天然和人工培育冬蟲(chóng)夏草的比較蛋白質(zhì)學(xué)表征及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)估

1、天然和人工培育冬蟲(chóng)夏草的比較蛋白質(zhì)學(xué)表征及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)估題 目 ： A comparativeproteomiccharacterizationand nutritionalassessmentofnaturally-and artificially-cultivated Cordyceps sinensis期刊： Journal of Proteomics影響因子： 3.722合作技術(shù)： Label-free研究背景冬蟲(chóng)夏草因其營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值而受到越來(lái)越多的關(guān)注。近期，有報(bào)道稱， 成功通過(guò)人工方式培育出冬蟲(chóng)夏草。本文主要使用非標(biāo)定量Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究自然生長(zhǎng)和人工培育的冬

2、蟲(chóng)夏草之間的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，揭示冬蟲(chóng)夏草蛋白質(zhì)組學(xué)特征，了解其發(fā)育感染過(guò)程，并為人工培育提供參考信息。研究思路1.實(shí)驗(yàn)材料：天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草，各分為蟲(chóng)體和子座，每個(gè)樣本 3 個(gè)重復(fù)，共計(jì) 12 個(gè)樣本。2. 實(shí)驗(yàn)方法： Label-free ， LC-MS3. 研究策略：蛋白組、代謝組研究?jī)?nèi)容和結(jié)果1. 蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果及蛋白質(zhì)控人工培育的蟲(chóng)草和青藏高原上自然生長(zhǎng)的蟲(chóng)草在形態(tài)特征高度相似（圖1），并各自選擇 3 個(gè)批次的樣本進(jìn)行蛋白提取。將蟲(chóng)草分為蟲(chóng)體和子座，分別用SDS-PAGE對(duì)樣本蛋白進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)（圖2）。對(duì)解析的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析，肽段質(zhì)量容差為0.1Da ，說(shuō)明質(zhì)譜鑒定

3、肽段準(zhǔn)確度高，肽段長(zhǎng)度范圍為8-38 個(gè)氨基酸，分子量范圍為400-12000Da ，與預(yù)設(shè)分子量范圍一致。在本次實(shí)驗(yàn)中，大多數(shù)鑒定蛋白含有2-20 個(gè) unique 肽段。圖 1 天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草形態(tài)比對(duì)圖 2 樣品蛋白 SDS-PAGE質(zhì)控結(jié)果使用變異系數(shù) （ CV）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性， 在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中， 人工培育的蟲(chóng)體 （AC）、子座（ AS）、天然生長(zhǎng)的蟲(chóng)體 （NC）、子座（NS）的 CV值中位數(shù)分別為 31.88%，27.44%，34.49%，34.94%。 12 個(gè)樣品的相關(guān)性系數(shù)在 0.68-0.93 之間，這些結(jié)果證明了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。在所有的鑒定蛋白中，基于強(qiáng)度的絕

4、對(duì)定量（iBAQ）值分布在1200 中最豐富的蛋白質(zhì)中（圖3A）。所有樣品和組內(nèi)蛋白質(zhì)的平均iBAQ 值相似（圖3B）。這些結(jié)果表明蛋白質(zhì)組內(nèi)比較可能不受蛋白質(zhì)豐度系統(tǒng)差異的影響。圖 3 鑒定蛋白的絕對(duì)定量值（ iBAQ）分布2. 天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草的蛋白表達(dá)圖譜在本次實(shí)驗(yàn)中， 12 個(gè)樣品共鑒定到22829 條可信肽段 （ conf 95%），2541 個(gè)蛋白質(zhì)。使用 PCA分析天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草蛋白表達(dá)圖譜特征， 發(fā)現(xiàn)雖然蟲(chóng)體和子座蛋白質(zhì)分布有明顯區(qū)別， 但是天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草的整體蛋白質(zhì)分布類似 （圖 4）。COG功能注釋到了 1951 個(gè)蛋白質(zhì)。 這些蛋白質(zhì)主要參與能量產(chǎn)生

5、、 轉(zhuǎn)化，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、 代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) （圖5）。圖 4 PCA 分析結(jié)果圖 5 COG功能注釋結(jié)果3.顯著差異蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果本次實(shí)驗(yàn)中，顯著差異蛋白數(shù)目分別為107（NC/AC）、58（ NS/AS）， 195（ AC/AS）、168（NC/NS）。使用層次聚類分析蛋白質(zhì)表達(dá)變化趨勢(shì)，主要聚成三類，Cluster I由在 AS 中增加并在NC中減少的蛋白質(zhì)組成；Cluster II包括在 AC 中降低并在NS中增加的蛋白質(zhì)；ClusterIII包括在 AC或 NC中增加并在AS和 NS中均降低的蛋白質(zhì)（圖6）。為了確定這些蛋白質(zhì)的功能特性，將它們的序列映射到GO數(shù)據(jù)庫(kù)。 GO富集表明這些差異

6、豐富的蛋白質(zhì)主要參與生物調(diào)節(jié)、單一生物過(guò)程，結(jié)合、催化活性，并定位于細(xì)胞器、細(xì)胞膜。結(jié)果說(shuō)明這些顯著差異蛋白在蟲(chóng)草生命活動(dòng)中主要發(fā)揮催化和結(jié)合作用（圖7）。圖 6 層次聚類分析結(jié)果圖 7 差異蛋白GO富集結(jié)果4.顯著差異蛋白Pathway Enrichment結(jié)果為了進(jìn)一步研探索發(fā)生變化的生物學(xué)途徑，使用KEGG Pathway 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析，結(jié)果表明，天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草之間的差異蛋白主要參與次生代謝物合成、丙酮酸代謝、賴氨酸生物合成。在氨基酸合成、代謝途徑中（圖8），有 7 種相關(guān)蛋白發(fā)生表達(dá)量變化，其中，核糖5- 磷酸異構(gòu)酶（K01807）和丙酮酸激酶（K00873）在 NC中降

7、低，而NADH（P）結(jié)合蛋白 （ K00831）在 NC中增加； NS 中糖基轉(zhuǎn)移酶 （ K00766）和雄性不育蛋白（K00143）增加；異檸檬酸/ 異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶（K00052）在 NC中降低但在NS中升高，精氨酸琥珀酸合成酶（ K01940）在 NC和 NS中均下降。圖 8 氨基酸合成/ 代謝途徑為了驗(yàn)證組學(xué)結(jié)果，LC-MS分析蟲(chóng)草代謝產(chǎn)物。根據(jù)代謝組學(xué)結(jié)果，共鑒定出8 種氨基酸，其中 4 種氨基酸含量發(fā)生顯著改變，具體為賴氨酸，精氨酸，蘇氨酸和絲氨酸（圖9）。氨基酸的變化趨勢(shì)跟上游合成它們的酶的變化趨勢(shì)是一直的。根據(jù)中國(guó)藥典中關(guān)于測(cè)定核苷和核苷酸含量， 特別是腺苷的規(guī)定， NC/N

8、S以及 AC/AS總離子色譜圖中沒(méi)有觀察到顯著差異（圖10）。圖 9 代謝組鑒定結(jié)果圖 10 核苷酸含量測(cè)定蟲(chóng)草蛋白質(zhì)中必須氨基酸比例與人類蛋白質(zhì)中的比例相似， 說(shuō)明它具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。 而且，天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草蛋白質(zhì)中氨基酸成分和含量幾乎相同，沒(méi)有顯著差異。文章小結(jié)該研究提供了天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草的蛋白表達(dá)圖譜， 發(fā)現(xiàn)天然蟲(chóng)草和人工培育蟲(chóng)草的真菌中的蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物組成相似，而蟲(chóng)體和子座的蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物方面則有區(qū)別。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明氨基酸合成和代謝途徑受到栽培方式的影響。 這些蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)將有助于理解冬蟲(chóng)夏草的藥用價(jià)值，并為其人工培育提供參考。解析文獻(xiàn)Xu Zhang, Qun Li

9、u, Wei Zhou,et al. A comparative proteomic characterization andnutritionalassessment of naturally-andartificially-cultivatedCordyceps sinensis.Journal of Proteomics, 2018, 181:24-35.參考文獻(xiàn)1. Shrestha UB, Bawa KS. Trade, harvest, and conservation of caterpillar fungus (Ophiocordyceps sinensis) in the H

10、imalayas. Biol Conserv 2013;159:514.2. Zhao J, Xie J, Wang LY, Li SP. Advanced development in chemical analysis ofCordyceps. J Pharm Biomed Anal 2014;87:271 89.3. Hu HK, Xiao L, et al. Identification of chemical markers in Cordyceps sinensisby HPLC-MS/MS. Anal and Bioanal Chem 2015;407:8059 8066.4.

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12、on offungal pathogenicity. Sci Rep 2017;7:1806.出師表兩漢：諸葛亮先帝創(chuàng)業(yè)未半而中道崩殂， 今天下三分， 益州疲弊， 此誠(chéng)危急存亡之秋也。然侍衛(wèi)之臣不懈于內(nèi)，忠志之士忘身于外者，蓋追先帝之殊遇，欲報(bào)之于陛下也。誠(chéng)宜開(kāi)張圣聽(tīng)，以光先帝遺德，恢弘志士之氣，不宜妄自菲薄，引喻失義，以塞忠諫之路也。宮中府中，俱為一體；陟罰臧否，不宜異同。若有作奸犯科及為忠善者，宜付有司論其刑賞，以昭陛下平明之理；不宜偏私，使內(nèi)外異法也。侍中、侍郎郭攸之、費(fèi)祎、董允等，此皆良實(shí)，志慮忠純，是以先帝簡(jiǎn)拔以遺陛下：愚以為宮中之事，事無(wú)大小，悉以咨之，然后施行，必能裨補(bǔ)闕漏，有所

13、廣益。將軍向?qū)櫍孕惺缇?，曉暢軍事，試用于昔日，先帝稱之曰愚以為營(yíng)中之事，悉以咨之，必能使行陣和睦，優(yōu)劣得所?！澳?”，是以眾議舉寵為督：親賢臣，遠(yuǎn)小人，此先漢所以興隆也； 親小人， 遠(yuǎn)賢臣，此后漢所以傾頹也。 先帝在時(shí)，每與臣論此事， 未嘗不嘆息痛恨于桓、 靈也。侍中、尚書(shū)、長(zhǎng)史、參軍，此悉貞良死節(jié)之臣，愿陛下親之、信之，則漢室之隆，可計(jì)日而待也。臣本布衣，躬耕于南陽(yáng)，茍全性命于亂世，不求聞達(dá)于諸侯。先帝不以臣卑鄙，猥自枉屈，三顧臣于草廬之中，咨臣以當(dāng)世之事，由是感激，遂許先帝以驅(qū)馳。后值傾覆，受任于敗軍之際，奉命于危難之間，爾來(lái)二十有一年矣。先帝知臣謹(jǐn)慎，故臨崩寄臣以大事也。受命以來(lái)，夙夜憂嘆，恐