質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染注意事項

1、精華質(zhì)粒DNA專染注意事項：聚焦轉(zhuǎn)染專輯終結(jié)篇（中）【字體：大中小】時間：2005年08月19日I&I來源：生物通一、質(zhì)粒的構(gòu)建：啟動子的選擇啟動子的選擇對于轉(zhuǎn)染基因的有效表達是非常重要的。對于轉(zhuǎn)染過程本身雖然無甚影響，但是對轉(zhuǎn)染結(jié)果卻有著微妙的影響。啟動子可分為2大類：誘導(dǎo)型啟動子是比較精明的，平時歇著，一旦接到誘導(dǎo)信號指示就馬上開工干活兒。而組成型啟動子比較老實的，就是從頭到尾不停干活從不閑著的那種一一比如我們很熟悉的CMW動子啊，SV40啊，pMC1W,PGK0動子啊等等。獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMW動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活

2、性。在BHK-21中，CMV啟動子活性比其他啟動子如SV40和RSVO要高。但這三種病毒啟動子在T細胞來源的細胞系，如Jurkat中組成表達水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMAT以?脫活Jurkat細胞中CMW動子，而單PMAft足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白細胞）中的CMW動子。SV40啟動子的表達在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7時會提高，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。一個強悍的高表達組成型啟動子是我們做表達所求之不得的，但是對于轉(zhuǎn)染本身來說卻不一定好一一因為任何持續(xù)過高表達外源基因都可能帶來某種程度的細胞毒性，影響細胞生長一一如果外源基因本身對細胞生長有

3、毒，那更完蛋了，你很可能篩不到轉(zhuǎn)染成功的細胞株，更別提穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了一一因為過量表達本身可能已經(jīng)害死了那個轉(zhuǎn)染了的細胞，沒轉(zhuǎn)染的細胞又死于篩選壓力。這種時候一個不那么“能干”的啟動子可能更適合一些。如果你曾經(jīng)遇到原因不明的轉(zhuǎn)染失敗案例，會不會是這個原因呢？過猶不及就是這個道理咯。誘導(dǎo)型啟動子對于轉(zhuǎn)染來說，特別是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可能是更好的選擇。它使得目的基因的表達可以受到我們的調(diào)控一一轉(zhuǎn)染的時候不表達，篩選穩(wěn)定表達株后再誘導(dǎo)表達，使得表達有毒性的基因或者精確分析表達產(chǎn)物的生物學(xué)效應(yīng)成為可能。多數(shù)誘導(dǎo)型啟動子在接受某種信號后“打開開關(guān)”開始工作，也有的相反，在缺失某種信號后打開開關(guān)。Clontech還有個

4、誘導(dǎo)系統(tǒng)是“劑量依賴的”，就是說不單表達開關(guān)可控，表達量多少也可以通過誘導(dǎo)劑使量來調(diào)控。還有一種特殊的啟動子很好玩一一具有時序性或者組織特異性（空間特異性），會受到特定的元件調(diào)控，在一定的時間或者特定組織細胞中表達的，比如那個轉(zhuǎn)基因山羊奶里用的只在泌乳期的乳腺細胞中表達的啟動子一一有人說這是組成型的，我覺得應(yīng)該是誘導(dǎo)型的，只不過誘導(dǎo)的因素我們不知道罷了，這類啟動子在不同的細胞中會有不同的表現(xiàn)，需要注意。誘導(dǎo)系統(tǒng)的問題主要是本底表達，表達量有限，以及誘導(dǎo)劑本身對細胞的影響和如何清除，不過這些都不關(guān)轉(zhuǎn)染的事，我們等生物通的表達專輯時再慢慢說吧。轉(zhuǎn)染DNA勺啟動子-增強子如果不被宿主細胞識別也會產(chǎn)生

5、無法表達的“悲劇”，這是實驗設(shè)計時需要注意的問題。不過現(xiàn)在利用現(xiàn)成試劑盒或者模擬國外已經(jīng)成功的實驗的居多，獨立構(gòu)建表達系統(tǒng)的極少，因而這種問題遇到的幾率也幾乎可以忽略不計。目的基因：這個對于研究人員來說是目的，因而沒有選擇的余地。如果你的目的基因正好會影響選定細胞株的生長，甚至有毒，那最好選擇一個誘導(dǎo)型的啟動子，不然你可能總是轉(zhuǎn)染不了。但是通常在實驗之前我們不清楚我們研究的基因產(chǎn)物是否對選定的細胞有毒，所以正負對照很重要。當(dāng)排除其他原因后轉(zhuǎn)染總是失敗，應(yīng)當(dāng)從根本上考慮原因。二、質(zhì)粒的大小和質(zhì)量線性化還是超螺旋會影響轉(zhuǎn)染結(jié)果：超螺旋質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比線性DN*得多，特別是瞬時轉(zhuǎn)染。而線性化DNA專

6、染的整合幾率高。質(zhì)粒太大了轉(zhuǎn)染會困難一些。畢竟，相對致密、較小的外源異物被細胞內(nèi)吞的幾率要大一些。如果你的質(zhì)粒正好比較大，又沒有經(jīng)驗，選擇特別注明可以轉(zhuǎn)大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑成功幾率會高一些。有的轉(zhuǎn)染試劑還會提供一些促進DNAS聚的成分，使得DNAf成轉(zhuǎn)染復(fù)合物時更致密一些，更容易轉(zhuǎn)染一些。純化質(zhì)粒的質(zhì)量無疑會影響轉(zhuǎn)染效率。哺乳動物細胞總歸是比大腸桿菌嬌氣，轉(zhuǎn)染難度高些，因而要求的DNA屯度要更高些。早年要做轉(zhuǎn)染真是大陣仗啊，光是提質(zhì)粒做超離就令人皺眉。最令人頭疼的是內(nèi)毒素了。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上特有的成分，主要是脂多糖中的類脂A（lipopolysaccharides）,在細菌被裂解時被釋

7、放出來，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性，在質(zhì)粒提取的過程中內(nèi)毒素很容易混入質(zhì)粒DNA中共同純化出來。內(nèi)毒素的存在會嚴重地影響轉(zhuǎn)染效率，此外內(nèi)毒素可能會激活造血細胞（例如B細胞、巨嗜細胞等）的非特異免疫反應(yīng)，造成實驗中的假陽性。所以質(zhì)粒DNA專染時應(yīng)盡量采用無內(nèi)毒素污染的超純質(zhì)粒。幸好技術(shù)的進步令復(fù)雜的操作成為過去，多數(shù)實驗室會選擇使用轉(zhuǎn)染級別的質(zhì)粒純化試劑盒純化的質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染。對于一些“耐受性高、容易操作的”細胞株，普通的Kit已經(jīng)夠了。對于一些對內(nèi)毒素特別敏感的細胞，就要用“去內(nèi)毒素”的質(zhì)粒純化Kit了。Qiagen的Endofree系列可以得到相當(dāng)于2次CsCl超速離心純度的質(zhì)粒，同時特別設(shè)計去除內(nèi)毒

8、素，專為最嬌氣的細胞系轉(zhuǎn)染和體內(nèi)DNAS苗而設(shè)計。此外現(xiàn)在Invitrogen和Stratagene都有一些快速純化質(zhì)粒同時也去內(nèi)毒素的Kit,使得去除質(zhì)粒中的內(nèi)毒素更為簡便（參考生物通質(zhì)粒純化專輯）。質(zhì)粒DNA勺濃度和量：既然質(zhì)粒純化已經(jīng)不成問題，初學(xué)者通常都不會在乎甚至愿意多加點DNA但是要注意的是，DNA1過少固然轉(zhuǎn)染效率不高，DNA量過多同樣會降低轉(zhuǎn)染效率。有的初學(xué)者習(xí)慣按照說明書123地去操作而不求甚解，你“知其然”是否還“知其所以然”呢？DNA轉(zhuǎn)染試劑的比例的優(yōu)化是非常重要的，特別是對于陽離子脂質(zhì)體、多胺等帶電荷的轉(zhuǎn)染試劑來說，DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物所帶的凈電荷是由轉(zhuǎn)染試劑和DNA勺比例決定的，而轉(zhuǎn)染復(fù)合物是否能更好地結(jié)合到帶負電的細胞膜上，很大程度取決于這個凈電荷。所以預(yù)實驗需要按照說明書的要求，按一定比例混合適量的質(zhì)粒DN郊口轉(zhuǎn)染試劑。有的轉(zhuǎn)染試劑要求DNA勺量多些，有的轉(zhuǎn)染試劑效率高只要很少DNA比如Effectene只需要常規(guī)五分之一的DNA所以轉(zhuǎn)染前最