抗體的制備方法與原理

1、抗體的制備方法與原理一、抗血清的制備有了質(zhì)量好的抗原，還必須選擇適當(dāng)?shù)拿庖咄緩?，才能產(chǎn)生質(zhì)量好（特異性強(qiáng)和效價(jià)高）的抗體。（一）用于免疫的動(dòng)物作免疫用的動(dòng)物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實(shí)驗(yàn)室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動(dòng)物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量，如一般制備抗球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動(dòng)物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動(dòng)物應(yīng)適齡，健壯，無感染性疾患，最好為/雄性，此外還需十分注意動(dòng)物的飼養(yǎng)，以消除動(dòng)物的個(gè)體差異以及在免疫過程中死亡的影響。若用兔，最好用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2 3kg 為宜。r-免疫（

2、二）免疫途徑免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)注射 0.1ml 左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。（三）佐劑由于不同個(gè)體對(duì)同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此常常在注射抗原的同時(shí)，加入能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。佐劑除了延長抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn) T 細(xì)胞與 B 細(xì)胞的相互作用，

3、從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。常用的佐劑是福氏佐劑（油的比例，視需要可調(diào)整為卡介苗就成為完全佐劑。Freundadjuvant ）, 其成分通常是羊毛脂1 份、石臘油5 份，羊毛脂與石臘1 ：29 （V/V ），這是不完全福氏佐劑，在每毫升不完全佐劑加入1 20mg配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4下保存?zhèn)溆?。免疫前取等容積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗3 4mg/ml 或不加），加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，滴于冰水上5 10min 內(nèi)完

4、全不擴(kuò)散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。（四）免疫方法抗原劑量，首次劑量為300 500g，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量為1/4 左右。每 2 3 周加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全佐劑，首次免疫時(shí)皮下注射百日咳疫苗0.5ml ，加強(qiáng)免疫時(shí)不必注射百日咳疫苗。在第 2 次加強(qiáng)免疫后2 周，從耳緣靜脈取2 3ml 血，制備血清，檢測(cè)抗體效價(jià)（見后）。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià)，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時(shí)為止（圖 2-3 ）。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，即可放血制備抗血清

5、。圖 2-3抗體反應(yīng)（五）抗血清的采集與保存家兔是最常用以產(chǎn)生抗體的動(dòng)物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動(dòng)物以頸靜脈、動(dòng)脈取血，鼠等小動(dòng)物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血，一是頸動(dòng)脈入血，也可心臟采血。取動(dòng)脈或靜脈放血時(shí)，將兔放入一個(gè)特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s 后，耳血管擴(kuò)張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開動(dòng)脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30 40ml 。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動(dòng)脈放血時(shí)，將兔仰

6、臥，固定于兔臺(tái)，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動(dòng)脈，插管，放血。放血過程中要嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行。收集的血液置于室溫下 1h 左右，凝固后，置 4下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心， 0min 。在無菌條件，吸出血清，分裝（ 0.05 0.2ml ），貯于 -40 以下冰箱，或凍干后貯存于4000rpm,14。C 冰箱保存。（六）抗血清質(zhì)量的評(píng)價(jià)在免疫期間，不僅各個(gè)不同的動(dòng)物，而且同一動(dòng)物在不同的時(shí)間內(nèi)抗血清效價(jià)、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測(cè)試。只有在對(duì)抗血清的效價(jià)、特異性、親合力等方面作徹底的評(píng)價(jià)后，才可使用所取得的抗血清。1效價(jià)抗血清的效價(jià)，就是指血清中所含抗體的濃度

7、或含量。效價(jià)測(cè)定的方法常用的是放射免疫法，此法對(duì)所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴(kuò)散等方法測(cè)定。前者測(cè)定的效價(jià)極為精確。而后者則粗糙得多。（ 1）放射免疫法：以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原混合，孵育24h 后，測(cè)定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50% 的血清稀度和為效價(jià)。如某抗血清的結(jié)合率為50% 時(shí)的稀釋度為1 ：15000 ，則該血清的效價(jià)就是 1 ：15000 ?？寡宓男r(jià)，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時(shí)間，所用稀釋液的成分及其pH 等因素的影響，在工作中必須引起注意。（測(cè)定方法見第8 章）（ 2 ）雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗

8、體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。球脂板的制備： 100mlpH7.1的磷酸鹽緩沖液加到15g 的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65 左右時(shí)， 加入疊氮鈉 （ NaN3 ），使其在溶液中的濃度為0.1% 。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm 厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔（圖2-4）。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50l），周圍各孔內(nèi)分別加入50l 1：2、 1： 4 、1： 8、 1：16 、1 ： 32 及不稀釋的抗血清，37下孵育24h ，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度（圖2

9、-5）。圖 2-4 雙向擴(kuò)散模型圖 2-5 免疫擴(kuò)散試驗(yàn)2特異性測(cè)定抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對(duì)相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識(shí)別能力。特異性好就是抗血清的識(shí)別能力強(qiáng)。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的。交叉反應(yīng)率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線來判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，計(jì)算各自的結(jié)合率（ B/T 或 B/B0 ），求出各自在 IC50 時(shí)的濃度，按下列公式計(jì)算交叉反應(yīng)率。S=y/Z×100%S ：交叉反應(yīng)率，y：IC50 時(shí)抗原濃度， Z ：IC50 時(shí)近似抗原物質(zhì)的濃度。如某抗原的IC50 濃度為 9

10、0Pg/ 管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50 濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清與其它抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。3親合力在免疫學(xué)中，親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度?？贵w與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會(huì)迅速解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K 表示。 K 的單位是升 /摩爾（ L/mol ）。在 RIA 中， K 是該抗血清能達(dá)到的最小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/H ， H 是最小檢出量，通常， K 的范圍在 108 1012L/mol之

11、間，也有高達(dá)1014L/mol的。計(jì)算親合常數(shù)的方法20 余種，計(jì)算出的K 都不能真實(shí)反映實(shí)驗(yàn)情況，只能作為參考。（七）免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施有時(shí)不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之。（1 ）免疫動(dòng)物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動(dòng)物的種屬或品系，或擴(kuò)大免疫動(dòng)物的數(shù)量。（ 2）抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號(hào)，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法。（ 3 ）制備的免疫原是否符合要求， 可從偶聯(lián)劑， 載體、抗原或載體的比例、 反應(yīng)時(shí)間等多方面去考慮，并加以改進(jìn)。（ 4 ）所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強(qiáng)乳

12、化。（ 5 ）免疫的方法、劑量，加強(qiáng)免疫的間隔時(shí)間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。（ 6 ）動(dòng)物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動(dòng)物的健康情況是否良好等。二、單克隆抗體的制備1975 年 Kohler 和 Milstein 發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進(jìn)入了一個(gè)高度精確的新紀(jì)元。免疫細(xì)胞化學(xué)的技術(shù)關(guān)鍵之一是制備特異性強(qiáng)、親合力大、滴度高的特異性抗體，由于每種抗原都有幾個(gè)抗原決定簇，用它免疫動(dòng)物將產(chǎn)生對(duì)各個(gè)決定簇的抗

13、體，即多克隆抗體。單克隆抗體則是由一個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞融合而形成的雜交廇細(xì)胞經(jīng)無性繁殖而來的細(xì)胞群所產(chǎn)生的，所以它的免疫球蛋白屬同一類型，質(zhì)地純一，而且它是針對(duì)某一抗原決定簇的，因此特異性強(qiáng)，親合性也一致。單克隆抗體（ McAb ）的特性和常規(guī)血清抗體的特性比較見2-3。表 2 3 單克隆抗體（ McAb ）和常規(guī)免疫血清抗體的特性比較項(xiàng)目常規(guī)免疫血清抗體McAb抗體產(chǎn)生細(xì)胞多克隆性單克隆性抗體的結(jié)合力特異性識(shí)別多種抗原決定簇特異性識(shí)別單一抗原決定簇免疫球蛋白類別及亞類不均一性，質(zhì)地混雜同一類屬，質(zhì)地純一特異性與親合力批與批之間不同特異性高，抗體均一0.5 5.0mg/ml( 小

14、鼠腹水 )有效抗體含量0.01 0.1mg/ml （小鼠腹水）0.5 10.0 g/ml（培養(yǎng)物上清液）用于常規(guī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)可用單抗組合應(yīng)用抗原抗體形成格子結(jié)構(gòu) （沉淀容易形成一般難形成反應(yīng)）抗體混雜，形成2 分子反應(yīng)困難，抗原抗體反應(yīng)可形成 2 分子反應(yīng)，可逆不可逆單克隆抗體的制備方法如下。（一）動(dòng)物的選擇與免疫1動(dòng)物的選擇純種 BALB/C 小鼠，較溫順，離窩的活動(dòng)范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實(shí)驗(yàn)室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室多選用純種BALA/C 小鼠。2免疫方案選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb 至關(guān)重要。一般在融合前兩個(gè)月左右根據(jù)

15、確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。（ 1 ）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。初次免疫抗原 1 50g加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射（一般0.8 1ml,0.2ml/ 點(diǎn)）3 周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip 劑量不宜超過0.5ml ）3 周后第三次免疫劑量同一，不加佐劑，ip（5 7 天后采血測(cè)其效價(jià)） 23 周加強(qiáng)免疫，劑量50 500g為宜， ip 或 iv（靜脈內(nèi)注射） 3 天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷

16、有所更新，如：將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)性。（ 2 ）顆?？乖庖咝詮?qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時(shí)要求抗原量為 1 2×107 個(gè)細(xì)胞。初次免疫1×107/0.5mlip2 3 周后第二次免疫1×107/0.5mlip3 周后加強(qiáng)免疫（融合前三天）1×107/0.5mlip 或 iv取脾融合（二）細(xì)胞融合1細(xì)胞融合前準(zhǔn)備（ 1 ）骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨

17、髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb 。常用的骨髓瘤細(xì)胞系見表2-4。表 2-4 用于融合試驗(yàn)的主要骨髓瘤細(xì)胞系Ig 鏈名 稱來 源耐受藥物H LBALB/C骨髓瘤P3/X63-Ag8(X63)8- 氮鳥嘌呤r1 KMOPC-21P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)P3/X63-Ag88- 氮鳥嘌呤 P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)P3/X63-Ag88- 氮鳥嘌呤 K （不分泌型）（ X63×BALB/C脾 細(xì)P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)8- 氮鳥嘌呤 胞）雜交瘤（ X63

18、15;BALB/C 脾 細(xì)SP2/0-Ag14(SP2/0)8- 氮鳥嘌呤 胞）雜交瘤F0BALB/C骨髓瘤8- 氮鳥嘌呤 S194/5.XXO.BU.1P3/X63-Ag85- 溴脫氧尿嘧啶核苷 BALB/C骨髓瘤MPC11-45.6TG1.76- 巰鳥嘌呤r2bKMPC-11210.RCY3.Ag1.2.3LOU 大鼠骨髓瘤 R2108- 氮鳥嘌呤KGM15006TG-A12人骨髓瘤 GM15006- 巰鳥嘌呤r1KU-266AR人骨髓瘤 U-2668- 氮鳥嘌呤骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如 RPMI1640 ，DMEM 培養(yǎng)基。 小牛血清的濃度一般在10% 20% ，細(xì)胞濃度以1

19、04 5×105/ml 為宜，最大濃度不得超過106/ml 。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長的中期時(shí)，可按1：3 1：10 的比例傳代。每35 天傳代一次。細(xì)胞在傳代過程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8- 氮鳥嘌呤進(jìn)行處理，使生存的細(xì)胞對(duì)HAT 呈均一的敏感性。（2 ）飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備McAb 的過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞

20、。也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3 經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2×104 或 105 細(xì)胞 / 孔。2細(xì)胞融合的步驟（1 ）制備飼養(yǎng)細(xì)胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C 小鼠， 6 10 周拉頸處死，浸泡在75% 酒精內(nèi)， 3 5min用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜用無菌注射器注入5 6ml 預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管）反復(fù)沖洗，吸出沖洗液沖洗液放入10ml 離心管， 1200rpm/ 分離 5 6min用 20% 小牛血清（ NCS ）或胎牛血清（FCS ）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/ml加入 96 孔板

21、， 100l/孔放入 37 。 c CO2 孵箱培養(yǎng)（2 ）制備免疫脾細(xì)胞最后一次加強(qiáng)免疫3 天后小鼠拉頸處死無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2 次計(jì)數(shù)取 108 脾淋巴細(xì)胞懸液備用（3 ）制備骨髓瘤細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心用無血清培養(yǎng)液洗 2 次計(jì)數(shù)，取得× 107 細(xì)胞備用（4 ）融合將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1 ：10 或 1 ：5 的比例混合在一起，在50ml 離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗 1 次，離心， 1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG ）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)。90s 內(nèi)加

22、入 37 預(yù)溫的1ml 45%PEG （分子量 4000 ）溶液，邊加邊輕微搖動(dòng)。 37 水浴作用90s 。加 37 。 C 預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG 作用，每隔2min 分別加入1ml 、2ml 、3ml 、 4ml 、5ml和 6ml 。離心， 800rpm,6min 。充上清，用含20% 小牛血清HAT 選擇培養(yǎng)液重懸。將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96 孔板內(nèi)，每孔加 100l。一般一個(gè)免疫脾臟可接種4塊96孔板。將培養(yǎng)板置37 、 5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（三）選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測(cè)1 HAT 選擇雜交瘤細(xì)胞 脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng) PEG 處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只

23、有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。 在 HAT 選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)， 由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶， 故不能生長繁殖， 而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在 HAT 選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。在用 HAT 選擇培養(yǎng)1 2 天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，3 4 天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落，HAT 選擇培養(yǎng)液維持710 天后應(yīng)換用 HT 培養(yǎng)液，再維持 2 周，改用一般培養(yǎng)液。 在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時(shí)，即可開始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每 2 3天換一半培養(yǎng)液。2抗體的檢測(cè)檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性

24、質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有：（1）放射免疫測(cè)定（RIA ）可用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb 的檢測(cè)。（ 2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA ）可用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等 McAb 的檢測(cè)。（ 3）免疫熒光試驗(yàn)適合于細(xì)胞表面抗原的 McAb 的檢測(cè)。（ 4）其它如間接血凝試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗(yàn)等。（四）雜交瘤的克隆化雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。因?yàn)榻?jīng)過 HAT 篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、所需要

25、的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開就需要克隆化。克隆化的原則是，對(duì)于檢測(cè)抗體陽性的雜交克隆盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力?？寺』姆椒ê芏啵畛Ｓ玫氖怯邢尴♂尫ê蛙洯傊桨宸?。1有限稀釋法克?。? ）克隆前 1 天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合）。2）將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計(jì)數(shù)。（3 ）調(diào)整細(xì)胞為3 10 個(gè)細(xì)胞

26、/ml 。（4 ）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞100l。孵育于 37 、 5%CO2 孵箱中 。（ 5 ）在第 7 天換液，以后每 23 天換液 1 次。（ 6 ）89 天可見 細(xì)胞克隆形成，及時(shí)檢測(cè)抗體活性。（ 7 ）將陽性孔的細(xì)胞移至 24 孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。（ 8 ）每個(gè)克隆應(yīng)盡快凍存。2軟瓊脂培養(yǎng)法克?。? ）軟瓊脂的配制：含有20%NCS （小牛血清）的2 倍濃縮的RPMI1640 。1% 瓊脂水溶液：高壓滅菌，42 預(yù)熱。0.5% 瓊脂：由1 份 1%瓊脂加 1 份含 20% 小牛血清的2 倍濃縮的 RPMI1640配制而成。置42 保溫。（ 2 ）用上述 0

27、.5% 瓊脂液（含有飼養(yǎng)細(xì)胞） 15ml 傾注于直徑為 9cm 的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。（ 3 ）按 100/ml ，500/ml 或 5000/ml 等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。（ 4 ）1ml 0.5% 瓊脂液（ 42預(yù)熱）在室溫中分別與 1ml 不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。（5 ）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min ，使其凝固，孵育于37 、 5%CO2 孵箱中。（ 6 ）4 5 天 后即可見針尖大小白色克隆，7 10 天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24 孔中進(jìn)行培養(yǎng)。（ 7 ）檢測(cè)抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。（五）雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇1雜交瘤細(xì)胞的凍存

28、及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊]有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106 以上，但對(duì)原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在 24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔底時(shí)， 一孔就可以裝一支安瓿凍存。細(xì)胞凍存液： 50% 小牛血清； 40% 不完全培養(yǎng)液；10%DMSO （二甲基亞砜）。凍存液最好預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降至 0后放入

29、-70 超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。 也可用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。 凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇， 檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長時(shí)間。2細(xì)胞復(fù)蘇方法將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37 水浴中，在1min內(nèi)使凍存的細(xì)胞解凍，將細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37、 5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞形成集落時(shí)，檢測(cè)抗體活性。（六）單克隆抗體的大量生產(chǎn)大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：（ 1 ）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為 10 60g/ml, 如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。（ 2 ）體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。實(shí)體瘤法： 對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按1 3×107/ml 接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml