下載本文檔
版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a的制備,質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及提取一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?, 了解和掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法的原理和操作技術(shù)。2, 了解和掌握質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原理和操作步驟。3,掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和方法,以及提取過(guò)程中各試劑的作用。二實(shí)驗(yàn)原理1,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備的原理感受態(tài)是細(xì)菌細(xì)胞具有的能接受外源DNA的一種特殊生理狀態(tài),將正在生長(zhǎng)的大腸桿菌處于0c的CaCl2低滲溶液中,會(huì)膨脹成球形,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化,此時(shí)的細(xì)胞呈現(xiàn)出感受態(tài)。2,質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原理在0c下外源DNA可吸附到感受態(tài)細(xì)胞表面,短時(shí)間的熱刺激可誘導(dǎo)細(xì)胞吸收DNA轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒DNA的大腸桿菌經(jīng)培養(yǎng)可以使質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因得
2、到表達(dá),因此,轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞可以在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上涂布生長(zhǎng),而沒(méi)有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則無(wú)法生長(zhǎng)。3,質(zhì)粒提取原理質(zhì)粒的分離是利用質(zhì)粒DNAW染色體DNA在變性與復(fù)性中的差異來(lái)達(dá)到的目的。當(dāng)菌體在NaOHffiSDS容液中裂解時(shí),蛋白質(zhì)與DN儂生變性,由于染色體DNAf質(zhì)粒DNA拓樸構(gòu)型不同,染色體DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi),而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵雖被斷裂,但兩條互補(bǔ)鏈彼此相盤(pán)繞仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入中和液后,溶液pH調(diào)恢復(fù)至中性,在高鹽濃度的情況下,染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)斗結(jié)構(gòu)并與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等形成沉淀;不同的是,質(zhì)粒DNAM性迅速而準(zhǔn)確,保持可溶狀態(tài)而留在上清
3、中。這樣,通過(guò)離心可沉淀大部分細(xì)胞碎片、染色體DNARNA蛋白質(zhì)。除去沉淀后上清中的質(zhì)??捎梅勇确鲁樘徇M(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA三儀器,材料及試劑儀器:恒溫培養(yǎng)箱,離心機(jī),恒溫?fù)u床,超凈工作臺(tái),高壓滅菌鍋,電泳儀,水浴鍋等材料:大腸桿菌DH5a菌株,大腸桿菌BL21菌株,pCM領(lǐng)粒試齊J:SolutionI,SolutionII,SolutionIII,1mol/LCaCl2,TE緩沖3夜,70%Z.醇,酚:氯仿(1:1)等。四實(shí)驗(yàn)步驟1,試劑的準(zhǔn)備SolutionI:1,量取下列溶液,置于1L燒杯中。1MTris-HCL(pH8.0)25mL20mL45mL910ml0.5MEDTA(pH8.0)
4、20%Glucose(1.11M)dH2O2,tWj溫tWj壓火菌后,4c保存。SolutionII:1,量取下列溶液,置于500mL燒杯中。10%SDS50mL2NNaOH50mL2,加滅菌水定容至500mL,充分混勻。SolutionIII:1,量取下列溶液,置于500mL燒杯中。KOAc147gCH3COOH57.5g2 ,加入300ml去離子水后攪拌溶解。3 ,加去離子水將溶液定容至500。4 ,高溫高壓火菌后,4c保存。LB培養(yǎng)基:1,稱取下列試劑,置于1L燒杯中。Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g2,加入約800ml的去離子水,充分?jǐn)嚢枞芙狻?,滴加5
5、NNaOH償00.2ml),調(diào)節(jié)pH值至7.0。4,加去離子水將培養(yǎng)基定容至1L。5 ,高溫高壓火菌后,4c保存。10XTEBuffer:1,量取下列溶液,置于1L燒杯中。1 MTris-HClBuffer(pH8.0)100ml500mMEDTA(pH8.0)20ml2 ,向燒杯中加入約800ml去離子水,均勻混合。3,將溶液定容至1L后,高溫高壓滅菌。4,室溫保存。2感受態(tài)細(xì)胞制備1)從-80C冰柜中取出一支凍存的大腸桿菌DH5a菌株,在冰塊上解凍后,于事先照過(guò)紫外的超凈臺(tái)中,用無(wú)菌接種環(huán)輕輕蘸取菌種后,在無(wú)抗平板上分區(qū)劃線,將菌種迅速放回-80C保存。平板做好標(biāo)記后,于37c培養(yǎng)約16小
6、時(shí),該細(xì)菌菌落在LB培養(yǎng)基上為1-2mm的透明的淡黃色菌落,有特殊的臭味。2)在照過(guò)紫外的超凈臺(tái)中,用滅菌的牙簽挑取單個(gè)菌落,接種入裝有1mlLB培養(yǎng)液的1.5mlEP管中,封口膜封好,于37c恒溫?fù)u床培養(yǎng)10-12小時(shí),直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。3)將該時(shí)期的細(xì)菌懸液轉(zhuǎn)接于100mlLB液體培養(yǎng)液中,37C,220rpm,震蕩擴(kuò)大培養(yǎng)約3h,測(cè)細(xì)菌OD600,以0.3-0.4之間最佳。4)將擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)物在冰上冷卻10min,轉(zhuǎn)入50ml離心管,4C,4000rmp離心10min。5)倒凈上清液,流盡殘余液體,加入10ml預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液(使細(xì)菌膨脹成球形,外源DNA分子在此
7、條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌表面)輕輕懸浮細(xì)胞,冰浴30min。6)4C,4000rmp離心10min。7)棄去上清,加入2ml預(yù)冷的15%甘油的0.1mol/L的CaCl2溶液再次懸浮細(xì)胞,即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液。8)每個(gè)1.5mlEP管分裝200科的感受態(tài)細(xì)胞,-70C保存。3轉(zhuǎn)化1)將感受態(tài)細(xì)胞從-70C拿出,放冰塊上解凍。2)在超凈工作臺(tái)中,取空質(zhì)粒1科加去離子水9d稀釋,加入到100科感受態(tài)細(xì)胞中,冰上放置30min。3)42C,熱激60s(促進(jìn)細(xì)胞對(duì)DNA的吸收),迅速再在冰上放置3min。4)加入不含Amp的LB培養(yǎng)液890聞37c振搖1h,使細(xì)菌恢復(fù)正常
8、生長(zhǎng)狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗性基因(Amp)。5)從每管中取100科培養(yǎng)液鋪至LBAmp培養(yǎng)板,并涂布均勻。6)室溫放置20min,使液體吸收,37c倒置培養(yǎng)16h。7)挑取單個(gè)菌落,接種于加有Amp的2mlLB培養(yǎng)液中,37C,220rpm,震蕩培養(yǎng)約16h。4質(zhì)粒提?。▔A裂解法)1)力口1.5ml培養(yǎng)物于離心管中,4C,12000rmp/min離心30s。2)倒去上清液,倒置于吸水紙上干燥。3)加入100科l4預(yù)冷的SolutionI重懸,用手劇烈震蕩15s。(低濃度的葡萄糖溶液使細(xì)胞處于低滲狀態(tài)而細(xì)胞膨脹;葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過(guò)程中的機(jī)械剪切作用,防止破壞DNA。EDT
9、A的作用是螯合掉Mg2+、Ca2+等二價(jià)金屬離子,防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用。Tris?Cl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍)。4)緩慢加入200科新配制的SolutionII,上下顛倒5次。(SDS的作用:破壞細(xì)胞膜;解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性。NaOH(pH>12)的作用:破壞氫鍵,使DNA分子變性)。5)加入150科用冰預(yù)冷的SolutionIII,蓋緊管口,上下顛倒10次,放冰上3-5分鐘。(:由KAc與HAc組成,是pH值為5.5的高鹽溶液。能中和溶液II的堿性,使DNA復(fù)性。K+離子會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去。溶液中的染色體DNA
10、也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS形成相互纏繞的大分子物質(zhì),很容易與小分子的質(zhì)粒DNA分離)。6)4C,12000rmp/min離心5min,吸上清400科夥到另一離心管中。7)加等量酚:氯仿(各200m(使蛋白質(zhì)變性,并使液相和有機(jī)相分離),震蕩15min。8)4C,12000rmp/min離心2min,將上清液移到另一離心管,切勿吸到下層溶液,取300dl即可。9)加入2倍體積的無(wú)水乙醇(奪取DNA外的水合層使DNA聚合而沉淀),室溫放置2min,4C,12000rmp/min離心5min,上下顛倒5次使其反應(yīng)充分。10)棄去上清,將離心管倒置于吸水紙上。11)加入1ml70%乙醇(與無(wú)水乙醇的作用類似
11、,同時(shí)可以清洗DNA,溶解與DNA一起沉淀下來(lái)的離子。),用槍頭把沉淀吸起來(lái),4C,12000rmp/min離心2min。12)棄上清,倒置于吸水紙上。13)各加入1科lRNase(降解RNA污染物),30科lTE14)封口膜封上,37c孵育1h。5瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果用微量分光光度計(jì)測(cè)質(zhì)粒濃度,濃度在2000ng/科時(shí)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。1)制備瓊脂糖凝膠:稱取0.8g瓊脂糖,加入100ml1>TAE緩沖液,置微波爐中加熱至完全融化,取出搖勻,即為瓊脂糖凝膠液,冷卻至50-60C后倒入到放有梳子的有機(jī)玻璃內(nèi)槽中,形成一層均勻的膠面,凝固后,拔出梳子,放入加有電泳緩沖液的電泳槽中。2)加樣:第一孔加入6IMarker其余幾孔加入混有l(wèi)oadingbuffer的質(zhì)粒。3)電流80mA,電壓110V,電泳40min。4)電泳結(jié)束后看結(jié)果。五結(jié)果分析M12345678910M:2000DNAmarker2,5,8孔為轉(zhuǎn)化入BL21細(xì)菌的質(zhì)粒。1,3,4,6,7,9,10孔為轉(zhuǎn)化入DH5a細(xì)胞的質(zhì)粒。正常質(zhì)粒是閉合的雙鏈DNA。在提取過(guò)程或電泳
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 部編版二年級(jí)語(yǔ)文上冊(cè)期末模擬測(cè)試卷(一)含答案
- 血管源性水腫的臨床護(hù)理
- 數(shù)學(xué)上冊(cè)可能性課件西師大版
- 腸梗阻的護(hù)理
- 孕期腹部損傷的健康宣教
- 急性肺膿腫的臨床護(hù)理
- 舌下神經(jīng)損傷的臨床護(hù)理
- 甲溝炎的臨床護(hù)理
- 粘連性中耳炎的健康宣教
- JJF(陜) 088-2022 三維運(yùn)輸記錄儀校準(zhǔn)規(guī)范
- 2024年校社聯(lián)副主席競(jìng)選演講稿模版(3篇)
- 上海市縣(2024年-2025年小學(xué)六年級(jí)語(yǔ)文)部編版競(jìng)賽題(上學(xué)期)試卷及答案
- 試論中國(guó)特色社會(huì)主義道路的優(yōu)勢(shì)
- 2024年小紅書(shū)初級(jí)營(yíng)銷師題庫(kù)
- 西華師范大學(xué)《中國(guó)史學(xué)史》2023-2024學(xué)年第一學(xué)期期末試卷
- 煤炭行業(yè)綠色供應(yīng)鏈建設(shè)
- “讀”“解”“品”“拓”:小學(xué)文言文教學(xué)的四個(gè)維度
- 2024年工業(yè)和信息化部工業(yè)文化發(fā)展中心招聘高校畢業(yè)生3人易考易錯(cuò)模擬試題(共500題)試卷后附參考答案
- 公關(guān)人員勞動(dòng)合同三篇
- 急救知識(shí)與技術(shù)智慧樹(shù)知到期末考試答案章節(jié)答案2024年新疆巴音郭楞蒙古自治州衛(wèi)生學(xué)校
- 文藝復(fù)興經(jīng)典名著選讀智慧樹(shù)知到期末考試答案章節(jié)答案2024年北京大學(xué)
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論