野外采樣實驗

1、野外取樣實驗方案2016041. 實驗?zāi)康难芯孔匀粭l件下東南景天不同生育期間，其內(nèi)生菌多樣性的動態(tài)變化。2. 實驗設(shè)計選擇在東南景天的苗期、開花期、成熟期，于浙江衢州鉛鋅礦山采集具有代表性5個樣點的超累積生態(tài)型東南景天，混合為一個樣品并將其連同根際土壤放入無菌的塑料箱中，地上部裸露于袋外，保持鮮活狀態(tài)，帶回實驗室，然后進行后續(xù)處理。3. 實驗內(nèi)容（ 1） powersoil試劑盒提取根際土壤菌DNA（ 2） 可培養(yǎng)植物內(nèi)生菌別離（ 3） CTAB法提取植物內(nèi)生菌DNA（ 4） 植物重金屬含量測定（ 5） 土壤理化性質(zhì)測定實驗一powersoil試劑盒提取根際土壤菌DNA1. 實驗?zāi)康膒ower

2、soil試劑盒提取根際土壤菌DNA,保存，待之后送檢2. 實驗步驟（ 1） 獲取東南景天根際土壤小心把東南景天從土壤中取出，用鑷子夾取粘附在根表的土壤。每個樣點夾取約3g土壤，取1g立即提取DNA,余下裝入封口袋，？-20C保存。取出的東南景天外表洗凈，晾干。測量鮮重后，殺青，烘干。測量干重后，研磨，待測。植物重金屬含量，3個重復(fù)，每個重復(fù)，共需要植物根莖葉鮮重各5g2選取MobioPowerSoilDNAIsolationKitMOBIOLaboratories,Inc,Carlsbad,CA試劑盒提取土壤樣品DNA。具體操作步驟如下：1稱取約0.25g土壤樣品，放入研磨珠套管PowerBe

3、adTubeS,渦旋混勻。2套管中加入60屋C1容液裂解緩沖液，顛倒數(shù)次，渦旋5s混勻。3將套管放入水平渦旋振蕩儀，在最大速度振蕩10min。4取出套管，在室溫下10000為離心30s。5把上清液約400500門轉(zhuǎn)移到新的2mL離心管。6力口250屋C2容液抑制物去除液至離心管中，渦旋5s,4c下放置5min,在室溫下10000為離心1min。7將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的2mL離心管，總體積不超過600gl同時防止吸出沉淀物。8加200屋C3§液抑制物去除液至離心管中，渦旋混勻，4c下放置5min,在室溫下10000為離心1min。9將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的2mL離心管，總體積不超過750

4、gl同時防止吸出沉淀物。10加1.2mLC4溶液高鹽溶液至離心管中，渦旋混勻，從離心管中抽取約650仙溶液至離心過濾管SpinFilter。11在室溫下10000聞離心1min,取出管中過濾柱，棄去液體，過濾柱放回管中。12力口入第10步離心管中約650娼容液，重復(fù)第(11)步操作，力口入第10步離心管中剩余的溶液，重復(fù)第11步操作。13力口500屋C5§液乙醇淋洗緩沖液至離心過濾管中，在室溫下10000溝離心30s,棄去管中液體。14在室溫下10000為離心1min。15取出過濾柱小心放入新的2mL離心管中，防止任何C5溶液濺到過濾柱上。16加入60屋C6§液DNA洗脫液

5、或無菌超純水至過濾柱白色薄膜中，在室溫下10000/離心30s。17棄去離心柱，提取完成。分裝-20保存，待下一步應(yīng)用。實驗二可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的別離純化保存1. 實驗?zāi)康?別離東南景天內(nèi)生菌，記錄菌落數(shù)，菌落種類數(shù)，菌落形態(tài)，優(yōu)勢菌菌落數(shù)。2菌落純化，保存菌種。2. 儀器和試劑內(nèi)生菌別離1需要干熱滅菌的儀器培養(yǎng)皿150個其中在15個培養(yǎng)皿中放入濾紙150mL燒杯75個研砵15個（ 2） 需要高溫濕熱滅菌的儀器R2A培養(yǎng)基3000mL,分裝至15個250mL三角瓶磷酸緩沖溶液150mL,至于200mL滅菌瓶試管+蒸餾水2*3*5=30支試管2000mL蒸餾水，裝入1000mL三角瓶1mL槍頭兩盒其

6、中30個需要剪缺口錫箔紙50張（ 3） 其他試劑99%酒精、35%雙氧水、3%次氯酸鈉內(nèi)生菌純化保存（ 4） 要干熱滅菌的儀器培養(yǎng)皿50個（ 5） 要高溫濕熱滅菌的儀器50%甘油150mL約150個菌種用量,倒入200mL滅菌瓶。150個凍存管，用保鮮袋包裝。R2A固體培養(yǎng)基1000mL,分裝至5個250mL三角瓶。R2A液體培養(yǎng)基1000mL,分裝至50個50mL三角瓶。3.實驗步驟3.1 植物樣品外表消毒滅菌燒杯：15個植物樣5=75個制作2000mL無菌水。分別取4g植物樣在自來水下沖洗99%酒精1min35%雙氧水+3%次氯酸鈉30min無菌水沖洗三次。取g植物樣用錫箔紙包裝，做3個重

7、復(fù)，液氮速凍，-80C保存。3.2 可培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)及純化保存1細(xì)菌的培養(yǎng)基配方R2A培養(yǎng)基1000ml蒸儲水，酵母粉、胰蛋白陳、酪蛋白氨基酸、葡萄糖、可溶性淀粉、KH2P04、MgS047H2。：、丙酮酸鈉，配制R2A培養(yǎng)基3000mL,分裝至15個250mL三角瓶，高溫濕熱滅菌121c,20min。2磷酸緩沖溶液滅菌處理磷酸緩沖溶液：氯化鈉；2P。4；2HPO4;100ml蒸儲水；PH值。配制磷酸緩沖溶液150mL，至于200mL滅菌瓶，高溫濕熱滅菌121c,20min。3研磨把消毒后的葉、莖和根，分別放在滅菌的研缽中，研磨成汁，加入3ml的磷酸緩沖溶液，攪拌均勻，靜置10分鐘，再攪拌。4

8、稀釋2*3*5=30支試管從研缽中取1ml的溶液分別稀釋10倍、100倍5涂布分別從原液、10倍、100倍的溶液中取200微升到細(xì)菌的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每個梯度做3個平行。用酒精浸泡，燒的時間長一些，葉、莖，考慮用不同的三角刮刀15個植物樣*3個濃度*3個重復(fù)=135個平板6平板培養(yǎng)一星期后，計數(shù)，并記錄其菌落形態(tài)。同時，根據(jù)菌落特征。7菌種純化保存約50個菌種用量配制50%甘油150mL約150個菌種用量，倒入200mL滅菌瓶。準(zhǔn)備150個凍存管，用保鮮袋包裝。配制R2A固體培養(yǎng)基1000mL,分裝至5個250mL三角瓶，配制R2A液體培養(yǎng)基1000mL,分裝至50個50mL三角瓶。以上儀器試劑

9、使用高溫濕熱滅菌121c,20min。挑選不同的菌落到新的培養(yǎng)基，純化1次。挑單個菌落到R2A液體培養(yǎng)基中，30C、160r/min,搖床12-16小時，搖到對數(shù)期或?qū)?shù)末期，測0D值，取700uL菌液并加300uL50%甘油于甘油管中,保存，每個菌保存3個甘油管。實驗三CTAB法提取植物內(nèi)生菌DNA1. 實驗?zāi)康睦肅TAB法提取植物內(nèi)生菌DNA,保存待測。2. 實驗原理十六烷基三甲基澳化錢(hexadecyltrimethylammoniumbromide,CTAB)是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中(>0.7mol/LNaCl

10、)，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過有機溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸別離出來。3. 實驗材料實驗分3批完成1液氮；2研缽6個，干熱滅菌；3CTABDNA提取液：a. 100mMTris-HCl(pH8.0)提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；b. 20mMEDTA(pH8.0)螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；c. 1.4MNaCl提供一個高鹽環(huán)境，使DNA蛋白復(fù)合物DNP充分溶解；d. 2%(w/v)CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于別離；e. 1%PV

11、P40,000(polyvinylpyrrolidone)(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。將上述試劑混合后，滅菌20分鐘，常溫保存；4酚氯仿異戊醇按照酚:氯仿:異戊醇=48:48:4的比例配置蛋白質(zhì)變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子外表又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點：1.有效變性蛋白質(zhì)；2抑制了DNase的降解作用。缺點：1.能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly(A)RN

12、A。2.不能完全抑制RNase的活性；5) 氯仿異戊醇按照氯仿:異戊醇=96:4的比例配置。能克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚酚易溶于氯仿中；6) 異丙醇沉淀DNA；7) 70%的酒精清洗DNA；8) 2mL與1.5mL的離心管各18個，高溫濕熱滅菌。4. 實驗步驟1收集大約100mg的植物樣品，在使用前保存于-80。2將樣品放于研缽中，配合液氮，快速將樣品磨成粉末狀，將粉末盡量收集于一個2mL的離心管中。3將步驟2中的離心管中加入0.9mLCTAB，漩渦震蕩均勻，于65中水浴20-30分鐘。4水浴后，加入0.9mL氯仿異戊醇，上下翻轉(zhuǎn)均勻，12000

13、rpm離心8分鐘。5將離心后上清液510小口轉(zhuǎn)至另一干凈的1.5mL離心管中，加入340L上清液體積的2/3異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)均勻至有沉淀產(chǎn)生，12000rpm離心8分鐘。6離心后棄掉液體，用0.7mL70%的酒精清洗，12000rpm離心2分鐘，小心地棄掉廢液，防止將DNA倒出。7重復(fù)步驟6。8于通風(fēng)櫥中將酒精晾干，至透明狀即可。9加入50小灰菌水或TE水pH8.0TE可延長DNA保存時間,將DNA于-20、-80長期保存。5. 注意事項：1)實驗前應(yīng)先預(yù)熱水浴鍋。3. 2)在對DNA質(zhì)量要求不是特別高的情況下，用氯仿異戊醇即可，不用酚氯仿異戊醇。實驗四植物重金屬含量及土壤理化性質(zhì)測定1. 實驗?zāi)康幕匦：蟊４嬷参飿蛹巴寥溃罄m(xù)檢測。2. 實驗步驟在獲取根際土壤后，將取出的東南景天外表洗凈，晾干。測量鮮重后，殺青，烘干。測量干重后，研磨，待測。植物重金屬含量，3個重復(fù)，每個重復(fù)，共需要植物根莖葉鮮重各5g。內(nèi)生菌別離試驗后，取出土壤約100g,風(fēng)干，研磨，過20目篩，保存待測