丙二醛含量測定

1、實驗六、植物組織丙二醛含量測定植物葉片在衰老過程中發(fā)生一系列生理生化變化，如核酸和蛋白質(zhì)含量下降、葉綠素降解、光合作用降低及內(nèi)源激素平衡失調(diào)等。這些指標在一定程度上反映衰老過程的變化。近來大量研究表明，植物在逆境脅迫或衰老過程中，細胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞而有利于活性氧的積累。活性氧積累的危害之一是引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用，造成細胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴重時會導致植物細胞死亡?；钚匝醢ê醢子苫?。白由基是具有未配對價電子的原子或原子團。生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧主要有超氧白由基（O-2）、羥白由基（OH）、過氧白由基（ROO）、烷氧白由基（RO）、過氧化氫（H2O2、單線態(tài)氧（O2D等。植物對活性氧產(chǎn)

2、生有酶促和非酶促兩類防御系統(tǒng)，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶POD和抗壞血酸過氧化物酶（AS2POD痔是酶促防御系統(tǒng)的重要保護酶，抗壞血酸（ASA）和還原型谷胱甘肽（GSH痔是非酶促防御系統(tǒng)中的重要抗氧化劑。丙二醛（MDA是細胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。因此，丙二醛產(chǎn)生數(shù)量的多少能夠代表膜脂過氧化的程度，也可間接反映植物組織的抗氧化能力的強弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一個常用指標。原理植物組織中的丙二醛（MDA）在酸性條件下加熱可與硫代巴比妥酸（TBA）產(chǎn)生顯色反應，反應產(chǎn)物為粉紅色的3,5,5一三甲基惡哇2,4一二

3、酮（Trimetnine）。該物質(zhì)在539nm波長下有吸收峰。由于硫代巴比妥酸也可與其它物質(zhì)反應，并在該波長處有吸收，為消除硫代巴比妥酸與其它物質(zhì)反應的影響，在丙二醛含量測定時，同時測定600nm下的吸光度，利用539nm與600nm下的吸光度的差值計算丙二醛的含量。材料、儀器、藥品1 .材料：植物抗逆性鑒定實驗中的四種菠菜樣品，即綠色和黃色葉片的局溫處理和室溫對照。2 .儀器：(1)分光光度計；(2)離心機；(3)水浴鍋：(4)天平；(5)研缽；(6)剪刀；(7)5ml刻度離心管;(9)刻度試管(10ml);(10)鑲子；(11)移液管(5ml、2ml、1ml);(12)冰箱。3. 藥品：(

4、1) 0.05mol/LpH7.8磷酸鈉緩沖液；(2) 石英砂；(3) 5%三氯乙酸溶液：稱取5g三氯乙酸，先用少量蒸館水溶解，然后定容到100ml;(4) 0.5%硫代巴比妥酸溶液：稱取0.5g硫代巴比妥酸，用5%三氯乙酸溶解，定容至100ml,即為0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液。方法丙二醛的提?。喝?.5g樣品，加入2ml預冷的0.05mol/LpH7.8的磷酸緩沖液，加入少量石英砂，在經(jīng)過冰浴的研缽內(nèi)研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到5ml刻度離心試管，將研缽用緩沖液洗凈，清洗也移入離心管中，最后用緩沖液定容至5ml。在4500轉(zhuǎn)/min離心10min。上清液即為丙二醛提取液。丙二醛含量測定：吸

5、取2ml的提取液于刻度試管中，加入0.5%硫代巴比妥酸的5嚇氯乙酸溶液3ml,于沸水浴上加熱10min,迅速冷卻。于4500轉(zhuǎn)/min離心10min。取上清液于532、600nm波長下，以蒸館水為空白調(diào)透光率100%測定吸光度。3 .結(jié)果計算：(A532A600)XV1XV丙二醛含量(nmol/g)=1.55x10-1xWV2式中：A為吸光度；V1為反應液總量(5m1);V為提取液總量(5ml);V2為反應液中的提取液數(shù)量(2ml);W為植物樣品重量(0.5g);1.55X10-1為丙二醛的微摩爾吸光系數(shù)(在1升溶液中含有1Vmol丙二醛時的吸光度)。4. 注意事項：0.10.5%的三氯乙酸對

6、MDA-TBA反應較合適，若高于此濃度，其反應液的非專一性吸收偏高；MDA-TBA顯色反應的加熱時間，最好控制沸水浴1015min之間。時間太短或太長均會引起532nm下的光吸收值下降；如用MDA乍為植物衰老指標，首先應檢驗被測試材料提取液是否能與TBA反應形成532nm處的吸收峰。否則只測定532、600nm兩處A值，計算結(jié)果與實際情況不符，測得的高A值是一個假象；在有糖類物質(zhì)干擾條件下(如深度衰老時)，吸光度的增大，不再是由于脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量的升高，而是水溶性碳水化合物的增加，由此改變了提取液成分，不能再用532nm600nm兩處A值計算MD雄量，可測定510、532、560nm處的A值，用A532一(A510A560)/2的值來代表丙二醛與TBA反應液的吸光值。實驗結(jié)果記錄實驗前思考題(1) 通過丙二醛含量測定能夠解決什么理論和實際問題？(2) 什么時候植物會發(fā)生嚴重的膜脂過氧化作用？簡述其過氧化作用過程。(3) 說明膜脂過氧化作用的對植物的效應。(4) TBA為什么要溶解在三氯乙酸中？(5) 提取液與TBA的混合液為什么要加熱？為什么加熱時間又不能過長？(6) 為什么要測定反應液在600nm下的吸光度？在計算公式中，為什么吸光系數(shù)的單位是微摩爾，而最后的含量單位卻是毫微摩爾？(7) 寫出實驗時間按排和操