HPLC高效液相色譜培訓(xùn)--

1、Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu一、基本原理和特點(diǎn)： 基本原理：溶于流動(dòng)相中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，各組分與固定相發(fā)生相互作用，由于其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中先后流出。 特點(diǎn)：分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣、操作自動(dòng)化。Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu二、高效液相色譜儀器1、流程溶劑 色譜泵自動(dòng)進(jìn)樣器 HPLC色譜柱

2、檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu2、高效液相色譜儀組成1、輸液系統(tǒng)：高壓輸液泵（帶脫氣裝置）2、進(jìn)樣系統(tǒng)：耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置3、分離系統(tǒng)：色譜柱4、檢測系統(tǒng)：紫外、二極管陣列、熒光、蒸發(fā)光散射等5、數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu（l）紫外檢測器 靈敏度高； 線形范圍高； 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。 （2）二極管陣列檢測器（ 可實(shí)施一個(gè)樣品的全波長掃描； 可同時(shí)給出紫外光譜和色譜圖，便于組分定性和定量； 可進(jìn)行峰的純度檢測； 可提供各種類型的色

3、譜圖（單波長色譜圖、任意兩個(gè)波長的吸收比色譜圖、最大吸收波長色譜圖以及總體吸收色譜圖）。Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu（3）示差折光率檢測器除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；l 可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；l 幾乎所有物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此差示折光檢測器是一種通用型檢測器。靈敏度可達(dá)10-7g/cm3。主要缺點(diǎn)：對(duì)溫度變化敏感，靈敏度低、并且不能用于梯度淋洗。Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu（4）熒光檢測器 高靈敏度、高選擇性； 對(duì)多環(huán)芳烴、維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥

4、、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu（5）蒸發(fā)光散射檢測器 由霧化器、加熱漂移管（溶劑蒸發(fā)室）、激光光源和光檢測器（光電轉(zhuǎn)換器）等部件構(gòu)成。 色譜柱流出液導(dǎo)入霧化器，被載氣（壓縮空氣或氮?dú)猓╈F化成微細(xì)液滴，液滴通過加熱漂移管時(shí)，流動(dòng)相中的溶劑被蒸發(fā)掉，只留下溶質(zhì)，激光束照在溶質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過光電倍增管轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。因?yàn)樯⑸涔鈴?qiáng)只與溶質(zhì)顆粒大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)本身的物理和化學(xué)性質(zhì)無關(guān)，所以ELSD屬通用型和質(zhì)量型檢測器。 適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測。Tanghui.pha.shz

5、uTanghui.pha.shzu1、固定相： 吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線性容量較高，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。三、HPLC的固定相和流動(dòng)相Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu 2、流動(dòng)相： 一般把吸附色譜中流動(dòng)相稱作洗脫劑。在吸附色譜中： 對(duì)極性大的試樣往往采用極性強(qiáng)的洗脫劑； 對(duì)極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑； 洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)（0）來衡量。0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)。下表列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的0值。在硅膠吸附劑

6、中0值的順序相同，數(shù)值可換算（0硅膠=0770氧化鋁）。 Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu 3. 對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求：（1）溶劑對(duì)于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑要與檢測器匹配，當(dāng)使用紫外檢測器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。 （3）高純度。由于HPLC靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。勿選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。（5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚

7、等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu4、實(shí)驗(yàn)操作：過濾：0.45um或更小孔徑濾膜 目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。離線脫氣：超聲清洗儀 目的：除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡 氣泡對(duì)測定的影響： 1）泵中氣泡使液流波動(dòng)，改變保留時(shí)間和峰面積 2）柱中氣泡使流動(dòng)相繞流，峰變形 3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動(dòng)Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu5、 洗脫程序： 等度洗脫 梯度洗脫（1）改善分離，加快分析速度；（2）改善峰形，減少拖尾；（3）增加峰容量；（4）強(qiáng)烈滯留的組分不容易殘留在柱上，保持柱性能長期良好；（5）下次分析時(shí)，流動(dòng)相需要一段平衡時(shí)間；（6）不同溶劑的UV吸收程度稍有差異，可能會(huì)引起基線漂移。Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzu四、HPLC的色譜柱Tanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTanghui.pha.shzuTangh