測定植物抗寒性的方法

1、我國植物種類繁多，分布區(qū)域廣，在晚秋和早春時期發(fā)生的凍害和冷害兩種低溫危害，常常給越冬作物和果木造成嚴(yán)重傷害。凍害由0c以下低溫造成，冷害由0c以上低溫引起，冷害對植物的傷害程度，除取決于低溫外，還取決于低溫維持時間的長短。植物抗寒性的強(qiáng)弱決定其生長季節(jié)，因此蔬菜作物利用抗寒品種，可以將露地栽培提前，提早供應(yīng)市場；而選育抗寒性強(qiáng)的果樹品種，不僅是寒帶果樹育種者的主攻方向，而且也是溫帶甚至熱帶果樹育種者重要育種目標(biāo)之一。本實驗重點學(xué)習(xí)實驗室間接鑒定果樹抗寒性的方法和步驟。一、試材及用具1.試材及處理：植物枝條或花朵，將采回的枝條剪成40cm左右的長度，用自來水沖洗數(shù)遍（洗掉泥土、灰塵、蟲卵），再

2、用蒸儲水沖洗三次，然后用吸水紙吸干水分，最后將枝條末端進(jìn)行蠟封。將每個品種蠟封后的枝條分成相等的6份，其中一份作為對照，其余每份作為一個低溫處理，放于冰箱中（0c4C）保存?zhèn)溆?。每次處理時，各取參試品種的一份枝條放于超低溫冰箱或程控冰箱內(nèi)進(jìn)行低溫處理，處理溫度梯度為：CK（0C）,-20C,-25C,-30C,-35C,-40C。降溫速度為4C/h,達(dá)到目的處理溫度后維持12h,然后逐步升溫，升溫速度亦為4C/h?；ǘ涞奶幚頊囟忍荻葹椋篊K（0C）,-1C,-3C,-5C,-6C,-7C,-8Co2.儀器烘箱，發(fā)芽箱，培養(yǎng)皿，標(biāo)牌，電導(dǎo)儀，具塞刻度試管（20ml）,恒溫水浴鍋，溫度計，玻璃棒，

3、天平，研缽，石英砂，高速臺式離心機(jī)，分光光度計，微量進(jìn)樣器，熒光燈（4000lx）,容量瓶（250ml、25ml）,聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳槽，刻度吸管（10ml、5ml）,離心管等。二、內(nèi)容說明植物的抗寒性鑒定可分為田間鑒定和實驗室間接鑒定兩種方法。1 .田間鑒定田間自然鑒定就是在凍害發(fā)生期（早春及晚秋）對受凍的田間植株一定器官、組織以一定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價、比較，然后根據(jù)凍害情況評價抗寒性。陳學(xué)森等（2001）對山東省春季倒春寒”發(fā)生后，受害的核果類果樹的花器官的抗寒性進(jìn)行了調(diào)查，選出了當(dāng)?shù)鼗ㄆ诳购暂^強(qiáng)的紅荷包、紅豐等杏品種，證明種間的抗寒力大小順序是：桃杏李大櫻桃。趙玉田（1993）對不同

4、生態(tài)型玉米的抗寒性進(jìn)行了田間鑒定，測定的項目包括3個抗冷指標(biāo)：相對出苗率（）（RER）:印00%第：期杷苗率刖苗指數(shù)（EI）：.（我出馬數(shù)（播用大數(shù)）乙由苗總數(shù)fJOd）幼苗干物重（SDW）,取地上部三葉期10株幼苗，烘至恒重。三個抗冷特性以總指數(shù)值（TIV）表示，即占各自等級順序之和。其值反應(yīng)了低溫下種子出苗生長和干物質(zhì)積累能力。田間鑒定能最直接的反映不同品種在同一條件下的抗寒性差異。該法直接、簡單，可進(jìn)行大范圍、大群體的評價，但受地域、品種數(shù)量的限制，只能比較少數(shù)幾個同一地段的品種之間的抗寒力差異，不能對他們的抗寒能力進(jìn)行量化。2 .實驗室間接鑒定實驗室間接鑒定，就是根據(jù)作物某些生理生化指

5、標(biāo)及物理指標(biāo)間接推斷供試材料的抗寒性。物理指標(biāo)Lyons和Raison（1970）證明植物低溫發(fā)生時，生物膜首先發(fā)生膜脂的物相變化，膜的外形和厚度發(fā)生變化，膜上產(chǎn)生龜裂，因而膜的透性增大，電解質(zhì)大量外滲?？购詮?qiáng)的品種細(xì)胞膜透性增大程度輕，抗寒性差的品種與之相反。因此，測量電解質(zhì)外滲量變化可以比較植物的抗寒性。在黑穗醋栗、梨、凍猴桃（ShaoliLu,1990）等許多種果樹的不同器官，如花、枝、葉等都有相似結(jié)論。另外，通過電導(dǎo)率值配以Logistic方程，可以求出半致死溫度，確定植物的臨界致死溫度。常用差示溫度分析來測量深過冷。以DTA法測定，一般植物在零下幾度即散熱結(jié)冰，稱為高溫散熱。經(jīng)過低

6、溫鍛煉的抗寒木本植物，在連續(xù)降溫過程中，可見到有多次散熱，第一次在零下幾度，主要是細(xì)胞外結(jié)冰，最后一次散熱可達(dá)-20-45C的低溫以下，叫低溫散熱。在低溫散熱前一霎那的溫度，即深過冷溫度，用LTE溫度表示。深過冷低溫散熱時，可出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰而使組織死亡。日本京都大學(xué)S.K.Kang（1998）等對蘋果、桃、梨、柿子和葡萄5種落葉果樹通過溫度分析測定了兩種散熱HTE和LTE,發(fā)現(xiàn)柿子與葡萄僅有LTE,所有樹種的低溫散熱溫度與花芽的半致死溫度一致。生理生化指標(biāo)主要包括超氧物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性測定及同工酶分析、丙二醛（MDA）及可溶性糖含量等方法。三、方

7、法步驟（一）質(zhì)膜透性測定電導(dǎo)法近年來的研究表明，在低溫傷害尤其冷害中，膜系統(tǒng)常常是最先受到傷害的部位，寒害能使脂膜受損傷，透性加大，細(xì)胞內(nèi)離子（主要是K+離子）外滲量增多，電導(dǎo)率加大。因此可以用電導(dǎo)儀測定溶液的電導(dǎo)率，求算電解質(zhì)滲出率（或稱傷害率）。傷害率愈高則愈不抗寒，反之則愈抗寒。1 .電解質(zhì)滲出率的測定取處理和對照樣品各0.5g,放入試管中，力口10ml去離子水，置25c下10h。用玻璃棒攪拌均勻，然后用電導(dǎo)儀測電導(dǎo)值分別為T1和C1。再將試管放入沸水中10min,待其冷卻至25c時，測得處理和對照得電導(dǎo)值為T2和C2,按下式計算電解質(zhì)滲出率和傷害度：電解質(zhì)滲出率（%'浸泡沌電導(dǎo)

8、率值,煮海后電導(dǎo)率僅傷害度（%）x100%處理電導(dǎo)率值T1一對，電導(dǎo)率值C1處理煮沸后電導(dǎo)率值T2一對照煮沸后電導(dǎo)率佗C22 .絕對電解質(zhì)滲出量的測定有時為了求得電解質(zhì)的絕對滲出量，需要用分析純的KCl配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液（0.01-10mmol/L）,在25c下測定其電導(dǎo)率值，并繪制電導(dǎo)率（WS/cm）一濃度（mg/ml）標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線查知樣品的外滲電導(dǎo)率值相當(dāng)于KCl的濃度，再折算每克材料的絕對外滲量（mg/g）,即絕對電解質(zhì)滲出量（mg/g）,即絕對電解質(zhì)滲出量（mg/g）=AXB/W式中，A根據(jù)樣品電導(dǎo)率值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出的與KCl相當(dāng)濃度（mg/ml）;B浸泡液的體積（ml）

9、;W一樣品鮮重（g）。2.注意事項（1）在電導(dǎo)測定中一般應(yīng)用去離子水，若制備困難可用普通蒸儲水代替，但在測定中設(shè)一空白試管，測定樣品時要同時測定其空白電導(dǎo)值，按下式計算相對電導(dǎo)度:相對電廿度（L）5-空白電導(dǎo)值與一空白電導(dǎo)值（2）CO2在水中的溶解度較高，在測定電導(dǎo)時要防止高CO2氣源和口中呼出的CO2進(jìn)入試管，以免影響結(jié)果的穩(wěn)定性。（3）溫度對溶液電導(dǎo)影響很大，故S1與S2必須在相同溫度下測定。（二）超氧物歧化酶（SOD）測定超氧物歧化酶（SOD）是一種清除超氧陰離子自由基的酶，普遍存在于植物體內(nèi)。本實驗依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍(lán)四陛（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有可氧化物質(zhì)存

10、在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基可將氮藍(lán)四陛還原為藍(lán)色的甲月簪，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除超氧陰離子自由基從而抑制了甲月簪的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計算出酶活性大小。0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱1.9399gMet用磷酸緩沖液定容至100ml。750科mol/L氮藍(lán)四陛（NBT）溶液：稱取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至100ml避光保存。100mol/LEDTA-Na2溶液：稱取0.037

11、21gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至1000ml。20科mol/L核黃素溶液：稱取0.00753g核黃素定容至1000ml避光保存。2 .酶液提取稱取處理和對照樣品各0.5g,加入5ml磷酸緩沖液，冰浴研磨提取，然后15000rpm離心10min,所提上清液為酶液。3 .顯色反應(yīng)3ml反應(yīng)液為0.05mol/L磷酸緩沖液1.5ml,750umol.L-1NBT溶液、130mmol/L甲硫氨酸（MET）溶液、100umol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）液、20umol/L核黃素各0.3ml,蒸儲水0.25ml和0.05ml酶提取液（對照管加蒸儲水）。混勻后將1支對照管置暗處，其它各

12、管于4000lx日光燈下反應(yīng)20min（要求各管受光情況一致，溫度高時間縮短，低時間延長）。4 .SOD活性測定與計算反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對照管做空白，分別測定其它各管的光吸收，已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示，按下式計算SOD活性。SOD總活性=%乂；XfFX%SOD比活力=0OD總活性蛋白質(zhì)濃度式中：SOD總活性以每克鮮重酶單位表示；比活力單位以酶單位/mg蛋白表示；ACK一照光對照管的光吸收值；AE一樣品管的光吸收值；V樣液總體積（cm3）;Vt一測定時樣品用量（cm3）;W樣重（g）;蛋白質(zhì)濃度單位為：mg蛋白/g樣重。研究表明，當(dāng)遭受低溫脅迫時，引

13、起SOD活性的下降，下降的百分率與品種抗冷性呈負(fù)相關(guān)，故能反應(yīng)品種間抗冷能力的高低。（三）過氧化氫酶（CAT）活性的測定低溫脅迫下，細(xì)胞內(nèi)易產(chǎn)生H2O2破壞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定，而過氧化氫酶（CAT）能把H2O2分解為H2O和。2,從而清除出。2維護(hù)膜的穩(wěn)定性。研究表明，抗寒性強(qiáng)的品種有較高的過氧化氫酶活性，且隨溫度下降，以抗寒性強(qiáng)的品種下降幅度小，與抗寒性呈顯著性相關(guān)。CAT酶活性大小可用一定時間內(nèi)分解的H2O2量來表示。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過量）的H2O2溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高鎰酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H2O2,即可求出被CAT分解的H2O2量：5H：O2KM11O4-4H

14、2SO4->50：-2KHSO4-SH:O+2MnSO+1 .試劑配制10%H2SO4；0.2mol/L磷酸緩沖液（pH=7.8）;0.1mol/L高鎰酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液：稱取KMnO4（AR）3.160g,用新煮沸冷卻蒸儲水配制成1000ml,用0.1mol/L草酸標(biāo)定；0.1mol/LH2O2:取30%H2O2溶液5.68ml,稀釋至1000ml,用標(biāo)準(zhǔn)0.1mol/LKMnO4溶液在酸性條件下標(biāo)定。2 .酶液提取取剪碎的樣品2.5g加入磷酸緩沖液（pH7.8）少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到25ml容量瓶中，將研缽沖洗干凈，沖洗液轉(zhuǎn)至容量瓶中，并用同一緩沖液定容，4000Xg離心10min,上清液

15、為酶粗提液。3 .酶液滴定取50ml三角瓶4個（兩個測定，兩個對照），測定加入酶液2.5ml,對照為煮死酶液2.5ml;再加入2.5ml0.1mol/LH2O2,同時計算時間，于30c恒溫水浴中反應(yīng)10min,立即加入10%H2SO42.5ml。然后用0.1mol/LKMnO4滴定，至出現(xiàn)粉紅色（30min內(nèi)不消失）為終點。4.結(jié)果計算酶活性用每克鮮重樣品在10min內(nèi)分解H2O2毫克數(shù)表示。A-BY-V酶活性(mgH,OygFW)=A對照KMnO4滴定ml數(shù);B酶反應(yīng)后KMnO4滴定ml數(shù);V酶提取液總量（ml）;a反應(yīng)所用酶液量（ml）；W樣重（g）。5.注意事項所用KMnO4溶液及H2O

16、2溶液使用前要經(jīng)過標(biāo)定，0.1mol/LH2O2要新配制。（四）過氧化物酶（POD）活性測定及同工酶分析1.過氧化物酶（POD）活性測定在過氧化物酶催化下，過氧化氫分解成水和原子氧，原子氧能氧化聯(lián)苯胺產(chǎn)生一種藍(lán)色的化學(xué)物質(zhì)，該藍(lán)色化合物在波長580nm處有一最大吸收峰。藍(lán)色物質(zhì)的生成速度（dx/dt）與反應(yīng)系統(tǒng)中過氧化氫分解速率呈正相關(guān)。因此，用分光光度計測出藍(lán)色物質(zhì)密度的變化（單位時間內(nèi)反應(yīng)液中光密度的變化），可以表示過氧化物酶的活性。（1）試劑配制0.1MpH8.5Tris-HCl緩沖液：稱取1.211gTris-HCl溶于80ml蒸儲水，力口36.5%HCl0.42ml,用NaOH調(diào)pH

17、至8.5,定容至100ml。0.1M過氧化氫：1ml30%的過氧化氫稀釋到100ml。0.005M聯(lián)苯胺醋酸醋酸鈉緩沖液：在200ml容量瓶中，先加入2/3的蒸儲水及2.3ml冰乙酸和184mg聯(lián)苯胺。在5060C水浴中加熱溶解，然后加入5.45g無水醋酸鈉。待完全溶解后，冷卻，加水定容到刻度線。（2）酶液提取將樣品剪碎，稱取1g,加入酶提取液（0.1MpH8.5TrisHCl緩沖?5ml和少量石英砂，在研缽中磨碎。然后再次加入5ml酶提取液稀釋。轉(zhuǎn)入離心管在1500rpmmin-1的速度下離心15min。上清液貯于冰箱中待用。（3）酶活性測定測定前，將酶液稀釋300500倍。吸1ml酶液，加

18、入2ml聯(lián)苯胺醋酸醋酸鈉緩沖劑，在2832c水浴中保溫35分鐘。測定時，加入1ml0.1M過氧化氫，立即搖勻，并轉(zhuǎn)入比色皿中，用分光光度計在波長580nm下測定光密度的變化。從加入過氧化氫起計時，每15s讀數(shù)一次。（4）酶活性的計算過氧化氫與酶液接觸后，立即產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，分光光度計上光密度讀數(shù)不斷上升，但隨反應(yīng)時間延長，光密度變化減小。在開始反應(yīng)的4560s種之內(nèi)，光密度呈直線上升。取第1545s之間的光密度變化，按下式計算樣品中過氧化物酶活性。E_AOD545x2其總稀釋倍數(shù)WOOE表示酶活性，單位為zT>.D./mgF.W./Min。研究表明，抗寒性強(qiáng)的品種POD活性高于抗寒性差的品

19、種，且隨溫度下降變幅較緩。2.化物酶(POD)同工酶分析用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)分離POD同工酶。(1)貯液的配制A. 30%Acr0.8%Bis貯液：稱取30gAcr和0.8gBis,用50ml重蒸水加熱溶解，將溶液用定性濾紙過濾到100ml容量瓶內(nèi)，定容后盛于棕色瓶中，于0-4C冰箱中保存。B. 1MTris-HCl緩沖?夜(pH值8.8):稱取121.14gTris用重蒸水溶解后倒入1000ml容量瓶中，用濃鹽酸調(diào)pH值至8.8,最終加水定容至1000ml,然后用濾紙過濾，盛于棕色瓶中，放入04c冰箱保存。C. 1MTris-HCl緩沖?夜(pH6.8):稱12.114gTris用

20、重蒸水溶解后倒入100ml容量瓶中，用濃鹽酸調(diào)pH值至6.8,最終加水定容至100ml,然后用濾紙過濾，盛于棕色瓶中，放入04c冰箱保存。D.電極緩沖液：稱取141.1g甘氨酸和30gTris用重蒸水加熱溶解后倒入1000ml容量瓶中，加水定容至1000mlo用時稀釋20倍，調(diào)pH值至8.3。E.1%過硫酸錢溶液：稱0.5g過硫酸俊溶于50ml重蒸水中，放入04c冰箱，可保存一周。F.澳酚藍(lán)溶液：稱0.2g澳酚蘭溶于100ml重蒸水中，配成0.2%。(2)凝膠板的制備分離膠的制備分離膠濃度多為7%,按照表5-3進(jìn)行配制。先用刻度吸管準(zhǔn)確地吸取30%Acr-0.8%Bis和1MTris-HCl(

21、pH8.8)于抽濾瓶中，用電動吸引器減壓抽氣，除去溶液中氣泡，抽氣畢，再加入1%過硫酸錢溶液和TEMED,搖勻后，小心地將凝膠加入凝膠板模具內(nèi)，上面加一水層，在2530c的地方進(jìn)行聚膠，約1h。表53分離膠的配制t7液不同配置及微股正度斷需貯液imO20ml30ml*TQ.-"/010%5%10%3(iAcr0.8%Bis324.56.5496.S97IMTtiHClpHS.S16.315.013.024.322.419.51%過儺酸費0.50.50.54008OSTEMED(u11202020404040TEMED（四甲基乙二胺）也可用DMPN（二甲氨基丙晴）或TEOA（三乙醇胺）

22、替代。隔層膠的配制按表5-4進(jìn)行隔層膠的配制，用刻度吸管準(zhǔn)確吸取30%Acr-0.8%Bis和1MTris-HCl（pH6.8）于抽濾瓶中，用電動吸引器減壓抽氣，與此同時，吸去分離膠上層的水層，抽氣畢，加入1%過硫酸錢溶液和TEMED,立即灌注隔層膠（凝膠板需要迅速加入蔗子），其中加一水層，約1h可聚合好。表54隔層膠的配制貯液不同配量及凝膠濃度所需仁液mb10ml20ml3%4%3%4%30°oAcrO.S°oBis1.0132.02.6IMTns-HCIpH6.S10132.02.61重蒸水7.77I15.41421%凡硫酸被03030E0.6TEMED(為15.153

23、030TEMED（四甲基乙二胺）也可用DMPN（二甲氨基丙晴）或TEOA（三乙醇胺）替代。（3）加樣裝置好垂直板電泳槽，用1%熱瓊脂封好縫隙。樣品制備：每克鮮樣加3.0ml0.1mol/L的磷酸緩沖液（pH=7.0）,研磨，用紗布粗過濾,濾液離心：4000r/min,（0±2）C,取上清液作供試酶液。用10伏/厘米預(yù)電泳三分鐘后，用微量進(jìn)樣器吸取樣品液分別每管加入50微升。(4)電泳加樣畢，注電極緩沖液入上、下電泳槽，在上槽中加入一滴澳酚藍(lán)。接通電源，上槽為負(fù)極，下槽為正極。調(diào)節(jié)電流為2毫安/厘米(2毫安/管)，在冰箱內(nèi)進(jìn)行。待澳酚藍(lán)遷移至下端約0.51cm處停止電泳，約2h。(5)

24、染色將脫下的凝膠，用去離子水沖洗凝膠板后，放入長方型白瓷盤中染色。A.染色貯液配制0.2M醋酸鈉溶液：稱2.8g醋酸鈉溶于100ml重蒸水中。5mM硫酸鎰溶液：稱取0.168g硫酸鎰，溶于200ml重蒸水中。聯(lián)苯胺溶液：稱0.5g聯(lián)苯胺，溶于10%冰醋酸250ml中。愈創(chuàng)木酚溶液：稱1.35g愈創(chuàng)木酚，溶于250m110%醋酸中。以上四種溶液放冰箱中長期備用。0.12%H2O2:凝膠洗出后才加。隨配隨用。B.染色配比：:20:2:5:8:5C.染色將配好的染色液倒入白瓷盤內(nèi)凝膠板上，37c保溫30min,酶帶呈紫紅色。取出漂洗后，7%醋酸中保存。過氧化物酶同工酶顯色23d更為清楚，在暗室用透光

25、照相的方法效果較好。也可用280mm波長下用光密度計掃描定量。(6)同工酶帶相對遷移率計算“囪恬遷移距離ILZ-一-一_丁酚藍(lán)遷移即離研究表明，過氧化物同工酶與植物抗寒性的關(guān)系極為密切，抗寒性強(qiáng)的品種的同工酶帶一般比抗寒性差的品種多13條，且隨著溫度下降變化緩慢。(五)丙二醛含量的測定正常情況下由于植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于平衡狀態(tài)，不會導(dǎo)致植物傷害。但在低溫MDA)是膜脂過氧化的最終分脅迫環(huán)境下，植物器官往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛(解產(chǎn)物，常用作測定膜脂過氧化的指標(biāo)。在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)生成紅棕色的三甲川(3,5,5-三甲惡吵2,4-二酮)，其最大吸

26、收波長在532nm。但是測定植物組織中MDA時受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長在450nm,532nm處也有吸收。植物遭受低溫脅迫時可溶性糖增加，因此測定植物組織中MDA-TBA反應(yīng)物質(zhì)含量時一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增加TBA與蔗糖或MDA顯色反應(yīng)物在532、450nm處的消光度值，所以在蔗糖、MDA與TBA顯色反應(yīng)中需一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100300g/gDW,根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3+的終濃度為0.5wmol/LA,直線回歸法MDA與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm波長下的消光度值為

27、零。不同濃度的蔗糖(0-25mmol/L)與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm的消光度值與532nm和600nm處的消光度值之差成正相關(guān)，配制一系列濃度的蔗糖與TBA顯色反應(yīng)后，測定上述三個波長的消光度值，求其直線方程，可求算糖分在532nm處的消光度值。UV-120型紫外可見分光光度計的直線方程為：Y532=-0.00198+0.088D450B.雙組分分光光度計法據(jù)朗伯-比爾定律：D=kCL,當(dāng)液層厚度為1cm時，k=D/C,k稱為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。當(dāng)某一溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)時，某一波長下的消光度值等于此混合液在該波長下各顯色物質(zhì)的消光度之和。已知蔗糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm和532

28、nm波長下的比吸收系數(shù)分別為85.40,7.40。MDA在450nm波長下無吸收，故該波長的比吸收系數(shù)為0,532nm波長下的比吸收系數(shù)為155,根據(jù)雙組分分光度計法建立方程組，求解方程得計算公式：C1(mmol/L)=11.71D450C2(mol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450式中Ci為可溶性糖的濃度，C2為MDA的濃度，D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長下的消光度值。0.6%硫代巴比妥酸：稱取硫代巴比妥酸，先加少量氫氧化鈉(1mol/L)溶解，再用10%的三氯乙酸定容。1 .MDA的提取稱取樣品1g,加入2ml10%TCA和

29、少量石英砂，研磨至勻漿，再加8mlTCA進(jìn)一步研磨，勻漿在4000Xg離心10分鐘，上清液為樣品提取液。2 .顯色反應(yīng)和測定吸取離心的上清液2ml(對照加2ml蒸儲水)，加入2ml0.6%TBA溶液，混勻物于沸水浴上反應(yīng)15min,迅速冷卻后再離心。取上清液測定532nm、600nm和450nm波長下的消光度。3 .計算含量(1)直線方程法按公式求出樣品糖分在532nm處的消光度值Y532,用實測532nm的消光度值減去600nm非特異吸收的消光度值再減去Y532,其差值為測定樣品中MDA-TBA反應(yīng)產(chǎn)物在532nm的消光度值。按MDA在532nm處的毫摩爾消光系數(shù)為155換算求出提取液中MD

30、A濃度。(2)雙組分分光光度計法按公式可直接求得樣品提取液中MDA的濃度。用上述任一方法求得MDA的濃度，根據(jù)樣品的重量計算測定樣品中MDA的含量：MDAtnolgFW1NIDA濃度(/miolL)k提取液體積!ml)樣品鮮3?g)如果某一品種MDA含量在低溫時巨增出現(xiàn)的早,MDA含量變化與植物的抗寒性呈負(fù)相關(guān),說明抗寒性較差。反之，抗寒性就強(qiáng)。(六)可溶性糖含量的測定可溶性糖一方面是原生質(zhì)代謝可直接利用的原料，另一方面可溶性糖又增加了原生質(zhì)的濃度，使冰點降低，又可緩沖細(xì)胞質(zhì)過度脫水，保護(hù)細(xì)胞質(zhì)膠體不致遇冷凝固，減少細(xì)胞內(nèi)失水和結(jié)冰，因而提高植株的抗寒性。糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛

31、或羥甲基糠醛，生成的產(chǎn)物可與慈酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量。糖類與慈酮反應(yīng)生成的有色物質(zhì)在可見光區(qū)的吸收峰為630nm,故在此波長下進(jìn)行比色。1 .試劑配制慈酮乙酸乙酯試劑：取分析純慈酮1g,溶于50ml乙酸乙酯中，貯于棕色瓶中，在黑暗中可保存數(shù)星期，如有結(jié)晶析出，可微熱溶解。2 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取20ml刻度試管11支，從010分別編號，按表55加入溶液和水。表55標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作出n01-2375-67-89-1010ngL正祠液；ml>00.2040.6031.0水W)101.6161.41.210蔗糖量（Mg）0204060

32、SO100然后按順序向試管中加入0.5ml慈酮乙酸乙酯試劑和5ml濃硫酸，充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，逐管均準(zhǔn)確保溫1min,取出后自然冷卻至室溫，以空白作參比，在630nm波長下測其光密度，以光密度為縱坐標(biāo)，以糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出標(biāo)準(zhǔn)線性方程。3 .可溶性糖的提取將樣品剪碎混勻，稱取0.100.30g,其3份。分另1J放入3支刻度試管中，加入510ml蒸儲水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液過濾入25ml容量瓶，反復(fù)沖洗試管及殘渣，定容至刻度。4 .顯色測定吸取0.5ml樣品液于20ml刻度試管中（重復(fù)2次），加蒸儲水1.5ml,同制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的

33、步驟，按順序分別加入慈酮，濃硫酸溶液，顯色并測定光密度。由標(biāo)準(zhǔn)線性方程求出糖的量，按下式計算樣品中糖的含量。Cxx門可溶件觸簾端（%）/a.FxlO6C標(biāo)也方也求得期口曉:a吸取樣品液體枳1ml）：V提取液ht（ml”口稀釋倍數(shù)：W-組織-阻：igL5 .注意事項該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖與已糖，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等（因為反應(yīng)液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反應(yīng)），所以用意酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細(xì)致劃分各種碳水化合物的情況下，用意酮法可以一次測出總量，省去許多麻煩，因此，

34、有特殊的應(yīng)用價值，但在測定水溶性碳水化合物時，則應(yīng)注意切勿將樣品的未溶解殘渣加入反應(yīng)液中，不然會因為細(xì)胞壁中的纖維、半纖維素等與慈酮試劑發(fā)生反應(yīng)而增加了測定誤差。此外，不同的糖類與慈酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時，則可避免此種誤差。三、作業(yè)思考題1 .鑒定植物抗寒性的方法有哪些？各有何優(yōu)缺點？2 .干擾可溶性糖測定的主要因素有哪些？如何避免？3 .過氧化氫酶與哪些生化過程有關(guān)？4 .在進(jìn)行超氧物歧化酶(SOD)活力的測定時，為什么設(shè)照光和黑暗兩個對照管？影響該實驗準(zhǔn)確性的主要因素是什么？應(yīng)如何克服？四)游離脯氨酸