，一種是隨著重金屬污染濃度的增高，酶活性逐漸增強；一種是重金屬低污染濃度范圍內(nèi)，酶活性逐漸增強，當污染濃度較高時，酶活性顯著較低。供試三種蘚類的酶活性與重金屬污染濃度之間以及含量與重金屬污染濃度均存在顯著的劑量效應關系，可以擬合形成曲線回歸關系顯著的函數(shù)方程，因此建議將苔蘚

8、的酶活性和含量作為監(jiān)測環(huán)境重金屬污染的輔助生理指標進行推廣應用。綜上所述，本研究在分析種蘚類植物對重金屬污染響應的基礎上，進一步證明苔蘚植物是作為環(huán)境重金屬污染的敏感的良好的指示植物，為進一步利用苔蘚植物監(jiān)測和指示環(huán)境污染和變化提供了科學依據(jù)。關鍵詞：苔蘚植物，組織培養(yǎng)，重金屬累積，營養(yǎng)元素累積，生理響應，環(huán)境指示研究目的意義及內(nèi)容針對苔蘚植物對環(huán)境污染的響應及機理研究較為薄弱，本論文研究中，在完成和獲得種蘚類植物組培擴繁的配子體材料的基礎上，開展組培條件下的重金屬污染脅迫試驗，并采用先進的同步輻射技術測定分析了蘚類配子體中多種元素的含量及其在莖葉中的微區(qū)分布規(guī)律，在組織及細胞層面探討苔蘚植物

9、對重金屬污染物吸收累積機制，為利用苔蘚植物監(jiān)測環(huán)境重金屬污染提供科學依據(jù)。同時，應用生理生化分析的技術方法，探討和分析苔蘚植物對重金屬污染的生理響應及其對環(huán)境指示的意義。研究結果可為深入了解苔蘚植物對環(huán)境污染的響應及指示作用，進一步科學篩選適合于環(huán)境指示的苔蘚種類及相應的生理生化指示指標，以及更好地推廣應用苔蘚植物指示環(huán)境質量和變化提供科學依據(jù)和相應的技術。本論文的主要研究內(nèi)容包括：（1）在試管內(nèi)大量擴繁實驗室原有的小立碗蘚組培配子體材料的基礎上，再新建立種蘚類植物細葉小羽蘚和匐枝青蘚的組培快繁系統(tǒng)，并在試管內(nèi)擴繁獲得大量生長一致的配子體材料用于重金屬污染脅迫試驗。（2）在組培條件下，開展種蘚

10、類植物試管小生境內(nèi)的重金屬污染脅迫試驗。（3）采用基于同步輻射光源的射線熒光分析方法測定不同種類重金屬污染脅迫下的種蘚類配子體中相應重金屬元素和主要營養(yǎng)元素的含量，以此為基礎分析探討苔蘚植物對重金屬污染的生物響應機理。（4）應用基于同步輻射光源的的熒光微探針掃描分析技術測定和分析重金屬元素在苔蘚植物莖葉中的吸收累積途徑和微區(qū)分布特性，在組織及細胞層面探討苔蘚植物對重金屬污染物吸收累積機制。（5）用生理生化分析方法，分析測定重金屬污染脅迫下的苔蘚植物種生理生化指標的的變化，包括光合色素含量、過氧化物酶活性和丙二醛含量，以此為基礎分別從苔蘚植物光合作用特性、重金屬脅迫的適應性及膜脂過氧化損傷程度三

11、個方面探討苔蘚植物對重金屬污染的響應機制；篩選與重金屬污染程度具有相關性的生理指標用于環(huán)境重金屬污染的長期監(jiān)測。苔蘚植物對生態(tài)環(huán)境的巨大作用是隨著全球生態(tài)環(huán)境問題的日益嚴重及相關研究的深入才被人類逐漸認識的。與其他植物種類相比，苔蘚植物對生態(tài)環(huán)境變化具有較高敏感性，是公認的優(yōu)良生物指示物; 另一方面，苔蘚植物的“拓荒形象”、可觀的生物量和凈生產(chǎn)量也不容忽視，因而其在全球生態(tài)系統(tǒng) C /N循環(huán)、氣候變遷，以及水土保持等方面也具有重要的作用。但是對苔蘚植物的研究與其他高等植物相比起步較晚，關于其在生態(tài)系統(tǒng)中功能的系統(tǒng)研究還相當薄弱，生態(tài)環(huán)境變化對苔蘚植物生態(tài)系統(tǒng)影響的研究更是不足。而且，目前研究所

12、涉及的領域也比較窄主要是泥炭地，涉及的苔蘚植物種類也很少主要是泥炭蘚和模式植物小立碗蘚( Physcomitrella patens) ，國內(nèi)關于苔蘚 植 物 生 態(tài)環(huán)境作用研究的學者更是寥寥無幾，與西方國家的研究水平還存在著較大差距。隨著人類活動對全球生態(tài)環(huán)境的影響，生物( 尤其是人類和植物) 的生存空間受到了嚴重的破壞，如何利用植物準確便捷的對環(huán)境污染和全球生態(tài)變化進行指示和監(jiān)測已成為當前全球生態(tài)環(huán)境研究的熱點問題之一。然而，由于對苔蘚植物重視程度不夠，導致大量稀有苔蘚物種的滅絕以及生物多樣性的減少，2004 年通過的中國首批瀕危苔蘚植物紅色名錄已達82 種。深入調(diào)查，建立全球苔蘚植物多樣

13、性數(shù)據(jù)庫和空間分布圖，研究植被破壞與恢復過程中苔蘚植物群落的演替，預測植被和環(huán)境的變化發(fā)展方向，加大對苔蘚植物物種多樣性的保護迫在眉睫。有關苔蘚植物生態(tài)環(huán)境功能的研究還有待探討與完善，綜合生理生態(tài)學、生物化學、分子生態(tài)學、遙感等多門學科的研究方法與手段，深入探討其作用規(guī)律與機理。 第六章苔蘚植物對重金屬污染的生理響應和生物指示作用引言當植物暴露于重金屬污染環(huán)境之中時，懸浮于空氣中的重金屬微粒會沉積于植物體上，形成一層阻絕層，會嚴重減少植物細胞內(nèi)葉綠素對日光的捕捉和吸收，從而降低了光合速率，引起植物體生長不良。當重金屬污染物被吸收到植物體內(nèi)并富集累積至一定濃度之后，植物體會遭受嚴重的化學毒害作用

14、。最常見的毒害作用是引起葉綠素的降解，葉片出現(xiàn)褐化，白化，黑斑，蔫黃等癥狀（方炎明等，），影響植物的光合作用（龔雙姣等，）、呼吸作用，破壞細胞膜結構，并對植物細胞的遺傳物質產(chǎn)生危害。很多重金屬都被證實能直接或者間接地通過形成活性氧，使植物體內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫，導致細胞膜脂質的過氧化，蛋白質、色素、酶、核酸等的氧化損傷，嚴重者可致使植物死亡（劉素純等，）。關于植物對重金屬污染的生物響應和生物指示作用這方面的工作，國外有學者已做過較多的研究，但多以種子植物為實驗材料，且大多是針對農(nóng)作物。而國內(nèi)以苔蘚植物為研究對象開展相關研究工作的實驗室很少。本文分別以組培擴繁的小立碗蘚、細葉小羽蘚和匐枝青蘚配子體為試

15、驗材料，在試管內(nèi)采用單一重金屬污染液進行污染處理，研究苔蘚植物對重金屬污染的生物響應及其生物指示作用，旨在為利用蘚類植物監(jiān)測環(huán)境重金屬污染提供科學依據(jù)。試驗材料與方法試驗材料試管內(nèi)旺盛生長且生長一致的小立碗蘚、細葉小羽蘚和匐枝青蘚配子體。試驗方法單一重金屬污染試驗設計供試的四種重金屬離子分別為單一重金屬離子污染濃度。試管內(nèi)生長的三種蘚類重金屬污染處理方法無菌條件下，向長有生長旺盛且長勢均一的蘚類配子體的培養(yǎng)瓶內(nèi)加入含不同濃度的單一、和的污染液，在固體培養(yǎng)基表面形成約厚的污染液層，浸泡三種蘚類配子體基部莖葉。培養(yǎng)天，然后取樣，以蒸餾水處理作為空白對照，進行生理指標測定。苔蘚植物光合色素含量的。測

16、定方法按照方法原理，采用分光光度法測定，以乙醇作為提取劑郝建軍等，。苔蘚植物過氧化物酶活性的測定方法采用愈創(chuàng)木酚比色法測定郝建軍等，。精確稱取蘚類配子體克加磷酸二氫鉀，在冰浴中研磨成勻漿。離心分鐘。將上清液用滴管吸出，即為酶液。保存在冰箱中。一個反應混合液磷酸二氫鉀作為對照。另一個反應混合液酶液。在波長下測量值，每隔秒讀數(shù)一次讀數(shù)。苔蘚植物丙二醛含量的測定方法采用二硫代巴比妥酸顯色法測定（王學奎，）。精確稱取克，加的三氯乙酸和少量石英砂，研磨成勻漿后，再加，進一步研磨，最后加，倒入離心管。離心分鐘。上清液硫代巴比妥酸，混勻，沸水浴分鐘。（對照：蒸餾水硫代巴比妥酸），迅速冷卻后，再離心分鐘。取上

17、清液在和波長下比色，測定吸光值。利用公式：，進行計算，再根據(jù)物質含量物質濃度提取液體積稀釋倍數(shù)樣品鮮重，算出可溶性糖和丙二醛的含量。（：可溶性糖濃度；：丙二醛濃度）數(shù)據(jù)處理本章數(shù)據(jù)均采用次重復實驗的平均值±標準差的形式，苔蘚植物的各項生理指標的含量均以配子體鮮重表示。原始數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析使用國際標準統(tǒng)計軟件進行。制圖采用軟件完成。討論與總結植物葉綠素含量和光合作用對各種不同重金屬的響應是有差異的，但總體規(guī)律表現(xiàn)為隨著重金屬污染脅迫濃度的升高，葉綠素含量的總體水平降低陳國祥等，；江行玉等，；代林全，。徐燕云等對不同濃度脅迫后大灰蘚總葉綠素含量進行測定分析，結果顯示，在低濃度脅迫

18、下，總葉綠素含量不降反升。當濃度為時總葉綠素含量開始下降徐燕云等，。本實驗結果也證實了此種現(xiàn)象的存在。在供試最低污染濃度脅迫下，細葉小羽蘚和匐枝青蘚中總葉綠素含量顯著高于對照組；在最低污染濃度脅迫下，細葉小羽蘚的總葉綠素也顯著高于對照組。等研究表明，處于正常環(huán)境下的植株體一旦遭遇污染脅迫，機體的器官組織、細胞及細胞內(nèi)酶系等不同層面上會立即做出應激反應。應激反應的產(chǎn)生可能預示著植物對污染脅迫的生物響應比較迅速。據(jù)王澤港等報道，、和可引起水稻葉片葉綠素含量降低，其中以的作用最為明顯王澤港，駱劍峰，。比較本實驗供試的四種重金屬引起三種蘚類植物總葉綠素含量下降的幅度發(fā)現(xiàn)，也是的作用最為明顯，其次為，然

19、后是，最后是。依據(jù)總葉綠素含量降低速率和降低幅度進行比較，本實驗供試的三種蘚類植物對四種重金屬的耐受性由強到弱順序是：匐枝青蘚細葉小羽蘚小立碗蘚。李榮春李榮春，的研究表明，高劑量的會擾亂光化學合成和電子傳遞的初始反應，使根和莖的生長受到阻礙。楊丹慧的研究表明，等重金屬離子對高等植物葉綠體的光合電子傳遞有抑制作用，而且通常光合系統(tǒng)的活性對重金屬離子更為敏感楊丹慧，。的研究認為重金屬使高等植物的葉綠體含量明顯降低的原因是重金屬離子直接干擾了葉綠素的生物合成，。由此可見，重金屬對光合作用的抑制是其對光合器官結構的破壞以及對葉綠素合成有關酶系統(tǒng)和電子傳遞的共同影響造成的。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，雖然污染與其他

20、三種重金屬污染比較，對三種蘚類植物總葉綠素含量下降的影響最小，但其導致三種蘚類葉綠素的降低幅度最大。小立碗蘚、細葉小羽蘚和匐枝青蘚的葉綠素的最大降幅分別為、和。植物細胞中葉綠素全部屬于捕光色素，位于光合膜上，負責吸收光能，并將吸收的光能傳遞到反應中心色素。葉綠素含量的降低將會大大降低光能吸收和傳遞的速率，從而降低光合效率。由此可見，葉綠素含量的降低是污染導致植物光合作用的抑制的重要原因之一。重金屬脅迫與其他形式的氧化脅迫相似，能導致大量的活性氧自由基產(chǎn)生自由基能損傷細胞內(nèi)主要的生物大分子，同時引起膜脂過氧化。植物細胞中有多種抗氧化防御系統(tǒng)能夠清除自由基保護細胞免受氧化脅迫的傷害.也是植物忍耐重

21、金屬脅迫的主要機理之一。重金屬脅迫能誘導植物組織中總活性升高，這是植物對所有污染脅迫的共同響應。在適應脅迫中的作用是把轉化為和的有效酶，因此人們建議植物組織中活性水平的變化可作為反應污染脅迫的靈敏指標。本實驗研究證實，供試三種蘚類的酶活性與重金屬污染濃度的關系可以擬合形成曲線回歸關系顯著的函數(shù)方程表，二者存在顯著的劑量效應關系，因而建議將苔蘚的酶活性作為監(jiān)測環(huán)境重金屬污染的輔助生理指標進行推廣應用?？偨Y利用生物對環(huán)境污染進行指示和檢測是當前環(huán)境生物學研究領域的研究熱點之一。苔蘚植物作為一類良好的指示植物，被世界各國廣泛應用為環(huán)境污染和變化的指示生物。但有關苔蘚植物對環(huán)境污染的響應及機理研究僅有

22、少數(shù)研究和報道。本論文在成功利用組培技術大量擴繁小立碗蘚、細葉小羽蘚和葡枝青蘚（1）配子體的基礎上，采用先進的同步輻射熒光分析技術和生理生化測定分析，開展了組培條件下試管內(nèi)苔蘚植物的重金屬脅迫實驗，深入研究了重金屬脅迫下種蘚類植物的重金屬及營養(yǎng)元素的積累規(guī)律及其生理生化響應，探討蘚類植物對環(huán)境污染的響應機理及其生物指示作用。（2）采用生理生化分析方法，測定分析了不同重金屬脅迫下，種蘚類植物的生理響應和變化，包括光合色素含量變化，過氧化酶（活性變化，丙二醛（含量變化。結果表明，三種供試蘚類總葉綠素含量對重金屬污染的生物響應均非?？焖伲f明蘚類植物對重金屬污染反映敏感，適合于作為指示重金屬污染的指

23、示生物。主要創(chuàng)新點（1）利用自主建立的蘚類植物試管小生境內(nèi)重金屬污染脅迫試驗體系進行苔蘚植物對重金屬污染脅迫的響應及其機制的研究。先進的同步輻射技術在試驗中的應用。（2）為進一步推廣應用苔蘚植物監(jiān)測和指示環(huán)境重金屬污染的變化，利用分布廣泛、適應性強、且符合作為環(huán)境污染指示植物特征的細葉小羽蘚和匐枝青蘚作為供試材料，通過污染脅迫試驗篩選出適宜的生理生化指標作為指示環(huán)境重金屬污染的輔助監(jiān)測指標。研究展望（1）作為一種生物監(jiān)測方法，利用苔蘚植物監(jiān)測環(huán)境重金屬污染，近年來，在國內(nèi)外已開展了大量研究并已得到廣泛推廣應用。但目前對苔蘚生物監(jiān)測方法的研究和應用主要集中在以生態(tài)法或化學分析法監(jiān)測大氣重金屬污染

24、，而關于苔蘚植物對于環(huán)境重金屬污染的響應及機理和生物指示等方面的研究尚處于起步階段。本文選擇了試管內(nèi)生長的三種蘚類植物的配子體，利用四種重金屬元素、和作為污染物開展了苔蘚植物對于環(huán)境重金屬污染的響應及機理研究，運用技術，測定分析了不同濃度，等重金屬離子單一或復合脅迫下，種蘚類的重金屬元素和營養(yǎng)元素的積累規(guī)律，采用微探針掃描分析技術研究了配子體莖葉中重金屬元素微區(qū)分布特征，采用生理生化分析方法，測定分析了不同重金屬脅迫下，種蘚類植物的生理響上海師范大學博士學位論文第七章總結與展望應和變化。關于三種蘚類植物對重金屬污染的響應及機理和生物指示方面的研究取得了一些成果，但對其他重金屬和非金屬污染物以及多種重金屬復合污染下，苔蘚植物所產(chǎn)生生物響應及機理還需進一步研究。（2）本研究結果表明，重金屬污染條件下，蘚類植物的多種生理指標的變化都與單一重金屬污染濃度之間具有劑量效應關系，因而可作為監(jiān)測環(huán)境重金屬污染