植物DNA提取方法

1、1.2實驗方法1.2.1 茶花基因組DNA勺提取采用CTAB法8提取DNA,所有試劑(有機溶劑除外)和器皿都經(jīng)高壓滅菌，主要步驟如下：(1)取兩片幼嫩新鮮葉片，置于預冷的研缽中，倒入適量液氮，迅速研磨成粉末狀，隨后加入3ml預熱的2%CTAB抽提緩沖液和50ul抗氧化劑2-疏基乙醇，繼續(xù)研磨成略有流動性的糊狀或粥狀，轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管中，于65c水浴鍋中保溫約60min.(2)待混合物冷卻至室溫后加入等600ul的CI(氯仿：異戊醇=24:1)溶液混勻，輕輕顛倒離心管幾次使管內(nèi)混合物成乳濁液，常溫下10000rpm離心10min,取上清液轉(zhuǎn)入另一干凈的離心管中。(3)重復步驟(2)一次。(

2、4)取步驟(3)上清液加入2.5倍體積無水乙醇，仔細混勻，-20冰箱30min以上，沉淀DNA4C,12000rpm離心10min.(5)棄去上層有機溶劑，力口500ul75%乙醇洗滌沉淀，4c下8000rpm離心5min,棄去上清，洗滌沉淀3次。(6)倒置或者37度培養(yǎng)箱烘干.(7)力口50ulTE緩沖液溶解DNA,于-20C冷藏備用。1.2.2 DNA含量和質(zhì)量的測定(1)紫外分光光度法：取4ml提取的DNA,將之稀釋200倍，測定提取的DNA在260nm和280nm處的吸光度值，得出OD260/280的值以及DNA和蛋白質(zhì)濃度。如蛋白質(zhì)濃度過高，需純化。(2)瓊脂糖凝膠電泳：配制1.0%

3、瓊脂糖凝膠，在0.5XTBE緩沖液中，電壓5V/cm電泳約60min,澳化乙錠染色20min,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。1.2.3 PCR擴增(1)PCR反應在BiometroPCR儀上進行，反應體系為25ul:ddH2O14ul,10xBuffer2.5ul,MgCl(25mM)2.5ul,dNTPs(2.5mM)2.0ul,primer(2.0uM)1.0ul,DNA2.7ul(約40-60ng),Taq酶(5U/ul)0.3ul.ddH2O13.7uL10xbuffer2.5uLdNTPs2.0uLMgCl22.5uLPrimer2.0uLDNA2.7uL(40-60ng)Taq酶0.

4、3uL共25uL(2)反應程序為：94c預變性3min;94C變性30s,36C退火1min,72C延伸1min30s,40次循環(huán)；72c最終延伸10min;4C保存。預變性94C3min變性94C30s、退火36C1minA40個循環(huán)延伸72C1min30sJ繼續(xù)延伸72C10min保存4C1.2.4PCR擴增產(chǎn)物檢測取擴增產(chǎn)物與6xloadingbuffer混勻，在1.3%的瓊脂糖凝膠上電泳，緩沖液為0.5xTBE,電壓5V/cm,電泳1.5-2h.經(jīng)澳化乙錠染色20min后，取出凝膠在成像系統(tǒng)中拍照并保存結果。1.3數(shù)據(jù)處理及RAP8析得出清晰，亮度較好的條帶后，用laberworker

5、s軟件分析所得條帶，在同一位點重復出現(xiàn)條帶的記為“1”(包括弱帶)，不出現(xiàn)條帶的記為“0”9,并分析擴增條帶的長度。將生成的數(shù)據(jù)輸入電子表格，用NTSYSpc21軟件分析得出據(jù)類圖和遺傳相似系數(shù)和遺傳距離。其中相似系數(shù)10為：s=2Mxy/(Mx+My)x100%(s表示相似系數(shù)，Mxy表示品種x、y共有片段總和,Mx表示x品種片段數(shù),My表示y品種片段數(shù))，遺傳距離D=1-F。2結果與分析2.1基因組DNAM取提取的DNA經(jīng)分光光度計測定，其OD260/280,DNA含量如下:表2基因組DNAO260/280,DNA含量。Table2ResultsofDNAextractionfromlea

6、vesof15Camelliasamples茶花品種OD260/280DNA含量ug/mlCamelliaspeciesDNAcontent杜鵑茶(Dujuancha)1.850.708凹脈(Ao'mai)1.452.618金絲玉蝶（Jinsiyudie)1.431.282連蕊茶(Lianruicha)1.455.837六角白(Liujiaobai)1.811.094玉美人（Yumeiren）1.341.124醉楊妃(Zuiyangfei)1.431.807鳳仙(Fengxian)1.351.537酒中花(Jiuzhonghua)1.331.165孩兒面(Haiermian)1.595

7、.401墨光鏡(Moguangjing)1.381.395紅露珍(Hongluzhen)1.450.965秋牡丹（Qiumudan）1.412.792公正評獎團1.393.546星上星(Xingshangxing)1.320.857基因組DNAOD260/280在1.32-1.85之間，符合RAPD擴增的要求。附錄2:所用試劑及配方4%CTAB（十二烷基三甲基澳化胺）1mol/LEDTA（乙二胺四乙酸二鈉）1mol/LTris-HCl4.2mol/LNaCl3mol/LNaAC稱取10gCTAB,加水定容至250ml.稱取EDTA37.224g,用NaOH（固體）調(diào)PH至8.0，最后定容至100ml.稱取12.114gTris-HCl,用80ml蒸儲水溶解，加濃HCl,最后定容至100ml.稱取NaCl61.362g,定容至250ml稱取NaAC4.824g,定容至100ml5XTBETris-HCl：54g硼酸：27.5gEDTA:10mol/L定容帶1L2%CTAB緩沖液4%CTA