菌種保存、傳代、使用、銷毀管理規(guī)程

1、菌種管理制度1、目的 建立菌種保存、傳代、使用、銷毀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，規(guī)范微生物學(xué)檢定用菌種的管 理，最大限度降低變異率，確保菌種的溯源性與穩(wěn)定性，從而確保微生物學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn) 確可靠。2、適用范圍 本規(guī)程適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的購買、保存、傳代、使用及銷 毀等。3、定義? 標(biāo)準(zhǔn)菌株是指由中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干 燥菌。? 傳代用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌株制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌種， 用于傳代及 制備工作用菌種。? 工作用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌株或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜面培養(yǎng)后， 作為日常工作使 用的菌種。? 菌種的代是指將其接種至一新鮮培養(yǎng)基上或

2、培養(yǎng)基內(nèi)， 每萌發(fā)一次即稱為一代， 從菌種 保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第 0 代。4、職責(zé)4.1 部門主管負(fù)責(zé)菌種的申購、接收、保存分發(fā)。4.2 微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)菌種的確認(rèn)、傳代、使用及銷毀。5、規(guī)程5.1 菌種的申購 部門主管根據(jù)菌種的使用情況，提出年度購買計(jì)劃（包括臨時(shí)檢驗(yàn)需要） ，填寫申購流 程，經(jīng)審批后，向中檢所菌種保藏中心或省（市）藥檢所購買凍干菌種（標(biāo)準(zhǔn)菌株）或傳 代用菌種，購買時(shí)，需確定菌種的代數(shù)，以便控制傳代代數(shù)。5.2 菌種的接收 菌種到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后， 由部門主管接收菌種， 檢查其名稱和數(shù)量， 以及每一支的完整性， 同時(shí)將菌種的所有信息，填寫在標(biāo)準(zhǔn)菌株庫存記錄上，內(nèi)容包括：名

3、稱、數(shù)量、編號(hào) （無編號(hào)者按檢定菌種的編號(hào)原則編號(hào)） 、代數(shù)、來源、接收日期、接收人等，并將其暫貯 存于48 C冰箱中，在一周內(nèi)必須完成轉(zhuǎn)種。5.3 菌種的保存5.3.1 工作用菌種的保存 工作用菌種采用斜面低溫保存法。 將菌種接種在適宜的瓊脂斜面培養(yǎng)基上， 待菌生長充分以后，轉(zhuǎn)移至48C冰箱中保存。此法僅用于工作用菌種的短期保存，并應(yīng)隨時(shí)檢查其 污染雜菌和變異等情況，發(fā)現(xiàn)異常情況，經(jīng)應(yīng)滅活處理后銷毀。保存時(shí)間根據(jù)菌種種類而 不同，細(xì)菌：每個(gè)月轉(zhuǎn)種一次；酵母菌及芽胞： 36 個(gè)月轉(zhuǎn)種一次；絲狀真菌每年轉(zhuǎn)種一 次。532傳代用菌種的保存采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟保存法。甘油冷凍管保存法用無菌

4、接種環(huán)輕輕刮取經(jīng)冷凍復(fù)溶增菌后并接種至平板或瓊脂斜面的菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦而使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝入試管中的無菌純化水中，調(diào)整菌 液濃度，使其等同于10號(hào)比濁管，向已制備好的菌懸液中加入等體積的無菌甘油(濃度 20%),即為10%甘油菌懸液，輕輕振搖，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無菌小試管，在-30C冷凍條件下保存。此甘油冷凍管為第 2代(G2)?？梢悦扛?年轉(zhuǎn)種一代。使用時(shí)，取出一 支放至室溫，轉(zhuǎn)種增菌培養(yǎng)或接種至瓊脂斜面復(fù)蘇，挑取純菌落傳代或工作用。此種方法 主要適用于需氧細(xì)菌和酵母菌的保藏(如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門 菌)。5.322液體石蠟保存法無菌液

5、體石蠟的制備：選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛 皮紙包好，在121C滅菌30分鐘，置40C恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。液體石蠟管的制備：將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)結(jié)束后，在層流臺(tái)下用無菌吸管吸取上述無菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟 高出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，置于-20C冷凍或28C冰箱中 保存。此法主要適用于霉菌、厭氧菌、放線菌、芽抱桿菌的保存(如枯草芽抱桿菌、白色 念珠菌、黑曲霉菌等)。各菌種的保存方法、條件及期限，見下表1表1傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限菌種名稱保存方法保存溫度保存期限大腸埃希菌C

6、MCC(B)44102甘油冷凍管-30C2年金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003銅綠假單胞菌(CMCC B) 10104)枯草芽抱桿菌CMCC(B)63501乙型副傷寒沙門菌CMCC(B)50094白色念珠菌CMCC(F)98001液體石蠟管2-8C1年黑曲霉菌CMCC(F)980035.4菌種的處理和保藏標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇、確認(rèn)、傳代標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球。培養(yǎng)基?改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：用于黑曲霉復(fù)蘇、復(fù)壯；? 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：用于生孢梭菌復(fù)蘇、復(fù)壯；? 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：用于金黃色葡萄球菌、 枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門 菌

7、、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復(fù)蘇、復(fù)壯；? 改良馬丁培養(yǎng)基：用于白色念珠菌復(fù)蘇、復(fù)壯標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇操作步驟： 以下操作均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。a）在安瓿的外表面用 75%的酒精擦拭并讓其自然風(fēng)干。b）用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線， 用手輕輕將安瓿掰開 （開啟安瓿時(shí)必須小心， 因?yàn)?安瓿遇熱時(shí)可能會(huì)破裂） 。c）以無菌方法用一無菌吸管從已準(zhǔn)備好的上述液體培養(yǎng)基中移取0.50.8 ml到安瓿中。d）輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解。e）用無菌吸管將安瓿內(nèi)菌液全部轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基。f）根據(jù)安瓿上所標(biāo)明的不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相應(yīng)的溫度（細(xì)菌培養(yǎng)溫度3035C,培養(yǎng)18

8、24小時(shí)；真菌培養(yǎng)溫度2328°C,培養(yǎng)35天。觀察是否渾濁，渾濁說明 菌種復(fù)蘇生長； 若不渾濁, 細(xì)菌應(yīng)延長培養(yǎng)時(shí)間至 7 天,真菌應(yīng)延長培養(yǎng)時(shí)間至 14 天, 若仍未渾濁,滅菌處理。g）若黑曲霉為菌懸液,則先放置室溫待菌懸液融化后用無菌吸管吸取管內(nèi)液體 12滴滴 在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置 2328C培養(yǎng)57天，斜面正面為黑褐 色厚絨狀,色澤均一,不應(yīng)有雜色,斜面?zhèn)让鏌o色,接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。確認(rèn)后 用含有0.05% （ ml/ml）的吐溫-80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫到無菌試管中。h）取經(jīng)復(fù)蘇后的上述細(xì)菌菌液8-10ml至液體培養(yǎng)基中按f）項(xiàng)操作對(duì)菌種進(jìn)行

9、復(fù)壯。以無 菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入100ml20%的無菌甘油混勻，12ml/管，分裝于凍存管。 每個(gè)菌種制備 10支，按順序進(jìn)行編號(hào)，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)，其余作為儲(chǔ)備管在-30C冷凍條件下保存。黑曲霉按g）項(xiàng)下方法進(jìn)行復(fù)壯， 制成復(fù)壯后的抱子懸液20ml。以無菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種菌懸液中 12ml/管加石蠟高 出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，封存于凍存管，置于-20 C冷凍或28C冰箱中保存。制備10支，按順序進(jìn)行編號(hào)，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控 制，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)。其余作為儲(chǔ)備管。 將上述制備好的凍存管逐支粘貼標(biāo)簽。 內(nèi)容 包括：菌種名

10、稱、菌種代號(hào)、編號(hào)、代次、 制備日期、制備人、貯存條件、有效期至等。i）儲(chǔ)備菌種管制備成功，儲(chǔ)存于30C，有效期為兩年。標(biāo)準(zhǔn)菌株的確認(rèn)a）用無菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物接種到胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養(yǎng)基（細(xì)菌）或沙氏葡萄 糖瓊脂培養(yǎng)基（真菌和酵母菌）平板上，或相應(yīng)的宜于該菌生長的鑒別培養(yǎng)基平板上。b）然后在3035C下培養(yǎng)3天（細(xì)菌）;2025C下培養(yǎng)5天（真菌和酵母菌）。c）培養(yǎng)后， 首先觀察其是否具有典型的菌落形態(tài)， 然后挑取生長旺盛的單一的純菌落， 劃 線于平皿培養(yǎng)基， 每種菌劃 4 個(gè)平皿， 以便收集較多的生長旺盛的典型單菌落， 進(jìn)行保存和鑒定。d）鑒定時(shí)作革蘭氏染色、鏡檢，觀察其染色特性

11、及形態(tài)特征。必要時(shí)再做生化實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一 步鑒定該菌種。e）若在該平板上發(fā)現(xiàn)有其它菌落生長，則說明操作有污染或菌種不純，應(yīng)將此被污染了 的培養(yǎng)物滅活處理，并尋找原因。應(yīng)根據(jù)其原因采取措施重新分離挑選純菌落。f）菌種的確認(rèn)結(jié)果，記錄在菌種鑒定記錄上。g）各菌種的復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件，見菌種復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件（附件2）。541.3菌種的傳代54131標(biāo)準(zhǔn)菌株的傳代a）按菌種說明書要求復(fù)溶菌粉，轉(zhuǎn)種于適宜的增菌培養(yǎng)基內(nèi)，稱第1代（G1）,復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至平板上，并在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，分離單個(gè)純種菌落，此為第2代（G2）。b）菌種確認(rèn)后，挑取平板上純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管或

12、液體石蠟管，作為保存菌種（G2），也稱傳代用菌種，同時(shí)挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支，作為工作用菌 種，此為第3代（W3）。c）將第2代（G2）菌種管冷凍保存，將工作用菌（W3）于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后用 于日常檢驗(yàn)。d）取一支冷凍保存的第2代（G2）菌種轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上。平板上的菌種制成 冷凍保存管第3代（G3）；斜面培養(yǎng)基的菌種經(jīng)適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后用作工作用 菌種，此仍為第3代（W3）。e）將第3代菌種（G3）冷凍或低溫保存，將生長、轉(zhuǎn)種后的第 2代（G2）菌種經(jīng)高溫滅 活處理后丟棄。f）按上述規(guī)程操作，直至G4轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開啟冷凍干燥菌種，重復(fù)上述規(guī)程操 作，保存和使

13、用菌種。g）當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于5時(shí)，在規(guī)定保存期限內(nèi)，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一 代工作用菌種。傳代用菌的傳代將購回?zé)o異常的傳代用菌種（一般為第 3代），根據(jù)日常檢驗(yàn)工作的需要量，挑取純 菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支，作為工作用菌種（為第4代），同時(shí)，結(jié)合菌種的代數(shù)和最長保存期 限，挑取純菌落制成濃菌懸液按“5.3.2 ”的方法制備甘油冷凍管或液體石蠟管數(shù)支，作為傳代用菌種（仍為第3代）。傳代用菌的傳代操作步驟?從冰箱冷藏室（28C）中取出菌種斜面后，應(yīng)溫室放置約 30min。?將裝有新鮮配制的培養(yǎng)基和傳代菌種一并移入生物安全柜內(nèi)，打開紫外燈照射1小時(shí)。?關(guān)閉紫外燈。酒精燈，左手握住菌種斜面，

14、將管口靠近火焰上方，右手拿接種環(huán)，將接種環(huán)燒紅約 30s，工作用菌種的傳代當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于 5 時(shí)，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。 取在冰箱48C保存的工作用菌種用普通瓊脂斜面?zhèn)鞔⑿聜鞔呐囵B(yǎng)物替代原有的 菌種，作為工作用菌種。也可取用 “甘油冷凍管保藏法或液體石蠟覆蓋保藏法 ”保存的菌種， 進(jìn)行復(fù)蘇，直接作為工作用菌種。細(xì)菌每 1 個(gè)月傳代一次；酵母菌每 2 個(gè)月傳代一次；霉 菌及芽胞每 3個(gè)月傳代一次。當(dāng)超過 5 代，須用傳代用菌種傳代。5.4.4 注意事項(xiàng)： 傳代時(shí)注意無菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丟失。同時(shí)實(shí)驗(yàn)人員也要采取有效的預(yù)防措施進(jìn)行自我保護(hù)，如工作

15、時(shí)必須穿工作服，佩帶無菌手套，實(shí)驗(yàn)完成以后消毒實(shí) 驗(yàn)進(jìn)行的區(qū)域、實(shí)驗(yàn)儀器和器具。如發(fā)生意外，如菌種泄漏或人員受傷，微生物學(xué)檢驗(yàn)人 員應(yīng)立即向部門主管報(bào)告以便及時(shí)進(jìn)行處理。5.4.5 傳代后， 按檢定菌種的編號(hào)原則編號(hào)， 并在每一支菌種管上貼上標(biāo)簽， 標(biāo)簽內(nèi)容包括： 名稱、編號(hào)、代數(shù)、傳代日期、操作人、有效期。交部門主管統(tǒng)一保管。同時(shí)及時(shí)填寫菌 種傳代記錄（附表 2）。5.5 檢定菌種的編號(hào)采用字母加數(shù)字表示：英文縮寫字母 代次 傳代日期 順序號(hào)菌種的英文縮寫字母：大腸埃希菌（E.c）、金黃色葡萄球菌（S.a）、枯草芽抱桿菌（B.s）、 白色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副傷寒沙門菌

16、（S.p）代數(shù)用一位帶有下標(biāo)數(shù)字 的字母表示： 傳代用菌種用 G 表示；工作用菌種用 W 表示；如 G3 表示傳代用菌種第 3 代； W3 表示工作用菌種第 3 代。傳代日期用 6位數(shù)字表示：年份取最后兩位數(shù)，月、日分別用兩位數(shù)。如：2015年 1月 12日傳代的第一支大腸埃希菌作為傳代用菌種的編號(hào)為 E.c-G3-120112-01。5.6 檢定菌種的保管5.6.1 檢定菌種設(shè)專人加雙鎖保管， 并對(duì)所保存的菌種建立 檢定菌種保存、 領(lǐng)用登記臺(tái)賬 （附表 3）。5.6.2 檢定菌種的定期檢查與鑒定 在菌種的保存期間，工作日應(yīng)每天檢查保存菌種冰箱的溫度、必要時(shí)檢查菌種管的塞子是否松動(dòng)，是否染雜菌

17、等，并及時(shí)填寫檢定菌種觀察記錄 （附表 4），如有異常應(yīng)及時(shí)處理。菌種在保存期內(nèi)均應(yīng)根據(jù)菌種的特性（工作用菌種每轉(zhuǎn)種兩代一次、傳代用菌種每三個(gè)月一次）檢查其菌落性狀、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態(tài)，必要時(shí)檢查生化特性等項(xiàng) 目，若發(fā)現(xiàn)與原菌種變異較大，應(yīng)重新分離、純化、鑒定、再加以保存，并做好檢定菌 種鑒定記錄（附表 5）。5.6.3 所保管的菌種，不能隨意轉(zhuǎn)讓其他單位和個(gè)人，需要時(shí)應(yīng)有單位證明和批準(zhǔn)手續(xù)方可 供應(yīng)。5.7 檢定菌種的使用0affray x mf/mi址明，說明購買菌種的名稱、菌種代數(shù)、1 S菌種和人員最好使用生物安全柜0 可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定制備方法。ft取3-g個(gè)菌落，直接用肉湯或

18、鹽制成懸液丿10號(hào)對(duì)應(yīng)濃度，然后稀釋。為接種，一般將濁度調(diào)整至麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)管6E7.Uq.048MBaCL2（1.17%W/VBaCL2 洛存O）、0.36NH2SO*1%V/V） 將二液混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存1仆上麥?zhǔn)媳葷峁芘渲品椒?目測或使用比濁儀即可。1.04 （I用前混勻。有效期為6個(gè)月。應(yīng)用時(shí),微生物學(xué)檢驗(yàn)人員根據(jù)檢驗(yàn)需要，需到部門主管領(lǐng)取工作用菌種或傳代用菌種，同時(shí) 填寫檢定菌種保存、領(lǐng)用登記臺(tái)賬。微生物學(xué)檢驗(yàn)人員從部門主管領(lǐng)取工作用菌種或傳代用菌種，用于日常檢驗(yàn)或驗(yàn)證試 驗(yàn)，使用后及時(shí)填寫檢定菌種使用登記臺(tái)賬（附表6），以便追蹤菌種使用歷史。菌液的制備：將新鮮的斜面菌

19、種培養(yǎng)物用 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為 10-100cfu/ml的菌懸液，置于04C冰箱冷藏，用于陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，使用期 24h，濃菌液放 冰箱可保存一周。5.8 .檢定菌種（廢棄）的銷毀下列情況的菌種或培養(yǎng)物或被污染的器具等，必須采用121C、45分鐘濕熱滅活處理:a新一代菌種制備成功后的上一代菌種；b、使用完后的菌種和帶有標(biāo)準(zhǔn)菌株的器具和培養(yǎng)物；c、超過有效期的菌種；d、凡被污染、變異、可疑等異常情況菌種；e、其他應(yīng)廢棄的菌種。廢棄菌種的銷毀由微生物檢驗(yàn)員提出申請(qǐng)，交部門主管批準(zhǔn)后，進(jìn)行滅活處理，并有 其他人在場監(jiān)督，并填寫廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄 （附表7）0&

20、相關(guān)文件：初始污染菌檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、純化水檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、中國藥典標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程7、注意事項(xiàng)：- . . . . .牛1、微生物檢驗(yàn)人員最好生物相關(guān)專業(yè)，要經(jīng)過培訓(xùn)，取證上崗8.2、 購買菌種要保留相關(guān)證明，最好讓藥檢所開個(gè) 數(shù)量等，把這個(gè)證明附在菌種接受記錄后8.3、菌種的傳代、使用在陽性操作間，為保護(hù)8.4、菌種常用的是10-100cfu/m|的菌懸液， 如果是細(xì)菌:可參照麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管進(jìn)行估算從孵育8-24小時(shí) 的非選擇性培養(yǎng)基.號(hào)管對(duì)應(yīng)的菌濃度為30X108cfu/ml，稀釋一般用無菌生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液）8、附表附表1檢定菌接收記錄附表2:檢定菌種傳代記錄附表3:檢定菌種保存、領(lǐng)用登記臺(tái)賬附表4:檢定菌種觀察記錄附表5:檢定菌種鑒定記錄附表6:檢定菌種使用登記臺(tái)賬附表7:廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄附表1:檢定菌接收記錄：鑒