畢赤酵母表達系統(tǒng)簡介

1、巴斯德畢赤醉母及啟動子1.1 畢赤酵母表達系統(tǒng)簡介隨著蛋白異源表達的飛速發(fā)展，越來越多的表達系統(tǒng)被建立并得到應用。酵母作為單細胞真核生物，因具有比較完備的基因表達調控機制和對表達產物的加工修飾能力，仍表現(xiàn)出不可比擬的優(yōu)勢。以甲醇營養(yǎng)型酵母（Methylotrophicyeast）-畢赤酵母為代表的第二代酵母表達系統(tǒng)，是近年來被公認的最有效的外源蛋白表達系統(tǒng)之一，已有多種外源蛋白在該宿主系統(tǒng)中獲得了成功表達1。作為生產外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各種不同功能的表達載體，已經得到廣泛的應用。表達的蛋白質包括酶、膜蛋白、抗原、抗體和調節(jié)蛋白等2,3。畢赤酵母（Pichiapastori§表

2、達系統(tǒng)是近年來發(fā)展迅速、應用廣泛的一種真表達系統(tǒng)。它是甲醇營養(yǎng)型酵母菌，有兩個乙醇氧化酶（alcoholoxidase,Aox）碼基因AOX1和AOX2,兩者序列相似，AOX1基因嚴格受甲醇誘導和調控。當甲醇為唯一碳源時，AOX1啟動子可被甲醇誘導，啟動乙醇氧化酶的表達，從而用甲醇進行代謝4。含AOX1啟動子的質?？捎脕泶龠M編碼外源蛋白的目的因的表達。隨著Invitrogen公司開發(fā)的一系列畢赤酵母表達試劑盒的應用，目前用該統(tǒng)已成功表達出了數(shù)以千計的來自細菌、真菌、原生動物、植物、無脊椎動物、包括人在內的脊椎動物以及病毒等的具有生物學功能的外源蛋白或蛋白結構叵6o1.1.1 P.Pastori

3、sS達載體及其元件由于畢赤酵母沒有穩(wěn)定的附加質粒，表達載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，外源基因表達框架整合于染色體中以實現(xiàn)外源基因的表達整合表達的優(yōu)點在于保持外源基因穩(wěn)定性并可產生多拷貝基因。典型的畢赤氏酵母表達載體含有醇氧化酶基因的調控序列，主要的結構包括：5AOX1啟動子片段、多克隆位點（MCS）、轉錄終止和polyA形成基因序列（TT）、篩選標記（His4或Zeocin）、3AOX1基因片段，作為一個能在大腸桿菌中繁殖擴增的穿梭質粒，它還有部分pBR322質?；駽OLE1序列。如果是分泌型表達載體，在多克隆位點的前面，外源基因的5'端和啟動子的3端之間插人了分泌作用的信號肽序列。

4、在這個分泌信號的引導下，外源蛋白在內質網和高爾基體中經修飾和加工后能夠由胞內轉移至胞外，將成熟的蛋白質分泌到細胞外。目前所采用的表達體均為穿梭質粒，先在大腸桿菌保存、復制、擴增，然后線性化后被導入宿主母細胞。常用的表達載體包括胞內表達載體及分泌表達載體如下表：表1常用表達載體及其選擇標記pPICZA,B,CAOX1Zeocin胞內表達pPIC6A,B,CAOX1blasticidinPGAPZA,B,CGAPZeocinpPIC3.5KAOX1His4kanmycinampicillinPAO815AOX1His4ampicillinPFLDFLDZeocinampicillinpPICZaA

5、,B,CAOX1ZeocinpPIC6aA,B,CAOX1blasticidin分泌表達PGAPZaA,B,CGAPZeocinpPIC9kAOX1His4kanmycinampicillinpFLDaFLDZeocinampicillin1.1.2 畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)勢自從1987年Cregg等首次用巴斯彳惠畢赤酵母(Pichiapastoris)作為宿主表達外源蛋白以來，作為一種新的高效的表達系統(tǒng)，畢赤酵母越來越引起人們的重視，到1995年，已有四十多種外源蛋白在該宿主菌中獲得表達。而最近幾年每年報道的在畢赤酵母中表達的外源基因就有幾十種，且一年比一年多，它除了具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖

6、快、便于基因工程操作和高密度發(fā)酵等特性之外，同釀酒酵母等傳統(tǒng)真核表達系統(tǒng)相比，它還具有以下的優(yōu)勢：(1)含有特有的強有力的AOX(醇氧化酶基因)啟動子，用甲醇可嚴格地調控外源基因的表達；(2)培養(yǎng)成本低，產物易分離。畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基十分廉價，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無機鹽，培養(yǎng)基中不含蛋白，有利于下游產品分離純化；而釀酒酵母所用誘導物一般為價格較高的半乳糖；(3)外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定。外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，不易丟失并能夠到高表達菌株；(4)作為真核表達系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結構，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。1.2 A

7、OX啟動子序列分析現(xiàn)狀啟動子是基因表達調控的順式元件，也是基因工程表達載體的一個重要元件。啟動子在轉錄水平上的重要作用，不僅決定了基因的表達水平，也決定了基因表達的時空順序7網，可以說啟動子活性的高低在很大程度上影響著基因表達最終產物的表達水平。所以找到一個轉錄啟動功能較好的啟動子，對于外源蛋白高效表達的研究具有重要的意義。目前，已有不少的啟動子被克隆和功能鑒定90新型疫苗主要包括亞單位疫苗、基因缺失疫苗、核算疫苗、重組活載體疫苗等，盡管大多數(shù)被認為較為安全，但往往都需要免疫刺激性強的佐劑來提高免疫效果。菌蛻疫苗可通過發(fā)酵大量生產且無需加入佐劑即可獲得堅強的免疫效果。目前，畢赤酵母表達系統(tǒng)中較

8、常用的表達載體有兩類10:種是分泌型表達載體(如pPIC9K),另一種是組成型表達載體(如pGAPZB)。前者(以pPIC9K為例)含有的醇氧化酶啟動子pAOX1,可以在甲醇的誘導下高效表達。該載體自身攜帶有a分泌信號肽，可以將外源蛋白直接分泌到胞外。后者(以pGAPZB為例)含有三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子pGAP,可以在多種碳源如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸條件下表達外源蛋白，且不需添加誘導物11。在啟動子功能的研究中，多數(shù)是利用報告基因的表達量來達到功能研究的目的，常用的報告基因有綠色熒光蛋白GFP(greenfluorescentprotein)紅色熒光蛋白RFP(redfluorescentprotein)0-葡糖醛酸糖甘酶GUS(glucuronidase)和氯霉素乙酰轉移酶CAT(chloramphenicolacetyltransferase)等12,130在前期的工作中,克隆了啟動子pScgpd,并在巴斯德畢赤酵母中研究了AOX1啟動子的功能14。實驗以人血清白蛋白(HSA)作為報告基因，在PichiapastorisG