一抗、二抗的選擇分享資料

1、1一抗、二抗的選擇2一抗的選擇 1.分析實(shí)驗(yàn)應(yīng)用類型WB（Western Blot 免疫印跡 ）IHC （immunohistochemistry免疫組織化學(xué)）ELISA（enzyme-linked immunoadsordent assay 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ）3 2.樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì) 樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域 全長蛋白、蛋白片段、多肽、 細(xì)菌、細(xì)胞 樣本的提取和處理過程u 某些抗體要求樣本經(jīng)過某些特殊處理，例如：許多抗體只識別還原和變性的、表位已暴露不受二級四級結(jié)構(gòu)阻礙的蛋白樣本，u 某些抗體僅識別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當(dāng)選擇免疫組化的抗體時(shí)，應(yīng)注意某些抗體只識別未固定的冷凍的組織，u 另一些抗體

2、則適用于無需抗原修復(fù)解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區(qū)域用含此片段域的免疫原制備出的抗體。用FACS流式檢測活細(xì)胞的表面蛋白用含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。 4 3.樣本的物種 選擇物種相同或有交叉反應(yīng)的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應(yīng)，因其氨基酸序列同源性較高，如果樣本的種類未列入抗體說明書上的交叉反應(yīng)種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測驗(yàn)證過，應(yīng)通過序列比對的方法來預(yù)測交叉反應(yīng)，可應(yīng)用Expasy 和 NCBI BLAST來進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對。5 4.一抗宿主物種的選

3、擇 一般說來，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿主動(dòng)物的物種選擇較為重要，對于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)， 例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。 如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對不含IgG的細(xì)胞裂解物樣本的western blotting檢測，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含Ig

4、G，在western blot檢測中則結(jié)合出現(xiàn)IgG分子50 and 25 kDa的重鏈和輕鏈條帶。 6二抗的選擇 1.一抗的種屬來源 二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來源， 7 2.二抗的種屬來源u 一般來說，不同的種屬來源與二抗的質(zhì)量沒有必然的聯(lián)系，來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實(shí)驗(yàn)里沒有太多的差別。u在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里，如雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)里，如果其中一個(gè)一抗是山羊來源的，一個(gè)是小鼠來源的，則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時(shí)候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。 8 3二抗的偶聯(lián)標(biāo)記 主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團(tuán)（FITC

5、、Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、金顆粒。 選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。u對于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶標(biāo)二抗；u細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，u免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。u如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用Biotin/Avidin檢測系統(tǒng)。u在一些熒光檢測方案中，則需要選擇不同的熒光標(biāo)記；u金顆粒標(biāo)記的二抗則更多的應(yīng)用于免疫電鏡中。 9 4.是否經(jīng)過血清吸附過的二抗為減少二抗與樣本的非特異性結(jié)合

6、，可選擇經(jīng)過血清吸附過的二抗如檢測樣本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗就需要選擇抗小鼠源的二抗，如果對實(shí)驗(yàn)的特異性要求很高，選擇經(jīng)過人血清吸附過的抗小鼠源的二抗，這種二抗由于經(jīng)過人血清吸附而排除了與人源組織（如IgG等）可能發(fā)生非特異性反應(yīng)的IgG，因此將非特異性結(jié)合降低到最低。10 5.二抗的類別亞型IgM是體液免疫應(yīng)答首先產(chǎn)生的Ig。IgA是機(jī)體黏膜防御感染的重要因素。IgG是初級免疫應(yīng)答中最持久、最重要的抗體，它僅以單體形式存在。大多抗菌性、抗毒性和抗病毒抗體屬于IgGIgE是同速發(fā)型過敏反應(yīng)發(fā)生有關(guān)的Ig。IgD以膜結(jié)合形式存在于B細(xì)胞，在B細(xì)胞分化發(fā)育中起重調(diào)節(jié)有作用11

7、 IgM抗體的檢測用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。 12 免疫球蛋白在不同疾病的濃度高低IgGu正常情況下正常情況下，臍血IgG含量為7.617g/L；血IgG含量新生兒為7.014.8 g/L，0.56個(gè)月為310.0 g/L，6個(gè)月2歲為512 g/L，26歲為513g/L，612歲為716.5g/L

8、，1216歲為715.5g/L，成人為616g/L。uIgG增高增高：患慢性肝病、亞急性或慢性感染、結(jié)締組織疾病、IgG骨髓瘤、無癥狀性單克隆IgG病等；uIgG降低降低：在遺傳性或獲得性抗體缺乏癥、混合性免疫缺陷綜合征、選擇性IgG缺乏癥、蛋白丟失性腸病、腎病綜合癥、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、免疫抑制劑治療等情況下。 IgAu正常情況，正常情況，臍血IgA含量為050mg/L; 血內(nèi)IgA含量新生兒為022mg/L，0.56個(gè)月為3820mg/L，7個(gè)月2歲為1401080 mg/L，26歲為2301900mg/L，612歲為2902700mg/L，1216歲為8102320mg/L，成人為7603

9、900mg/L。uIgA增高：增高：在慢性肝病，亞急性或慢性感染性疾?。ㄈ缃Y(jié)核、真菌感染等）、自身免疫性疾?。ㄈ鏢LE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）、囊性纖維化、家族性嗜中性粒細(xì)胞減少癥、乳腺癌、IgA腎病、IgA骨髓瘤等情況下；uIgA降低：降低：在遺傳性或獲得性抗體缺乏癥、免疫缺陷病、選擇性IgA缺乏癥、無球蛋白血癥、蛋白丟失性腸病、燒傷、抗IgA抗體綜合癥、免疫抑制劑治療、妊娠后期等情況下。 IgMu 正常情況下正常情況下，臍血IgM含量為40240mg/L，血內(nèi)IgM含量新生兒為50300mg/L，0.56個(gè)月為1501090mg/L，6個(gè)月2歲為4302390mg/L，26歲為5001990mg/

10、L， 612歲為5002600mg/L，1216歲為4502400mg/L，成人為4003450mg/L。uIgM增高增高：在胎兒宮內(nèi)感染、新生兒TORC H綜合癥、慢性或亞急性感染、瘧疾、傳染性單核細(xì)胞增多癥、支原體肺炎、肝病、結(jié)締組織疾病、巨球蛋白血癥，無癥狀性單克隆IgM病等情況下，；uIgM降低：降低：在遺傳性或獲得性抗體缺乏癥、混合性免疫缺陷綜合癥、選擇性IgM缺乏癥、蛋白丟失性腸病、燒傷、抗Ig抗體綜合癥（混合性冷球蛋白血癥）、免疫抑制等情況下，。13 IgM是由五個(gè)單體組成的五聚體，含10個(gè)重鏈和10個(gè)輕鏈，具有10個(gè)抗原結(jié)合價(jià)，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個(gè)抗原結(jié)合價(jià)。IgM

11、分子量約為900000，IgG分子量約為150000。 機(jī)體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時(shí)間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。 IgM抗體一般為保護(hù)性抗體具有免疫性。因此IgM抗體的測定，對某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床診斷價(jià)值。 IgM 是抗原刺激誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答中最先產(chǎn)生的Ig ，IgM 不是細(xì)胞，但可結(jié)合補(bǔ)體，主要分布于血清中。由于IgM 有較高的結(jié)合價(jià)，所以是高效能的抗生物抗體，其殺菌、溶菌、促吞噬和凝集作用比IgG 高500- 1000 倍，IgM 在機(jī)體的早期防御中起著重要的作用。IgM14 IgA

12、 分血清型和分泌型兩種，u血清型多為單體，也有二聚體，血清型IgA可介導(dǎo)調(diào)理吞噬ADCC 作用；u分泌型的都是二聚體，且含有分泌片。n分泌型IgA（SIgA）是機(jī)體粘膜防御系統(tǒng)的主要成分，覆蓋在鼻、咽、氣管、腸和膀胱粘膜的表面，它能抑制微生物在呼吸道上皮附著，減緩病毒繁殖，是粘膜重要屏障，對某些病毒、細(xì)菌和般抗原具有抗體活性，是防止病原體入侵機(jī)體的第一道防線。n外來抗原進(jìn)入呼吸道或消化道，局部免疫系統(tǒng)受到刺激后，無需中央免疫系統(tǒng)的參與，自身就可進(jìn)行免疫應(yīng)答，產(chǎn)生分泌型抗體，即SIgA。n已有研究證明，呼吸道分泌液中SigA 含量的高低直接影響呼吸道粘膜對病原體的抵抗力，兩者呈正相關(guān)。 初乳中含

13、有分泌型的sIgA。 IgA的凝聚物可以通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體。IgA15 人體血清免疫球蛋白IgG是初級免疫應(yīng)答中最持久、最重要的抗體，它僅以單體形式存在。 大多抗菌性、抗毒性和抗病毒抗體屬于IgG，它在抗感染中起到主力軍作用，它能夠促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用（調(diào)理作用），中和細(xì)菌毒素的毒性（中和毒素）和病毒抗原結(jié)合使病毒失去感染宿主細(xì)胞的能力（中和病毒）。 IgG 在機(jī)體合成的年齡要晚于IgM，在出生后第3 個(gè)月開始合成，3-5 歲接近成年人水平。 它是唯一能通過胎盤的Ig，在自然被動(dòng)免疫中起重要作用。此外，IgG 還具有調(diào)理吞噬和結(jié)合SPA等作用。IgG16【Anti-IgG還是還是Ant

14、i-IgG,F（ab）2fragment】在一些如胸腺、脾臟、血液的組織以及造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)，通常含有較多的Fc受體，這時(shí)候選擇二抗時(shí)最好選擇Anti-IgG, F（ab）2 fragment這樣的特異性二抗，這樣就消除了由于Fc部分與IgG的非特異性結(jié)合。常規(guī)的Anti-IgG （H+L）二抗與IgG的重鏈和輕鏈都有結(jié)合反應(yīng)，即與IgG的Fc的F（ab）2片段都能結(jié)合；由于IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，因此Anti-IgG （H+L）與它們都有交叉反應(yīng)。而Anti-IgG, F（ab）2 fragment經(jīng)過了IgG Fc片段的吸附，因此只與IgG的F（ab）2片段結(jié)合。17 針對某一種屬的抗體可能會(huì)和其他一些種屬有交叉反應(yīng)。牛血清白蛋白和奶粉可能含有與抗