抗生素微生物檢定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(doc22頁)

1、抗生素微生物檢定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1 簡述抗生素微生物檢定法系在適宜條件下，通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，計算抗生素活性（效價） 的方法。 依試驗設(shè)計原理不同，可分為稀釋法、比濁法和瓊脂擴(kuò)散法。后二者被列為抗生素微生物檢定的國際通用方法。中國藥典也采用這兩種方法?？股匚⑸餀z定管碟測定法系瓊脂擴(kuò)散法，是利用抗生素在攤布特定試驗菌的固體培養(yǎng)基內(nèi)成球面形擴(kuò)散，形成含一定濃度抗生素球形區(qū)， 抑制了試驗菌的繁殖而呈現(xiàn)出透明的抑菌圈。此法系根據(jù)抗生素在一定濃度范圍內(nèi)，對數(shù)劑量與抑菌圈直徑（面積）呈直線關(guān)系而設(shè)計， 通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計算出供試品的效價。

2、抗生素微生物比濁法是將一定量的抗生素加至接種有試驗菌的液體培養(yǎng)基內(nèi)，混均后，經(jīng)培養(yǎng)，測量培養(yǎng)基濁度。此法系根據(jù)抗生素在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度或濃度的數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換值與試驗菌生長產(chǎn)生的濁度 （濁度與細(xì)菌群體質(zhì)量及細(xì)菌細(xì)胞容積的增加之間存在直接關(guān)系） 之間存在線性關(guān)系而設(shè)計，通過測定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對試驗菌生長抑制的程度，計算出供試品的效價。抗生素效價以"單位（u）”或“微克（林gj表示?？股毓艿鷾y定法2 儀器與用具2.1 操作室 光線明亮，操作室應(yīng)分為兩部分，彼此分開，其中一部分為一般操作室，一部分為半無菌操作室。半無菌操作室應(yīng)設(shè)有紫外線滅菌燈，并附設(shè)空氣凈化（

3、空氣凈化級別為100級10, 000級） 及空調(diào)設(shè)備，控制室溫在 2025c之間，達(dá)到無菌或半無菌狀態(tài)。操作臺應(yīng)穩(wěn)固，臺面用玻璃板，并用水平儀調(diào)節(jié)至水平。注意操作， 避免室內(nèi)抗生素污染。2.2 雙碟 內(nèi)徑約90mm高1617mmM質(zhì)玻璃或塑料培養(yǎng)平皿，碟 底厚薄均勻，水平透明，無色斑氣泡。碟底平度檢查，可將雙碟放在水平臺上，下墊一張白紙，碟內(nèi)加水23ml,再滴加藍(lán)墨水，觀察藍(lán)色深淺是否一致。用過的雙碟經(jīng)高壓滅菌倒出培養(yǎng)基后，置清洗液中浸泡過夜，沖洗，瀝干，至150c160c干熱滅菌2小時或高壓121c蒸氣滅菌 30 分鐘，備用。2.3 陶瓦蓋 內(nèi)徑約103mm外徑108mm平坦，吸水性強(qiáng)，應(yīng)定

4、期 清洗、干燥或干熱滅菌。2.4 鋼管 內(nèi)徑 ( 6.0± 0.1 ) mm， 高 ( 10.0 ± 0.1 ) mm； 外徑 ( 8.0 ± 0.1 ) mnmic (7.8 ±0.1 ) mm每套鋼管重量差異不超過士 0.05g ,內(nèi)外壁及兩端面光潔平坦，管壁厚薄一致。每次使用后應(yīng)置1:1000 新潔爾溶液內(nèi)，浸泡2 小時以上，滅菌后再洗滌，先用水洗滌，超聲波超聲30 分鐘或用沾有去污粉的紗布條串擦內(nèi)外壁，水沖洗，瀝干，再用蒸儲水沖洗3次后，置帶蓋的容器內(nèi)，在150c160c干熱滅菌2 小時，備用。2.5 鋼管放置器有 6 孔和 4孔兩種。 放置于無

5、菌或半無菌室的操作平臺上，鋼管下落時應(yīng)垂直平穩(wěn)、位置正確。雙碟升降平穩(wěn)。應(yīng)保持清潔，防止抗生素污染?？啥ㄆ谟?5%乙醇棉擦拭落管筒及儲管杯。置鋼管的玻璃管應(yīng)定期干烤滅菌。2.6 恒溫培養(yǎng)箱以隔水式為宜，溫度平穩(wěn)，波動小。設(shè)置漂移溫度為3537c或2426C,依各品種要求而定，箱內(nèi)網(wǎng)狀隔板上放置 帶孔的玻璃板并調(diào)整水平。2.7 滅菌刻度吸管用于吸取菌液及培養(yǎng)基。使用后應(yīng)立即置5%石 炭酸或 1:1000 新潔爾溶液中消毒后，再按玻璃容器的常規(guī)洗滌法洗滌。洗滌瀝干后在吸口處塞入脫脂棉（松動，透氣），置適宜容器中，在 120以上干熱滅菌2小時或121蒸氣滅菌30分鐘，烘干備用。2.8 玻璃容器包括定

6、量移液管、刻度吸管、容量瓶等，均應(yīng)符合 “常用玻璃量器國家計量檢定規(guī)程”的規(guī)定。每次使用前用清潔液浸泡，水沖洗，并用蒸餾水或去離子說沖洗3 次，瀝干。2.9 稱量瓶 重量在10g以下。用畢先用水沖洗、瀝干，置清潔液浸泡 2 小時以上，然后分別用水、蒸餾水或去離子說沖洗3 次，置潔凈平皿中，在120c干熱滅菌3小時，待冷至6070c時，取出置于干燥中備用。2.10 滴管 用玻璃管拉制，管口光滑。使用前在清潔液浸泡，分別用水、蒸餾水后去離子水沖洗3 次，置適宜容器中，在120干燥3小時后備用。2.11 天平 分析天平，精密度0.1mg,經(jīng)計量檢定。2.12 抑菌圈直徑（面積）測量儀應(yīng)符合“抑菌圈測

7、量儀檢定規(guī)程”的規(guī)定。2.13 游標(biāo)卡尺 精度0.05mm 長度125mm2.14 超凈工作臺有效工作面局部潔凈度 100級。 用于試驗菌的接種傳代或菌懸液制備。超凈工作臺須置潔凈工作室或半無菌室內(nèi)。3 試液3.1 滅菌緩沖液制備緩沖液的試劑應(yīng)為分析純，配制后的緩沖液應(yīng)澄明，分裝于玻璃容器內(nèi)，經(jīng)121蒸氣滅菌30分鐘備用。3.1.1 磷酸鹽緩沖液（pH6.0） 取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g, 加水使成1000ml,濾過。3.1.2 磷酸鹽緩沖液（pH7.0）取磷酸氫二鈉（NaHPO 12HO） 9.39g 與磷酸二氫鉀3.5g,加水使成1000ml,濾過。3.1.3 磷酸鹽緩沖液（pH7.

8、8）取磷酸氫二鉀5.59g 與磷酸二氫鉀0.41g,加水使成1000ml,濾過。3.1.4 磷酸鹽緩沖液（pH10.5）取磷酸氫二鉀35g,加氫氧化鉀液， 加水使成1000ml,濾過。4 培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基的各成分原料質(zhì)量對抑菌圈邊緣清晰度及試驗結(jié)果影響較大，因此應(yīng)對原材料進(jìn)行預(yù)試驗，挑選適當(dāng)?shù)钠放剖褂?。制成的培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀，如產(chǎn)生沉淀，可在配制培養(yǎng)基后，于115加熱20 分鐘溶化，趁熱用紙漿減壓或適宜方法過濾，調(diào)整pH值，分裝滅菌備用。中國藥典2005年版二部附錄的抗生素生物檢定法中收載了13種不同處方的培養(yǎng)基及制備方法。目前，已有市售干燥培養(yǎng)基，使用方便。臨用時按照使用說明進(jìn)行配制，但應(yīng)注

9、意核對培養(yǎng)基的pH,必要時需調(diào)節(jié)pH,使其符合規(guī)定。另外，市售干燥培養(yǎng)基的質(zhì)量也存 在差異，注意選擇合適的產(chǎn)品。5 試驗菌5.1 菌種的復(fù)蘇檢定用標(biāo)準(zhǔn)菌種為冷凍干燥品，由中國藥品生物制品檢定所提供。5.1.1 取凍干菌種管、滅菌1ml 毛細(xì)滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面，移入接種室操作臺或超凈工作臺。5.1.2 將凍干菌種管外壁用碘酒（碘狀）擦拭消毒，稍干，用75%乙醇棉球擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上燒灼紅熱，用滅菌毛細(xì)滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在上述灼熱的菌種管封口端，使其驟冷炸裂。5.1.3 取滅菌鑷子，在酒精燈火焰上方，將炸裂的管口打

10、開，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1 支滅菌毛細(xì)滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌塊攪動是其溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將毛細(xì)滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種的營養(yǎng)瓊脂斜面置 3537c培養(yǎng)2224小時。5.1.4 取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌，涂片并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，如呈典型菌落，則轉(zhuǎn)種3 代即可使用。菌落不典型時，可進(jìn)行平板分離單菌落。5.2 菌種的接種與保存5.2.1 準(zhǔn)備需用的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。在標(biāo)簽上注明菌名及接種日期。從冷藏箱中取出菌種斜面后，應(yīng)在室溫放置約30 分鐘，待溫度平衡后再

11、移入接種室或超凈工作臺。5.2.2 點(diǎn)燃酒精燈或煤氣燈等，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約30 秒種，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3 次。右手用無名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手再輕輕拔開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰上方。塞上管塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面1 支，照上述操作打開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的底部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折蛇形移動，使細(xì)菌接種在斜面的表面上。5.2.3 取出接種環(huán)，在火焰上

12、方將培養(yǎng)基管蓋上塞子，然后將接種過細(xì)菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。5.2.4 將已接種的細(xì)菌管置3537c培養(yǎng)2224小時，霉菌管一般 置2425c霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7天。培養(yǎng)后放入4c冷藏箱內(nèi)保存， 一般13個月轉(zhuǎn)種一次。5.3 菌懸液的制備5.3.1 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisCMC（CB） 63 501懸液 取枯草芽抱桿菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，加滅菌水12ml將菌苔洗下，制成懸液，用吸管將此懸液接種至盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的扁培養(yǎng)瓶內(nèi)，均勻攤布，在 3537c培養(yǎng)7天。取菌苔少許涂片，革蘭氏染色鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上，用滅菌水10ml 將芽孢洗下，制成芽孢懸液，合并

13、至滅菌大試管內(nèi)，在65水浴中加熱30 分鐘將菌體殺死，待冷后置4冷藏箱貯藏。此菌液為濃菌液。日常試驗用菌液取上述濃溶液，用滅菌水1:3 稀釋至滅菌試管中，冷藏箱保存?zhèn)溆谩?.3.2 短小芽孢桿菌Bacillus subtilisCMC（CB） 63 202懸液 取短小芽孢桿菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照上述方法制備芽孢懸液。5.3.3 金黃色葡萄球菌Staphylococus aureusCMCC （ B） 26 003 懸液 取金黃色葡萄球菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，用接種環(huán)取菌苔少許接種至營養(yǎng)瓊脂斜面上，在3537c培養(yǎng)2224小時，臨用時，用滅菌水將菌苔洗下，制成懸液。置4冷藏箱

14、保存，可使用3 天。5.3.4 藤黃微球菌Micrococcus luteus CMCC （ B） 28 001 懸液 取藤黃微球菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物， 用1ml培養(yǎng)基田將菌苔 洗下，用吸管移至盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的扁培養(yǎng)瓶中，均勻攤布，將培養(yǎng)瓶倒置于培養(yǎng)箱中2627c培養(yǎng)24小時取出，用吸管吸取培養(yǎng) 基田或0.9%滅菌氯化鈉溶液5ml至培養(yǎng)瓶中，將菌苔洗下，合并菌 液至滅菌大試管中備用。置4c冰箱中保存，可使用12個月。5.3.5 大腸桿菌Eschehchia coli CMCC （ B） 44 103 懸液 取大腸桿菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照金黃色葡萄球菌菌懸液項下的方法制

15、備菌懸液，供當(dāng)日使用。5.3.6 肺炎克雷伯氏菌Klebosiella pneumoniae CMCC （ B） 46 117懸液 取肺炎克雷伯氏菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照金黃色葡萄球菌菌懸液項下的方法制備菌懸液，供當(dāng)日使用。5.3.7 啤酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae9736 懸液 取啤酒酵母菌的V號培養(yǎng)基瓊脂斜面培養(yǎng)物，用接種環(huán)取菌苔少許接種于IV號培養(yǎng)基斜面上，在3235c培養(yǎng)24小時，用滅菌水將菌苔洗下， 放至含有滅菌玻璃珠的試管中，振搖均勻，以當(dāng)日使用為宜。試驗菌的菌齡對抑菌圈邊緣清晰度有一定影響，應(yīng)保持菌種新 鮮。對易變異的菌株如藤黃微球菌等，宜在

16、制備菌液前進(jìn)行單菌落的 分離，選擇典型菌落以保持菌懸液中菌群的一致性，以使所得的抑菌圈邊緣清晰、整齊。6操作法6.1 稱量6.1.1 稱量前先將標(biāo)準(zhǔn)品從冰箱中取出，使其溫度與室溫平衡。6.1.2 供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的稱量應(yīng)使用用一架天平；對于吸濕性較強(qiáng) 的抗生素，應(yīng)在稱量前12小時更換天平內(nèi)干燥劑。6.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱量盡量一次取樣稱取， 不得將已取出的稱 取物倒回原容器內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)品的稱取量不得少于 20mg取樣后立即將 盛有樣品的稱量瓶或適宜的容器用蓋蓋好，以免吸水。稱樣量的計算：W= V CP式中W為需稱取標(biāo)準(zhǔn)品或供試品的重量（mg;V為溶解標(biāo)準(zhǔn)品或供試品制成濃溶液時用容量瓶的體積（m

17、l）;C為標(biāo)準(zhǔn)品或供試品濃溶液的濃度（u/ml或wg/ml）P為標(biāo)準(zhǔn)品的純度或供試品的估計效價（u/mg或wg/mg6.2 稀釋稀釋操作應(yīng)遵照容量分析的操作規(guī)程進(jìn)行。6.2.1 用于溶解及稀釋標(biāo)準(zhǔn)品或供試品的容量瓶和移液管等玻璃量器，應(yīng)按“常用玻璃量器國家計量檢定規(guī)程”進(jìn)行標(biāo)定，符合 A級的 要求。每步稀釋，量取量不得少于 2ml,稀釋步驟一般不超過3步。 舉例：量取貯備液（1000u/ml）,進(jìn)行以下稀釋。50ml量瓶，稀釋至刻度第一步 精密量取 5ml (1000u/ml) 100 u/ml50ml量瓶，稀釋至刻度第一步精密量取 5ml (1000u/ml) 10u/ml(H)100ml量

18、瓶，稀釋至刻度第一步精密量取 5ml (1000u/ml) 5u/ml(L)6.2.2 量取供試品溶液盡量使用刻度移液管，正式量取前要用供試液 流洗23次，吸取供試溶液后，用濾紙將外壁多余液體拭去，從起始 刻度開始放溶液。6.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液應(yīng)使用同一緩沖液(溶劑)稀釋，以 避免因pH或濃度不同而影響測定結(jié)果。6.2.4 稀釋時，每次加液至接近量瓶刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的 液體完全流下，再準(zhǔn)確補(bǔ)加至刻度。6.2.5 二劑量(2.2 )法的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液高、低濃度之比 為1:0.8。但所選用的濃度必須在劑量反應(yīng)直線范圍內(nèi)。6.3 雙碟制備6.3.1 雙碟的制備應(yīng)在半無菌

19、室或潔凈室內(nèi)進(jìn)行， 并注意避免微生物 及抗生素的污染。培養(yǎng)基應(yīng)在水浴中或微波爐內(nèi)融化，避免直火加熱。6.3.2 底層 用滅菌大口 20ml吸管或其他滅菌分裝器，吸取已融化 的培養(yǎng)基20ml注入雙碟內(nèi)，待凝固后更換干燥的陶瓦蓋，放置于35 37c培養(yǎng)箱中保溫，使菌層易于攤布。6.3.3 菌層 取出試驗用菌懸液，按預(yù)試好的加菌量(2.2)法標(biāo)準(zhǔn) 品溶液的高濃度所致的抑菌直徑在1822mm (3.3)法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在 15 18mm用滅菌吸管吸取懸液適 量，加入已融化并保溫在水浴中(水浴溫度，細(xì)菌為4850C。芽抱可至60C)的培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻，作為菌層培養(yǎng)基用。取出加有底層培

20、養(yǎng)基的雙碟，用滅菌大口 5ml、10ml吸管或其他適宜分裝器，吸 取菌層培養(yǎng)基5ml,加于底層培養(yǎng)基上，使其均勻攤布，用干燥陶瓦 蓋覆蓋，放置2030分鐘，待凝固。6.3.4 放置鋼管用鋼管放置器，將滅菌的鋼管放入貯管筒（杯） 內(nèi)，按說明書的要求操作，使鋼管平穩(wěn)地落在培養(yǎng)基上，注意使各鋼管下落的高度基本一致。如無鋼管放置器，可用小眼科鑷子夾持鋼管，輕輕地放置在培養(yǎng)基上，相應(yīng)劑量的鋼管對角均勻放置。鋼管放妥后，應(yīng)使雙碟靜置510分鐘，鋼管在瓊脂上沉穩(wěn)后，再開始滴加抗生素溶液。6.4 滴加抗生素溶液6.4.1 每批供試品取不少于6個雙碟， 滴加溶液用滅菌毛細(xì)滴管或微量加樣器（調(diào)節(jié)加卞量約為2003

21、00W1）在滴加之前須用溶液洗2 3 次。6.4.2 滴加標(biāo)準(zhǔn)品及供試品溶液順序，因?qū)嶒炘O(shè)計方法不用而異。（2.（2） 在雙碟的4個鋼管中分別成“ Z”字形滴加標(biāo)準(zhǔn)品（S） 及供試品（T）高（H）、低（L）兩種濃度的溶液，即滴加溶液的順序 為 SH TH TL SL； （ 3.3 ）法的 6 個鋼管中間隔3 個鋼管中分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品及供試品高（H） 、中（M） 、低（L） 3 種濃度溶液，并使相同濃度成對角，滴加順序為SH TH SM TM SL TL。滴加溶液至鋼管口平滿，注意滴加溶液的間隔不可過長，否則因鋼管內(nèi)溶液的擴(kuò)散時間不同會影響測定結(jié)果。6.4.3 每份滴加的溶液為同一單位，但雙碟數(shù)每

22、次不超過5個， 如果1 份溶液滴加雙碟數(shù)目多，可分次滴加。每種溶液各用1 支毛細(xì)滴管。6.4.4 滴加完畢，用陶瓦蓋覆蓋雙碟，平穩(wěn)置于雙碟托盤內(nèi)，雙碟疊放不可超過3 層，以免受熱不均，影響抑菌圈大小。將雙碟托盤水平平穩(wěn)地移入培養(yǎng)箱中間位置，在 3537c或該藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的溫度下培養(yǎng)至所需時間。6.5抑菌圈測量6.5.1 將培養(yǎng)好的雙碟取出，拿掉陶瓦蓋，將鋼管倒入盛有1:1000新潔爾滅（苯扎澳鏤）溶液或其他消毒液內(nèi)滅菌，換以玻璃蓋；測量 抑菌圈前，應(yīng)檢查抑菌圈是否圓整，如有破圈或圈不圓整，應(yīng)舍棄該 碟，切忌主觀挑選雙碟或抑菌圈，以免造成測定結(jié)果的偏倚。6.5.2 測量抑菌圈可以使用抑菌圈測量儀

23、， 也可用游標(biāo)卡尺；使用的 抑菌圈測量儀應(yīng)經(jīng)過檢定，并符合檢定規(guī)程的要求，操作時應(yīng)按儀器 的操作規(guī)程進(jìn)行：使用游標(biāo)卡尺測量時，眼睛視線應(yīng)與讀數(shù)刻度垂直， 用卡尺的尖端與抑菌圈直徑的切點(diǎn)成垂直方向測量。7記錄與計算7.1 記錄 試驗記錄應(yīng)包括抗生素藥品名稱、規(guī)格、批號、生產(chǎn)廠、 檢查編號、檢查依據(jù)、檢驗日期、溫度、相對濕度、標(biāo)準(zhǔn)品名稱、標(biāo) 準(zhǔn)品批號、標(biāo)準(zhǔn)品來源及標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示含量、試驗菌名稱及菌懸液濃度、 培養(yǎng)基名稱、來源及批號、緩沖液名稱及pH供試品估計效價、抑菌圈測量儀型號及編號、標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱量、稀釋步驟、試驗人 與校核人、抑菌圈測量及數(shù)據(jù)處理結(jié)果。當(dāng)用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直 徑時，應(yīng)將測得

24、數(shù)據(jù)按相應(yīng)劑量濃度以列表形式記錄。用測量儀測量 抑菌圈面積或直徑時，應(yīng)將儀器的測量、數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析及計算 結(jié)果打印后貼附于記錄頁上。7.2 計算7.2.1 二劑量法（2.2法）效價計算公式 1P=log T2+T1-S2-S1 =I X100% T2+S2 T1 S1式中 P為供試品效價（相當(dāng)于標(biāo)示量或估計效價的百分?jǐn)?shù)）； 4為標(biāo)準(zhǔn)品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； S1為標(biāo)準(zhǔn)品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； T2為標(biāo)準(zhǔn)品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； T1為標(biāo)準(zhǔn)品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；I為高、低劑量之比的對數(shù)值，2:1時，1=0.30

25、1。4:1時,I =0.602。舉例乳糖酸紅霉素效價測定結(jié)果計算（見表1）表1抑菌圈面積測量結(jié)果抑菌圈面積碟數(shù)S1 S 2 T 2 T115711276158112682148111991523117331523130214971263415181214153312265157312371543126861546121915801224714951260152612408153012371548126391605125615931293101649127216081320E15491124721553212528估計效價（Ar） =603u/mg劑距（I ） =0.301P=log -1 15

26、532+12528-15491-12472乂 0.301 乂100%=101.1%15491 + 15532-12472-12528效價（PT） =PXAr=603u/mgx 101.1%=609.8u/mg7.2.2 三劑量法計算公式P=log-1 0.1292 （T3+T2+T1 3 S2 S） X 100%S3+T3-S1-T1式中 $為標(biāo)準(zhǔn)品高濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；S2為標(biāo)準(zhǔn)品中間濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；S為標(biāo)準(zhǔn)品低濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；T3為供試品高濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；T2為標(biāo)準(zhǔn)品中間濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；T1為標(biāo)

27、準(zhǔn)品低濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；I為高、低濃度劑量之比的對數(shù)值，1:08時，1=0.0969舉例新霉素效價測定結(jié)果計算（見表 2）。表2抑菌圈直徑測量結(jié)果抑菌圈直徑碟數(shù) SS2S 3 T 1 T 2 T 316.05 16.20 16.50 15.80 16.35 16.6023456716.20 16.45 16.6516.00 16.45 16.7015.95 16.35 16.6015.70 16.25 16.6015.55 16.20 16.5515.65 16.20 16.4016.20 16.45 16.7016.05 16.35 16.7016.00 16.25 16.

28、6015.85 16.25 16.6015.70 16.20 16.6015.80 16.15 16.4015.80 16.10 16.5015.70 15.95 16.30815.90 16.10 16.45915.60 16.00 16.30E 142.60 146.20 148.75 142.90 146.05 149.00估計效價（Ar） =670u/mg劑距（I ） =0.0969P=log-10.1292 （142.9+146.05+149.00-142.6-146.2-148.75 X100% 148.75+149.00-142.6-142.9P=101.1%效價（R） =PX

29、A=101.1%x 670u/mg =676.7u/mg8結(jié)果判定8.1 可靠性測驗 管碟法系根據(jù)量反應(yīng)平行線原理而設(shè)計，并要求在試 驗所用的劑量（濃度）范圍內(nèi)，對數(shù)劑量（濃度）與反應(yīng)呈直線關(guān)系。 可靠性測驗即通過對劑間變異的分析，以測驗標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的對數(shù)劑 量與反應(yīng)的關(guān)系是否顯著偏離平行直線。（2.2 ）法的劑間變異分析為試 品間、回歸和偏離平行三項；（3.3）法還需再分析二次曲線和反向二次 曲線，如用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，可用（2.2）法和（3.3）法的專 用數(shù)據(jù)處理軟件對測量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理和結(jié)果計算。用抑菌圈測量 儀測量抑菌圈時，測量與統(tǒng)計學(xué)處理一次完成，統(tǒng)計學(xué)分析按藥典附錄 的

30、生物檢定統(tǒng)計法進(jìn)行 F的顯著性測驗。（2.2）法要求直線回歸和劑間 要非常顯著（P<0.01）,偏離平行不應(yīng)顯著（P>0.05）; （3.3）法除（2.2） 法的上述規(guī)定外，尚需考察二次曲線和反向二次曲線，且二者均應(yīng)不顯 著（P>0.05）,符合以上各項規(guī)定后，才能認(rèn)為試驗結(jié)果可靠，方可進(jìn)行 效價和可信限率計算。8.2 可信限率 考核試驗的精密度。除藥典各論另有規(guī)定外，管碟法的 可信限率不得超過5%上述各項都能符合者，試驗結(jié)果成立。8.3 試驗計算所得效價低于估計效價的 90%g高于估計效價的110%則 檢驗結(jié)果僅作為初試，應(yīng)調(diào)整供試品估計效價，予以重試。8.4 原料藥效價測

31、定一般需做雙份樣品平行試驗，以使核對。對于檢驗 結(jié)果不符合規(guī)定的樣品，應(yīng)有可靠性測驗及可信限率均符合規(guī)定，且測 定結(jié)果在估計效價（原料藥）或標(biāo)示量（制劑）士10喊圍內(nèi)白至少2個效價測定結(jié)果，必要時應(yīng)請其他檢驗人員復(fù)核，才能發(fā)出檢驗報告。8.5 效價測定結(jié)果的有效數(shù)字按藥典規(guī)定及數(shù)字的原則取舍。9操作要點(diǎn)9.1抗生素原料藥不含輔料的藥物制劑原料，一般其效價以純度（u/mg 或pg/mg）表示。檢驗時，可參考該品種的藥品標(biāo)準(zhǔn)純度限度規(guī)定或廠方 提供的純度估計效價，取樣試驗，如估計效價與實際效價相差較遠(yuǎn)時， 即測定所得效價超出估計效價的士 10%寸，則重新估計效價，再做準(zhǔn)確測 定。原料藥一般皆以干燥

32、品或無水物折算效價，須先測其含水或未折干 效價，再根據(jù)供試品的水分或干燥失重測定結(jié)果折算成無水物或干燥品 的效價。干燥品或無水物效價（u/mg）= 濕品（或未折干品）效價（u/mg）1-供試品干燥失重或水分9.2抗生素制劑9.2.1 粉針劑 指注射用無菌粉末或凍干品，用西林瓶橡膠塞鋁蓋封裝或熔封在安甑內(nèi)，一般測定其純度（u/mg或wg/mg）或整瓶效價。取裝量差異項下的內(nèi)容物，稱取適量（50mg以上，根據(jù)標(biāo)示量及平均裝量折算估計效價，并按估計效價及量瓶體積計算取樣量）， 置量瓶中，加標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的溶劑溶解，稀釋，測定，計算出1mg的效價單位數(shù)，再根據(jù)平均裝量及標(biāo)示量計算平均每瓶的百分含量。9.2

33、.2 水針劑（注射液）即抗生素的滅菌水溶液，標(biāo)示量一般按每毫升含效價單位計。效價測定時，量取平均裝量項下的內(nèi)容物或510支的內(nèi)容物，混勻，用干燥的刻度吸管吸取一定量的供試品，將吸管外壁用濾紙拭凈，再棄去多余的溶液，使供試品至吸管刻度，沿量瓶頸部內(nèi)壁緩緩流放入已盛有一定量溶劑（以免抗生素結(jié)晶析出）的量瓶內(nèi)，混勻，繼續(xù)加溶劑至刻度，搖勻，再量取適量稀釋至規(guī)定的濃度。9.2.3 片劑 包括素片、薄膜衣片、糖衣片及腸溶片。素片、薄膜衣片稱取 20 片的總量，求出平均片重，研細(xì)混勻后，精密稱取適量（約相當(dāng)于1 片的重量或根據(jù)標(biāo)示量按平均片重及所用量瓶體積折算取樣量），置量瓶中，用標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的溶劑溶解，并

34、稀釋至刻度，搖勻。再量取適量稀釋至規(guī)定濃度。注意點(diǎn)：研磨時應(yīng)注意環(huán)境干燥，可在干燥操作柜內(nèi)操作，研磨要迅速，避免吸濕，因片劑內(nèi)含輔料較多，輔料可能漂浮于溶液表面，稀釋時量取供試溶液應(yīng)讀取輔料下層的溶液切面；如沉淀較多，須待其下沉后再量取上層液；有些輔料吸附抗生素，應(yīng)加以注意。為節(jié)約供試品，可與重量差異檢查結(jié)果進(jìn)行。糖衣片、腸溶片取標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的片數(shù)，置于乳缽中，研細(xì)，分次加入規(guī)定的溶劑，研磨使其溶解，將研磨液轉(zhuǎn)移至瓶口放有小漏斗的量瓶中，量瓶體積根據(jù)供試品標(biāo)示量、所取片數(shù)及抗生素儲備液濃度（一般為 1000 單位 /ml ）選定，用規(guī)定溶劑稀釋至刻度，搖勻，靜置，使輔料下沉而抗生素已溶解在溶液內(nèi)

35、，精密吸取量瓶中的上層液適量，作進(jìn)一步稀釋。個別品種標(biāo)準(zhǔn)如同時收載了糖衣片和薄膜衣片，可能規(guī)定薄膜衣片也取整片制備供試品溶液。9.2.4 膠囊劑 取裝量差異項下的內(nèi)容物，混合均勻，研細(xì)，根據(jù)平均裝量，精密稱取約相當(dāng)于1 粒膠囊的量或按標(biāo)示量、量瓶體積及抗生素儲備液濃度等計算的取樣量，置于量瓶中，加規(guī)定的溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，如供試品含有較多的輔料，則照片劑項下的方法進(jìn)行。9.2.5 顆粒劑、干混懸劑取裝量差異項下的內(nèi)容物，混勻，根據(jù)平均裝量，精密稱取約相當(dāng)于1 袋（包）的量或按標(biāo)示量、量瓶體積及抗生素儲備液濃度等計算的取樣量，置于量瓶中，加規(guī)定的溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。量取適量稀釋制

36、成供試品溶液。測得效價后，再根據(jù)裝量差異項下的平均裝量，計算出平均每袋（包）的效價，根據(jù)標(biāo)示量即可算出含量。9.2.6 軟膏劑、眼膏劑擦凈軟膏劑或眼膏劑軟管的外壁，切開封口，置于干燥器內(nèi)約1 小時，取干燥的潔凈分液漏斗，帶手套操作，將膏劑軟管連同內(nèi)容物在天平上稱重，取出， 將內(nèi)容物擠入分液漏斗，量約 2g，再稱取膏劑軟管的重量，按減重法以前后稱量之差計算分液漏斗內(nèi)膏劑供試品的量，以不號過氧化物的乙醚或石油醚等作溶劑溶解基質(zhì)，但基質(zhì)中抗生素則應(yīng)不溶于或幾乎不溶于該有機(jī)溶劑中，以避免提取過程中抗生素的損失。按標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定加提取溶劑至分液漏斗中，振搖，使基質(zhì)溶解，用規(guī)定的緩沖溶液提取抗生素至說相中，

37、用緩沖溶液提取3 次，合并 3 次的提取液，置量瓶中，加緩沖溶液至刻度，搖勻，量取適量稀釋至規(guī)定的濃度，滴加雙碟，培養(yǎng)，測量抑菌圈，數(shù)據(jù)處理，可靠性測驗及可信限率判斷，計算效價。抗生素微生物比濁法10 儀器與用具10.1 操作室 要求同管低法10.2 分光光度計應(yīng)有數(shù)字顯示功能和自動記錄裝置，數(shù)顯精度應(yīng)在小數(shù)點(diǎn)后三位。10.3 玻璃大試管20.5mm x 2.5mm或適宜的試管，應(yīng)大小一致，厚薄均 勻，玻璃質(zhì)地相同，使用同一品牌和批號。使用過的試管經(jīng)滅菌后，將培養(yǎng)基傾出，用水清洗，瀝干，再用硫酸重鉻酸鉀洗液浸泡，清水沖洗干凈后，晾干，在160c干烤23小時滅菌，保持潔凈，備用。注意 避免污染毛

38、點(diǎn)、纖維等，以免干擾測定結(jié)果。10.4 移液管 10ml 或 20ml 刻度容量，管口需磨粗（大）， 以便快速分裝培養(yǎng)基。10.5 恒溫水浴箱 工作體積600mm（ 300mmmm150mm長X寬X高）。電 熱恒溫水浴。10.6 電動攪拌器將二臺電動攪拌器的槳葉置于恒溫水浴的大試管隨機(jī)區(qū)組培養(yǎng)方列的兩側(cè)，于水中攪動，以使水溫均勻。本身帶有攪拌或 循環(huán)水系統(tǒng)的恒溫水浴箱，可不再配備電動攪拌器。10.7 分光光度計用吸收池方形玻璃吸收池或石英吸收池，透光面1cm，用硝酸硫酸混合液（取濃硫酸95ml,加濃硝酸35ml,混勻）浸泡1 48 小時 （浸泡時間視是否能去除附著污物而定）， 先后用水、去離子

39、水 （蒸儲水）沖洗干凈，晾干，備用。如仍不能除去附著污物，可用1%- 2%肖酸鈉的濃硫酸溶液浸泡后，再經(jīng)水洗滌。10.8 其他 分析天平、稱量瓶、量瓶、25ml 及 50ml 滴定管、秒表、濾紙及鏡頭紙等。11 試管 除同管碟法的要求外，比濁法用的緩沖液應(yīng)澄清無色，緩沖液配制后用垂熔玻璃漏斗濾過，除去沉淀等不溶物，使溶液澄清。使用前 滅菌。12 培養(yǎng)基 除同管碟法的要求外，比濁法使用的培養(yǎng)基應(yīng)澄清，顏色以盡量淺為佳，培養(yǎng)后培養(yǎng)基本身不得出現(xiàn)渾濁。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后不得發(fā)生沉淀。根據(jù)這一原則，通過對培養(yǎng)基原材料的預(yù)試，挑選合適品牌廠家的產(chǎn)品使用。目前，已有一些種類的市售干燥培養(yǎng)基，如營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，

40、改良馬丁培養(yǎng)基等，使用方便。13 試驗用菌液13.1 金黃色葡萄球菌（Staphylococus aureus ）懸液 取金黃色葡萄球菌 CMCC（ B） 26 003的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在3537c培養(yǎng)2022小時。臨用時，用滅菌水或 0.9%滅菌氧 化鈉溶液將菌苔洗下，備用。13.2 大腸桿菌 （ Eschehchia coli ） 懸液 取大腸桿菌CMC（C B） 44 103的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在 3537 c培 養(yǎng)2022小時。臨用時，用滅菌水將菌苔洗下，備用。13.3 白色念珠菌（Candida albicans ）懸液

41、取白色念珠菌CMCC（ F）98 001的改良馬丁瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物，接種于 10ml培養(yǎng)基IX （中 國藥典2005年版二部附錄XI A 抗生素微生物檢定法）中，在3537c 培養(yǎng)8小時，再用培養(yǎng)基IX稀釋至適宜濃度，備用。14 操作方法14.1 稱量要求同管碟法。14.2 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的稀釋應(yīng)使用經(jīng)標(biāo)定的量瓶，每步稀釋的量取量以不少于2ml 為宜，稀釋步驟一般不超過3 步。14.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線法14.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液按中國藥典該品種含量測定項下的要求，制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。在該品種項下規(guī)定的劑量反應(yīng)線性范圍內(nèi)，以線性濃度范圍的中間值作為中間濃度，標(biāo)準(zhǔn)品溶液選擇5 個劑量，

42、劑量間的比例應(yīng)適宜（通常為1:1.25 或更?。?。14.3.2 供試品溶液根據(jù)估計效價或標(biāo)示量，取供試品按標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備方法，選擇中間濃度，不少于3 個試管。14.3.3 含試驗菌液體培養(yǎng)基的制備臨用前， 取規(guī)定的試驗菌懸液適量（3537c培養(yǎng)34小時后測定的吸光度在0.30.7之間），加入到各液體培養(yǎng)基管中，混合均勻，使在試驗條件下能得到滿意的劑量反應(yīng)關(guān)系和適宜的測定濁度（吸光度）。含試驗菌液體培養(yǎng)基在配制后應(yīng)立即使用，必要時可適當(dāng)冷卻，以防止試驗菌在培養(yǎng)前生長。14.3.4 線性試驗取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管，再各個試管內(nèi)分別精密加入各個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液各1.0ml ，

43、再精密加入含試驗菌的液體培養(yǎng)基9.0ml， 立即混勻，按隨機(jī)區(qū)組分配將各個試驗管放置于恒溫水浴內(nèi)，在規(guī)定的條件下培養(yǎng)（通常約4 小時）至適宜測量的濁度值（吸光度值）。各濃度不少于4 個試管。14.4 平行線測定法（二劑量（2.2）和三劑量（3.3）法）14.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液按中國藥典該品種含量測定項下的要求，制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。在該品種項下規(guī)定的劑量反應(yīng)線性范圍內(nèi)，選擇 2個或 3 個劑量， 劑量間的比例應(yīng)適宜（二劑量通常為2:1 或 4:1 ， 三劑量通常為 1:0.8 ） 。14.4.2 供試品溶液根據(jù)估計效價或標(biāo)示量，取供試品按標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備方法，選擇2 個或 3 個劑量。14.4.3 含試驗菌液體培養(yǎng)基的制備同 14.3.3 配制方法。14.4.4 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品測定取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管，在各個試管內(nèi)分別精密加入2 個或 3 個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液各1.0ml ，再精密加入含試驗菌的液體培養(yǎng)基9.0ml ， 立即混勻，按隨機(jī)區(qū)組分配將各管在規(guī)定條件下培養(yǎng)至適宜測量的濁度值（通常約為4 小時） 。各濃度不少于 4個試管。14.5 空白試驗 另