常用的臨床免疫學檢測技術(shù)

1、常用的臨床免疫學檢測技術(shù)第一講 免疫濁度技術(shù)一、免疫濁度法基本原理免疫濁度法是可溶性抗原、抗體在液相中特異結(jié)合，產(chǎn)生一定大小的復合物，形成光的折射或吸收，測定這種折射或吸收后的透射光或散射光作為計算單位。二、免疫比濁法的特點：1、自動化免疫分析穩(wěn)定性好，敏感性高(達ng/L)、精確度高（CV<5%)，干擾因素少，結(jié)果判斷更加客觀、準確，也便于進行室內(nèi)及室間質(zhì)量控制。2、自動化免疫分析快速、簡便，結(jié)果回報時間短，便于及時將各種信息向臨床反饋，又可節(jié)約大量人力物力，利于大批量樣品的處理。3、自動化免疫分析能更好地避免標本之間的污染及標本對人的污染。4、自動化免疫分析可利用多道計數(shù)器、測光儀，

2、同一份樣品同時測定幾十種和臨床有關(guān)的分析項目，血清用量少，具有明顯的應用優(yōu)勢。三、免疫濁度法分類（一）透射光免疫濁度法透射光免疫濁度法是個極簡便的方法，測定方式是測定入射光因反射、吸收或散射后的衰減，讀數(shù)以吸收光單位（A）或OD表示，這種A值反映了入射光和透射光的比率。（二）散射比濁法 散射比濁法應用越來越多，且有替代其他免疫定量法的趨勢。散射比濁的原理是根據(jù)雷利(Rayleigh)公式提出的，當復合物較小時（<3*10）呈全透射，透射與散射相當。當復合物大于入射光波的1/20時，形成不對稱前向散射，在90o以前的角度測量散射光皆取得最佳效果，散射光的量代表復合物的量。1、終點散射比濁法

3、2、速率散射比濁法 速率法的靈敏度與特異性都優(yōu)于終點法，前者的靈敏度比后者高出3個數(shù)量級之多，但終點法穩(wěn)定性好。所謂速率，是在某單位時間內(nèi)形成大于3*10以上的復合物量（不是積累數(shù)），當儀器測定到某一時間單位內(nèi)形成的速率下降時，即出現(xiàn)速率峰，該峰值的高低，即代表抗原的量。 速率散射比濁法有三大特點： 1、時間快，一般在30-60s之內(nèi)就可完成測試； 2、比較準確，因其測定形成速率，抗原多， 速率快； 3、節(jié)省試劑。（三）粒子強化免疫濁度測定法 粒子強化免疫濁度測定法的基本原理是，選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒吸附或交聯(lián)抗體后，當遇到相應抗原時，則發(fā)生聚集，單個膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)，光

4、線可透過。當兩個膠乳顆粒凝聚時，則使透射光減少，這種減少的程度與膠乳凝集成正比，當然也與抗原量成正比。四、免疫比濁法的臨床應用（一）檢測項目1、免疫功能監(jiān)測：免疫球蛋白G、A、M，免疫球蛋白輕鏈、，補體C3、C4測定。2、心血管疾病監(jiān)測:載脂蛋白A、B，脂蛋白(a)，C-反應蛋白等。3、炎癥狀況監(jiān)測:C-反應蛋白，a-酸性糖蛋白，觸珠蛋白，銅藍蛋白等。4、風濕性疾病檢測：ASO、RF、CRP5、腎臟功能檢測：尿微量白蛋白，a-微球蛋白，-微球蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，免疫球蛋白G等。6、營養(yǎng)狀態(tài)監(jiān)測：白蛋白，前白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白等。7、凝血及出血性疾病的檢測：抗凝血酶，轉(zhuǎn)鐵蛋白，觸珠蛋白等。8、血腦屏障監(jiān)

5、測：腦脊液白蛋白，免疫球蛋白G、A、M。（二）免疫濁度法測定中應注意的問題1、偽濁度的影響 偽濁度形成原因很復雜，主要是抗血清含有非特異性的交叉反應性雜抗體成分；增濁劑濃度和反應時間掌握不當；樣品本身的濁度處理不當；試劑的污染和變質(zhì)；器材尤其是比色杯等不夠清潔等因素。2、非特異性散射光的影響 免疫濁度法經(jīng)常受內(nèi)源性光散射的干擾，為避免這些非特異性光散射的影響，應用透射比濁法時需保證抗體組分在3以下，散射比濁法需保證在 0.5以下。 3、鉤狀效應的影響 鉤狀效應存在于各種免疫測定方法中，在免疫濁度測定中也十分明顯?，F(xiàn)在很多儀器已具有檢查鉤狀效應的功能，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便可對樣品稀釋后復測。當病人癥狀與檢

6、測結(jié)果明顯不符時，應懷疑其存在。第二講 固相酶免疫測定技術(shù)一、固相酶免疫測定的原理和類型（一）ELISA的原理 基于抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體保持其免疫學活性，抗原或抗體的酶結(jié)合物既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。 用洗滌的方法使固相載體上形成抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定

7、量分析。由于酶的催化效率很高，故可極大地放大反應的結(jié)果，從而使測定方法達到很高的敏感度。 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：1、固相的抗原或抗體；2、酶標記的抗原或抗體；3、酶反應的底物。根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。（二）ELISA反應的類型：1、雙抗體夾心法 檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：（1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合抗體及雜質(zhì)。（2）加受檢標本，與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。（3）加酶

8、標抗體。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時，固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關(guān)。（4）加底物顯色。夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。在臨床檢驗中，此法適用于檢測各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）、促絨毛膜性腺激素（HCG）等。雙抗體夾心法只適用于二價或二價以上較大分子抗原的檢出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的測定。 2、間接法測抗體 間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

9、(1) 將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。(2) 加稀釋的受檢血清。血清中的特異性抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物，經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。(3) 加酶標抗免疫球蛋白（酶標抗抗體，一般為酶標抗人IgG )。它與固相復合物中的抗體相結(jié)合，從而使該抗體間接地標記上酶。清洗后，固相載體上的酶量與特異性抗體的量相關(guān)。(4) 加底物顯色。顏色深度與標本中受檢抗體量相關(guān)。本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。本法的主要缺點為受檢標本須經(jīng)稀釋（1:50-1:20）的

10、后才能進行測定，否則血清中高濃度的非特異性IgG和其他干擾物質(zhì)會引起陰性本底過高，影響結(jié)果的判斷。3、雙抗原夾心法 反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應的抗體。同屬抗體檢測，與間接法不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。在間接法不適用時（例如包被抗原中的雜質(zhì)可與酶標記的抗入IgG反應），可試用此法。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。在臨床檢驗中，抗HBs的ELISA常采用本法。4、競爭法測抗體 當相應抗原材料中含有與抗入IgG反應的物質(zhì)，而且不易得到足夠的純化抗原進行包被時，可用此法檢測特異性抗體其原理為標本中的抗體和一定量

11、的酶標抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標本中抗體量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗體愈少。因此陽性反應呈色較淺于陰性反應。由于抗原的難得，在包被時多采用捕獲法，即先包被與抗原相應的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。5、競爭法測抗原 小分子抗原和半抗原因缺乏可作夾心的二個或二個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定。競爭法的原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標本中抗原量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少。因此標本中抗原含量較多的，反應呈色較含量少的為淡。小分子激素，藥物等的 ELISA測定多用此法。6、捕獲法測IgM抗體 IgM抗體的檢測用于傳染病的早期診斷中。間接ELISA一般僅適用

12、于檢測IgG抗體。如用酶標記的抗人IgM作為二抗進行間接ELISA測定IgM抗體，標本中同時存在的不同濃度的IgG抗體將與IgM抗體競爭，而使結(jié)合在固相抗原上的IGM抗體相應減少。另外標本中如含有類風濕因子、也會產(chǎn)生干擾。因此用一般的間接法測定IgM抗體不能得到準確的結(jié)果。在捕獲法中，用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合。繼加酶標記針對抗原的特異性抗體，再與底物作用，呈色即與標本中的特異性IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。 二、酶免疫測定的發(fā)展和應用（一）ABC-ELI

13、SAABC為親和素(avidin)、生物素（biotin）、復合物（complex）的略語。親和素是一種糖蛋白，可以和4個生物素分子緊密結(jié)合?？膳c蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。生物素與親和素的結(jié)合，雖非屬免疫反應，但特異性強，親和力大，二者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個親和素分子有四個生物素分子的結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的酶分子，形成一種類似晶格的復合體。因此如把生物素親和素系統(tǒng)與ELISA偶聯(lián)起來，就可大大提高ELISA的靈敏度。ABC-ELISA可分為酶標記親和素-生物素（labeled avidinbiotin,LAB）法和橋連親和素-生物素（bridge

14、 avidin biotin, BRAB）法二種。前者將酶標記在親和素分子上；后者通過BNHS分別制成酶-生物素和抗體-生物素，通過親和素搭橋?qū)⒍呓Y(jié)合起來。利用生物素-親和素系統(tǒng)對熒光免疫技術(shù)的敏感度也有明顯的放大作用。ABC- ELISA已廣泛用于細菌、病毒、寄生蟲感染等的診斷中。（二）酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法Burnette于1981年建立酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法（enzyme linked immunolectrotransfer blot, EITB），并稱之為西部印斑(Western blot). EITB分三個階段進行。第一階段為SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳（SDS-PAGE）?？乖鹊鞍?/p>

15、樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酞胺凝膠中從陰極向陽極泳動，分子量越小，泳動速度越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶） 第二階段為電轉(zhuǎn)移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。選用低電壓（100V）大電流（(1-2A)，通電45分鐘轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。 第三階段為酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜（相當于包被了抗原的固相載體）依次與特異抗體和酶標記第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物，使區(qū)帶染色。陽性反應的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDS- PAGE時加入的分子量標準，確定各組分的分子量。本法綜合了SDS-PAG

16、E的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個有效的分析手段，在蛋白質(zhì)化學中應用廣泛。EITB不僅用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷。（三）斑點-ELISA 斑點-ELISA (dot - ELISA)的特點是：1以吸附蛋白質(zhì)能力很強的硝酸纖維素膜為固相載體；2底物經(jīng)酶反應后形成有色沉淀，使固相膜染色。在實驗室中斑點-ELISA可按下法進行。在硝酸纖維素膜上打成4*4mm的小格。在每格的中央，加抗原1-2ul，成為一個小點。干燥后將每格剪下分別放人ELISA板孔內(nèi)，按ELISA方法操作，最后加入能形成不溶性有色沉淀的底物，如在膜上出現(xiàn)染色斑點，即為陽性反應。（四）酶免疫電泳

17、 常規(guī)電泳結(jié)合酶免疫反應，可起到微量抗原定位作用。如在甲胎蛋白檢測中，將待測血清在醋酸纖維素膜上進行電泳，因甲胎蛋白含量少，位置鄰近白蛋白，用一般染色法難于判定。如將電泳后的醋酸纖維素膜與HRP標記的特異性抗甲胎蛋白抗體共同溫育，洗滌后加入底物，在甲胎蛋白處即出現(xiàn)顯色條帶。電泳結(jié)合酶免疫反應的另一種方法，為酶標記抗原對流免疫電泳，用于檢測血清中的抗體。方法為將可溶性抗原用酶標記，然后將此酶標抗原與受檢血清按常規(guī)方法進行對流免疫電泳，最后以底物進行顯色，抗原與抗體孔間呈明顯的著色沉淀線即為陽性反應，表示有特異性抗體存在。常規(guī)對流電泳法中不可見的沉淀帶，經(jīng)酶免疫著色后有時清晰可辨，從而提高陽性檢出

18、率。二、檢驗項目酶免疫測定具有高度的特異性和敏感性，幾乎所有的可溶性抗原-抗體系統(tǒng)均可用以檢測。它的最小可測值可達ng甚至pg水平。與放射免疫測定相比，酶免疫測定的優(yōu)點是標記試劑比較穩(wěn)定，且無放射性的危害。 酶免疫測定商品試劑檢測項目最多的為ELISA，可分以下各類： 1、病原體及其抗體的檢測病毒感染如肝炎病毒，巨細胞病毒，風疹病毒，皰疹病毒，輪狀病毒，艾滋病病毒（HIV）等。細菌感染如鏈球菌，布氏桿菌等。寄生蟲感染如阿米巴、弓形蟲、錐蟲等。 2、蛋白質(zhì)如各種免疫球蛋白，腫瘤標志物如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺堿性磷酸酶，激素如hCG, FSH, TSH, hGH, 酶如肌酸激酶-MB，其他蛋白

19、質(zhì)如鐵蛋白等。 3、非肽類激素如T3, T4，雌二醇，皮質(zhì)醇等。 4、藥物治療心臟病藥物如地高辛，抗哮喘藥物如茶堿，抗生素如慶大霉素等。第三講 免疫熒光標記技術(shù)一、免疫熒光技術(shù)基本原理 免疫熒光技術(shù)的原理是利用物質(zhì)吸收光能后，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)而發(fā)光的特性。將具有這種特性的熒光素（異硫氰熒光黃或羅丹明B200)用化學方法結(jié)合在特異的抗體或抗原上，又不損害其抗體或抗原活性的一種熒光顯微鏡下的示蹤技術(shù)?？贵w與抗原的結(jié)合是高度特異的，所以只要知道其中的一種因子，也就知道了另一種因子。 免疫熒光技術(shù)就是利用上述兩種特性，把不可見的抗原抗體的反應（一抗）與被熒光素標記的抗體（抗抗體）反應，變?yōu)槿庋劭梢姷臒晒?，?/p>

20、熒光顯微鏡下我們所能見到的亮綠熒光，不是標本本身發(fā)出的，而是熒光物質(zhì)受到激發(fā)后而發(fā)出的亮綠色熒光。二、免疫熒光技術(shù)特點1、特異的抗原抗體反應，并與形態(tài)學相結(jié)合，增加試驗的特異性和敏感性。2、利用了物理、化學、組織學、細胞學、生物學等綜合性技術(shù)，使免疫熒光技術(shù)成為一種獨立完整的一門方法學。3、一種熒光抗體可以檢查多種抗原抗體復合物。4、只要知道一種抗體或抗原，就可以知道其對應的抗原或抗體。 三、免疫熒光抗體技術(shù)基本類型1、直接法：只有抗原、抗體兩個因子直接參與反應，利用熒光標記的特異性抗體與相應的抗原結(jié)合，以此來鑒定未知抗原，此方法優(yōu)點是簡單快速，特異性高，非特異性反應少。缺點是一種熒光標記抗體

21、只能針對一種抗原，敏感性較差和不能檢查未知抗體。2、間接法：此法是利用熒光標記抗免疫球蛋白 抗體（抗抗體），鑒定未知抗原或抗體。第一步： 用已知抗體、抗原與未知抗原或抗體反應，這步反應是不可見的，反映的沉淀物被固定在組織、細胞上。第二步： 加上熒光標記抗免疫球蛋白的抗體，前抗原抗體沉淀物成為相對抗原和熒光標記抗球蛋白的反應，形成抗原抗體復合物，在根據(jù)組織或細胞的發(fā)熒光部位來判斷。此方法優(yōu)點是，只要一種標記抗體，能與所有免疫球蛋白對應的未知抗原或抗體反應，敏感性高，缺點是如果抗原或抗體純度不高，實驗可受非特異性熒光干擾。 3、補體法：利用熒光標記抗補體抗體，以鑒定未知抗原或抗體，是補體結(jié)合反應的

22、原理。第一步，已知抗體或抗原和未知抗體或抗原反應，第二步，加新鮮補體或新鮮正常人血清反應，第三步，加熒光標記抗補體抗體，則熒光標記抗補體抗體特異的和固定的補體結(jié)合。此方法的優(yōu)點是，只需要一種熒光標記抗補體抗體，就可以檢查所有種系的抗原抗體系統(tǒng)。因為補體可被任何哺乳類的抗體抗原系統(tǒng)所固定，并與間接法有同樣的優(yōu)點。缺點是補體不穩(wěn)定，熒光標記抗補體抗體不能與之固定的補體結(jié)合，使試驗失敗，其次是非特異性熒光強。四、免疫熒光技術(shù)的發(fā)展與臨床應用熒光抗體技術(shù)已廣泛應用于醫(yī)學和生物學的很多方面，在臨床免疫學中主要用于：1、在細菌診斷中的應用：主要用于鑒定細菌和對抗原結(jié)構(gòu)的研究。如對甲型鏈球菌的快速診斷和分型

23、鑒定，腦膜炎雙球菌的快速診斷等。2、在寄生蟲學診斷中的應用：對于瘧原蟲、阿米巴、利什曼、纖毛蟲、滴蟲、鉤蟲、絳蟲、蠕蟲等均有不少研究。特別是血吸蟲及瘧原蟲的診斷效果是肯定的?？捎靡阎募纳x抗原，檢查血清中的抗體，用于寄生蟲病的診斷和流行病學調(diào)查。也可用于寄生蟲感染的免疫學和發(fā)病機理等方面的研究。3、在病毒學診斷中的應用：免疫熒光技術(shù)在病毒領(lǐng)域應用最廣泛，并且取得很大成就，主要用于病毒抗原在器官細胞內(nèi)的定位工作，如HBsAg研究就是一例。也用于病毒感染過程的研究，腫瘤病毒的研究和快速診斷的研究。在快速診斷中對流感病毒的快速檢出，對乙腦、狂犬病、脊髓灰白質(zhì)炎、恙蟲病等都取得良好的效果；也可用來檢

24、查血清中的抗病毒抗體。4、在免疫病理方面的應用：利用示蹤法檢查球蛋白的沉積工作已逐漸開展起來，如天庖瘡在真皮層基底膜，結(jié)節(jié)性紅斑的沉著在真皮下的纖維層。特別是對于復合物病如：腎小球腎火、類風濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等利用補體熒光法測定復合物沉著的位置，以了解病變侵犯部位和病變基礎(chǔ)。5、血液中B及T細胞的鑒定。6、激素和酶的局部組織定位。7、一些器官移植抗原鑒定。8、組織中免疫球蛋及補體組分的檢測。9、在診斷自身免疫病方面的應用：(1)抗核抗體（ANA)：是自身免疫性疾病最常出現(xiàn)的一種抗體，特別是系統(tǒng)性紅斑狼瘡，陽性率更高，因此常作為輔助診斷之一，其它如類風濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、慢性肝炎等血中亦可出現(xiàn)

25、較高效價的抗體。目前，已將此試驗作為許多自身免疫病診斷的重要參考。（2）抗線粒體抗體：在慢性活動性肝炎患者中，如抗體效價在1：256以上可以認為是自身免疫性肝炎。原發(fā)性膽汁性肝硬化約有98出現(xiàn)線粒體抗體，慢性活動性肝炎在31左右。線粒體抗體在膠原性疾病中可見（2-8）且效價遠較自身免疫性肝炎低。（3）抗平滑肌抗體：這是對平滑肌組織的特異性抗體，沒有器官和種屬特異性。其臨床意義對于自身免疫性肝炎約82，急性肝炎早期也可出現(xiàn)抗平滑肌抗體，有人報告早于HBsAg出現(xiàn)。（4）甲狀腺球蛋白的抗體：甲狀腺球蛋白是甲狀腺腺泡內(nèi)主要激素貯存形式，形成膠質(zhì)蛋白。患甲狀腺炎時，有大量甲狀腺球蛋白從受損的腺泡中外滲

26、，而形成自身抗原，從而刺激機體產(chǎn)生自身抗體。（5）抗胃壁細胞抗體：具有器官特異性，主要見于惡性貧血和低色素性貧血病人。（6）其他自身抗體：如抗腎小球基底膜抗體，診斷腎小球腎炎?？箼M紋肌抗體可用于診斷重癥肌無力，抗腎上腺抗體診斷阿狄森氏病。第四講 流式細胞術(shù)一、流式細胞術(shù)簡介 流式細胞術(shù)（Flow Cytometry FCM）是一種對單細胞或其他生物粒子膜表面以及內(nèi)部的化學成分進行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)，同傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快，精度高準確性好等特點，成為當代最先進的細胞定量分析技術(shù)。自20世紀70年代以來，隨著流式細胞技術(shù)

27、水平的不斷提高，其應用范圍也日益廣泛。目前，流式細胞已普遍應用于免疫學、血液學、細胞生物學、細胞遺傳學、生物化學及腫瘤學等臨床醫(yī)學和基礎(chǔ)醫(yī)學領(lǐng)域。 流式細胞儀集電子技術(shù)，計算機技術(shù)、流體理論于一體，是一種非常先進的檢測儀器。流式細胞儀的發(fā)展始于1953年，Parker和Horst設(shè)計一種全血細胞計數(shù)器裝置，該儀器成為流式細胞儀的雛形。其原理是先將全血細胞進行染色，白細胞染為藍色，紅細胞仍為紅色，當細胞懸液通過檢測細玻璃管時用一束光進行照射，不同細胞所發(fā)出的藍光或紅光經(jīng)過濾光片后分別由兩個光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電信號，再由計數(shù)電路分別計數(shù)。二、流式細胞儀的組成及工作原理（一）流式細胞儀由五部分組成：1

28、、流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)。2、激光光源及光束成形系統(tǒng)。3、光學系統(tǒng)。4、信號檢測與存貯、顯示、分析系統(tǒng)。5、細胞分選系統(tǒng)。（二）FCM基本原理 將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的磷酸緩中液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。流式細胞儀通常以激光作為激發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90度方向的光電倍增管（PMT）接收，光散射信號

29、在前向角度10.5-2.0度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積大??；熒光信號的接收方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號，再通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號。 計算機采集所測量得到的各種信號進行計算處理，將分析結(jié)果顯示在計算機屏幕上，也可以打印出來，還可以數(shù)據(jù)文件的形式存貯在硬盤上以備日后的查詢或進一步分析。細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。在流動室的噴口上配有一個超高頻的壓電晶體，充電后振動，使噴出的

30、液流斷裂為均勻的液滴，待測細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴以正負不同的電荷，當液滴流經(jīng)帶有幾千伏的偏轉(zhuǎn)板時，在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現(xiàn)細胞的分離。 三、流式細胞儀的臨床應用（一）FCM在免疫學中的應用1、外周血T淋巴細胞亞群的測定正常機體中各淋巴細胞亞群相互作用，維持著機體的正常免疫功能。當不同淋巴細胞亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時，可導致免疫紊亂并發(fā)生一系列的病理變化。 越來越多的研究表明，T淋巴細胞亞群在某些臨床疾病如自身免疫性疾病、免疾缺陷性疾病、變態(tài)反應性疾病、病毒感染、惡性腫瘤等均有異常改變。因此，T淋巴細胞亞群的檢測對控

31、制這些疾病的發(fā)生發(fā)展，了解疾病的機制、指導臨床治療都有極其重要的意義。2、FCM在艾滋病監(jiān)測中的應用艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS），是由于人類免疫缺陷病毒（HIV）侵犯T輔助淋巴細胞（TH）所致。發(fā)病后由于病毒在CD4+細胞內(nèi)繁殖，導致溶解性破壞，致使CD4+細胞數(shù)量顯著下降，繼而累及各免疫功能器官，造成全身免疫功能下降，最終因各種繼發(fā)性感染和腫瘤而發(fā)病死亡。由此可見，CD4+T細胞絕對計數(shù)及其在淋巴細胞中的比例對AIDS的檢測起著至關(guān)重要的作用。3、細胞內(nèi)染色和細胞因子的測定人體內(nèi)的免疫細胞和某些非免疫細胞具有合成和分泌小分子多肽功能，這些小分子參與調(diào)節(jié)多種生理功能和細胞功能，統(tǒng)

32、稱為細胞因子（cytokine)。對細胞因子的研究，有助于在分子水平闡明免疫調(diào)節(jié)機制，有助于疾病的預防、診斷和治療，特別是利用相應的細胞因子，在治療腫瘤、感染、造血功能障礙、自身免疫疾病等方面已取得令人滿意的效果，前景樂觀。因此，細胞因子的檢測和研究正成為一個熱門題目。（二）流式細胞術(shù)在血液病學中的應用1、白血病免疫分型白血病免疫分型是利用單克隆性抗體檢測白血病細胞表面和胞漿內(nèi)抗原，分析其表現(xiàn)型，以了解被測白血病細胞所屬系列及其分化系列，它是研究白血病分化抗原和診斷白血病的重要手段。 從多能造血干細胞（PHSC）分化成熟為功能細胞的過程中，細胞表面和細胞漿內(nèi)抗原隨著分化成熟過程不斷發(fā)生改變，這

33、些抗原稱為造血細胞分化抗原。如，髓系細胞的CD33 、CD13 、CD14、CD15等抗原，巨核系的CD41、 CD42、 CD61等抗原，T淋巴細胞的CD2、CD3、CD4、CD5 、CD7、 CD8等抗原，B淋巴細胞的CD19、CD20、CD22等抗原。2、淋巴瘤的免疫分型通常淋巴瘤細胞表達B細胞（smIg, CD19, CD20, CD5）,T細胞（CD2,CD3,CD5,CD7,CD8,）或T/B細胞表型這些復雜的表型與細胞形態(tài)亞型關(guān)系不大，也沒有發(fā)現(xiàn)一致性的預后意義。它主要用于鑒別診斷，如濾泡性淋巴瘤，主要表達B細胞標志，但不表達CD5，可以區(qū)分濾泡性淋巴瘤白血病和慢性淋巴細胞型白血

34、病。3、白血病微小殘留病變和化療效果的監(jiān)測 微小殘留病變（MRD）是白血病復發(fā)的根源。對MRD的早期監(jiān)測，可避免復發(fā)，延長緩解期。常規(guī)檢測方法（如形態(tài)學檢查、組化和血清學檢查）難以發(fā)現(xiàn)MRD，只能采用免疫表型、細胞遺傳學（FISH熒光原位雜交）和PCR等方法進行檢測。由于單純的分子生物學方法檢測MRD具有一定的局限性，而FCM可以同時定量測定多個參數(shù)，結(jié)合分選功能，可以分出感興趣的細胞，進而研究其它分子生物學特性。所以FCM與分子生物學技術(shù)相結(jié)合可進一步提高檢測水平。4、骨髓移植和干細胞移植的監(jiān)測(1)移植前監(jiān)測骨髓和外周血造血干細胞為保證移植重建的成功，每千克體重至少需要1.2×1

35、06個CD34+細胞，早期造血重建依賴祖細胞，持久的植活依賴干細胞，因此移植中必須有足夠數(shù)量不同分化階段的造血干祖細胞。CD34+細胞是造血干祖細胞的特異性標志，聯(lián)合應用其他分化抗原如CD38, CD33, CDw90, HLA - DR等，用免疫雙標記或多重標記法通過FCM可以測定出CD34+細胞總數(shù)及各分化階段干祖細胞數(shù)。(2)移植后監(jiān)測免疫功能移植后細胞免疫表型的變化有助于推測骨髓重建是否正常進行，骨髓恢復正常則表現(xiàn)為：自然殺傷細胞（NK）增多，并出現(xiàn)少見細胞表型細胞，如NK細胞表達少量CD8、CD5陽性的B細胞，CD4, CD8陰性的T細胞。5、流式細胞術(shù)在免疫血液病中的應用（1）陣發(fā)

36、性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)的臨床論斷 PNH是一種以補體介導的血管內(nèi)溶血為特征的造血干細胞克隆性疾病。目前研究證明，PNH患者的血細胞膜上缺乏多種糖化肌醇磷脂結(jié)合蛋白（GPI錨蛋白），如C3轉(zhuǎn)換酶衰變加速因子（CD55）、反應性溶血膜的抑制物（CD59）等，致使血細胞對補體異常敏感，出現(xiàn)血管內(nèi)溶血為特征的一系列癥狀。國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院實驗室診斷PNH仍限于溶血實驗，此法并非特異性診斷實驗，而通過流式細胞儀及免疫熒光技術(shù)檢測外周血紅細胞膜、白細胞膜及網(wǎng)織紅細胞膜上CD55和CD59的表達，將是診斷PNH的重要手段。（2）免疫性血小板疾病和中性粒細胞減少癥的臨床診斷 原發(fā)性血小板減少性紫癜和中粒細

37、胞減少癥患者血液中存在著抗血小板抗體和抗白細胞抗體，流式細胞儀可以用于這些抗體的分析。6、血小板膜表面受體測定在血栓性疾病方面的應用目前認為，與血小板功能有關(guān)的血小板膜受體有b、a、IIb/a復合物、b、vWF、 GMP140 、Fg等。其檢測方法不盡相同，有SDS-PAGE法、交叉免疫電泳法等等，這些方法難于檢出含量較低的膜受體。免疫印記法的靈敏度較高，但標本用量大，操作復雜，膜純化過程中受體變化大、易丟失，因此臨床實驗室較少應用。放免法則易受其他細胞的干擾或因一個抗原分子結(jié)合多個抗體而測定結(jié)果不準確。以FCM測定血小板膜受體，是分析血小板功能方法學上的一大進步，該方法測定準確、快速、特異，

38、操作方便，重復性好，標本用量少，非常適合于臨床常規(guī)檢測。7、在貧血中的應用 網(wǎng)織紅細胞分析是臨床上監(jiān)測貧血的一個重要指標。人工鏡檢仍普遍用于網(wǎng)織紅細胞計數(shù)。但許多研究證明，鏡檢法計數(shù)精確性差，受人為因素干擾大，而且用肉眼無法準確判斷網(wǎng)織紅細胞的成熟程度（RNA含量），隨著流式細胞儀及一系列自動化網(wǎng)織細胞分析的出現(xiàn)，不但能快速、準確地計數(shù)網(wǎng)織紅細胞（RET）(1分鐘內(nèi)測定10000個細胞以上)，而且可提供新的評價紅細胞生成活性的參數(shù)-網(wǎng)織紅細胞成熟指數(shù)（RMI）。（三）流式細胞儀在細胞增殖和腫瘤病理研究中的應用1、細胞周期和DNA倍體分析 FCM進行DNA分析的原理在生物細胞中，DNA含量是比較

39、恒定的參量，DNA含量隨著細胞增殖周期各時相發(fā)生變化。Go /G1期細胞的DNA含量為二倍體DNA含量，是較恒定的2C值；S期細胞的DNA含量較二倍體高但低于四倍體，即從2C值4C值；G2/M期細胞的DNA含量為四倍體含量，是較恒定的4C值。2、碘化丙啶(PI)的熒光標記法 對于標記DNA的熒光探針目前最常用的是PI，PI是屬于插入性熒光染料，可選擇性地定量嵌入核酸雙螺旋的堿基之間，其熒光發(fā)射為橙紅色，如果使用氬離子激光488nm激發(fā)，PI發(fā)射光譜波長在610-620nm范圍，PI的優(yōu)點是熒光發(fā)射強度大，其CV值較小，PI的最佳濃度為50g/ml, PI不能通過活細胞膜進入細胞內(nèi)與核酸結(jié)合，因

40、此可以用于鑒別死活細胞。在染色活細胞時，要采用膜打孔方法，把染料引入細胞內(nèi)，或?qū)⒓毎潭?。另外，PI可與雙鏈RNA結(jié)合，故在染色細胞DNA時首先要用RNA酶處理細胞，以排除RNA對定量DNA含量精度的干擾。（四）FCM在細胞凋亡研究中的應用1、DNA含量分析由于凋亡細胞DNA被降解后，小分子DNA可通過細胞膜逃逸于細胞外，另外凋亡小體也可帶走部分DNA，造成了凋亡細胞的DNA含量非倍體性下降，由此可導致對DNA染料的著色能力下了，表現(xiàn)在G1期峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，稱為亞G1期峰（凋亡峰）。2、細胞膜結(jié)構(gòu)的改變在凋亡細胞的形態(tài)學改變中，胞漿膜的改變是最早出現(xiàn)的。凋亡的早期階段可檢測到快速、持續(xù)的細

41、胞內(nèi)鈣離子升高，大量的鈣離子激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的活化使胞漿膜磷脂的對稱性喪失，導致膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲胺酸（PS）從細胞膜內(nèi)層暴露于外層，從而可被PS特異的Annexin-V探針所標記。Annexin-V為35-36KD的鈣離子依賴性磷脂復合蛋白，對PS有極強的附著力，并可被FITC、PE、Biotin等熒光物質(zhì)標記。此方法簡單、可靠，由于凋亡時細胞膜的改變大大早于DNA的改變，因此Annexin-V染色是檢測早期凋亡細胞的敏感方法。但是該方法無法區(qū)分凋亡晚期細胞和壞死細胞，因此必須用活細胞。3、DNA斷裂點標記DNA裂解是細胞凋亡的最后一步，由于核酸內(nèi)切酶活化，使得核小體內(nèi)DNA斷

42、裂為50-300kb的片斷，繼而裂解為200bp的DNA碎片。由于碎片的產(chǎn)生暴露出多個3-OH末端，利用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)，能夠催化外源性的dUTP或Brd- UTP連接到DNA碎片的3-OH末端。以熒光物質(zhì)標記dUTP或抗BrdUTP單抗，就可以用FCM檢測到UTPB或rd-UTP的數(shù)量，從而間接檢測到凋亡過程中DNA碎片上所帶的3-OH末端。此方法靈敏度高、特異性好，目前已被廣泛采用。檢測3'-OH末端的同時還可以與PI雙染色，進一步檢測到細胞DNA含量。（五）其他應用1、染色體流式核型分析用流式細胞儀分析和分選人類染色體是分子生物學和遺傳學研究中一個非常有效的方法

43、，通過此法，研究者可進行核型分析和鑒定，分離純化某號染色體并構(gòu)建染色體特異性DNA文庫，這在遺傳病基因定位、基因克隆方面發(fā)揮著重要的作用。傳統(tǒng)的核型分析采用分帶技術(shù)顯示出不同染色體的特征信息，然后再顯微照相、放大、剪接、組型，這種方法不但費時而且無法排除人為主觀因素的干擾。目前儀器自動分型的方法有兩種：一是采用圖像技術(shù)的靜態(tài)方法；二是采用流式細胞術(shù)。后者不但能分析染色體，還能純化得到克隆實驗所要求的染色體，這是其他任何技術(shù)都無法完成的。2、流式染色體分析的臨床意義：目前，染色體分析已廣泛應用于產(chǎn)前診斷、遺傳性疾病、放射性損傷、腫瘤細胞染色體分析等多方面的研究。但傳統(tǒng)的染色體顯帶技術(shù)分辨率低，人

44、為因素干擾大，而流式核型分析分辯率高，可以分辨顯微鏡下觀察不到的變異，且每分鐘分析的染色體數(shù)目遠遠大于人工顯微鏡計數(shù)。3、細胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）的測定Ca2+ 作為細胞信使，參與許多的生命過程，測量活細胞內(nèi)Ca2+ ，在細胞生物學中有廣泛的意義。作為Ca2+ 的熒光探針，F(xiàn)luo-3有著自身的特性，信噪比大，激發(fā)波長（506nm）適于流式細胞儀的氬離子激光器在488nm激發(fā)，所以越來越多地用于Ca2+ 的檢測。第五講 膠體金技術(shù)膠體金技術(shù)是七十年代推出的一門檢測技術(shù)，廣泛應用于生物學和醫(yī)學等領(lǐng)域，目前已成為一種最常用的快速的檢測技術(shù)。 一、基本原理及類型 該技術(shù)以微孔膜作為固相，固相膜有很多孔，像濾紙一樣，常用的固相膜為硝酸纖維素膜，液體可以穿過流出，也可以通過毛細管作用在膜上向前移動。利用這兩種性能建立了兩種不同類型的快速檢測方法，前者叫免疫滲濾試驗，后者叫免疫層析試驗，兩者統(tǒng)稱為“金標”。膠體金也稱金溶膠，是由金鹽被還原成原子金后形成的金顆粒懸液。膠體金具有膠體性質(zhì)、呈色性及光吸收性。因此肉眼觀