液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(許煊煒)

1、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)2021、2021級(jí)課程內(nèi)容(一個(gè)實(shí)驗(yàn)8學(xué)時(shí))：(1)ABSciexQtrap4500三重四級(jí)桿/離子阱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀的結(jié)構(gòu)原理、操作及定性定量應(yīng)用.(2)利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀快速測(cè)定水果中7種農(nóng)藥的殘留量.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部參茸質(zhì)檢中央2021.03實(shí)驗(yàn)一ABSciexQtrap4500三重四級(jí)桿/離子阱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀的結(jié)構(gòu)原理、操作及定性定量應(yīng)用一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵饬x通過(guò)學(xué)習(xí)液質(zhì)聯(lián)用儀的構(gòu)成和使用方法,及其在定性、定量分析中的應(yīng)用,培養(yǎng)學(xué)生使用液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行儀器分析的水平,并培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度、細(xì)致的工作作風(fēng)、實(shí)事求是的數(shù)據(jù)報(bào)告和

2、良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣準(zhǔn)備充分、操作標(biāo)準(zhǔn),記錄簡(jiǎn)明,臺(tái)面整潔、實(shí)驗(yàn)有序,良好的環(huán)保和公德意識(shí).培養(yǎng)培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手水平、理論聯(lián)系實(shí)際的水平、統(tǒng)籌思維水平、創(chuàng)新水平、獨(dú)立分析解決實(shí)際問(wèn)題的水平、查閱手冊(cè)資料并運(yùn)用其數(shù)據(jù)資料的水平以及歸納總結(jié)的水平等.一檢測(cè)儀器1、儀器名稱(chēng)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀簡(jiǎn)稱(chēng)LC-MS-MS.型號(hào)：4500QTRAP美國(guó)AppliedBiosystems公司.2、儀器組成液相色譜局部：島津LC-30A,配有在線(xiàn)脫氣機(jī)、超高壓二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器；串聯(lián)質(zhì)譜局部：QTRAP4500,配有ESI離子源、串聯(lián)四級(jí)桿/線(xiàn)性離子阱.3、主要性能指標(biāo)離子化方式：ESI電離質(zhì)量范圍：51700am

3、u分辨率：6900質(zhì)量穩(wěn)定T0.1amu/12h靈敏度：1pgreserpine,ESI+,MRM掃描m/z:609/195,信噪比S/N120:1掃描速度：4000amu/sec質(zhì)量準(zhǔn)確度：0.01%全質(zhì)量數(shù)范圍4、方法原理高效液相色譜二元泵將流動(dòng)相泵人系統(tǒng)并混合,自動(dòng)進(jìn)樣器將待測(cè)樣品注入流動(dòng)相中,隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱,由于樣品不同組分在色譜柱中保存時(shí)間不同,各組分被分開(kāi),依次進(jìn)入離子源.在離子源中,各組分以ESI或APCI方式電離,被加速后進(jìn)入質(zhì)量分析器.4500QTRAP的質(zhì)量分析器主要由Q1、Q2、Q3三組四級(jí)桿串聯(lián)組成.Q1可將分子離子按質(zhì)荷比m/z大小分開(kāi)；Q2是碰撞室,可將母離子進(jìn)

4、一步破碎為碎片離子；Q3具有四級(jí)桿和線(xiàn)性離子阱兩種功能,作為四級(jí)桿時(shí)可將分子離子或碎片離子按質(zhì)荷比大小分開(kāi),作為離子阱還可富集離子從而提升檢測(cè)靈敏度.各組分的不同離子在質(zhì)量分析器中被破碎、別離,并按質(zhì)荷比大小依次抵達(dá)監(jiān)測(cè)器,經(jīng)記錄即得到按不同質(zhì)荷比排列的離子質(zhì)譜圖.4500QTRAP通過(guò)串聯(lián)四級(jí)桿/線(xiàn)性離子阱兩種不同質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合,可以在單次分析中對(duì)復(fù)雜樣本中的單個(gè)成分同時(shí)進(jìn)行定性和定量,也可以對(duì)多個(gè)化合物進(jìn)行定量分析.整臺(tái)儀器的限制、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果輸出均由PC計(jì)算機(jī)Windows操作系統(tǒng)支持下的Analyst軟件限制完成.二樣品1、樣品要求本儀器適合分子量在51700amu范圍內(nèi)的

5、有機(jī)樣品的定性及定量分析.待測(cè)樣品必須能溶解于水或其它有機(jī)溶劑中.假設(shè)樣品或配制的樣品溶液發(fā)生沉淀、揮發(fā)、變質(zhì)等異常現(xiàn)象時(shí),應(yīng)重新取樣或重新配制溶液.2、試劑要求所有的試劑均選用色譜純級(jí),所用水的電導(dǎo)率應(yīng)大于18KQ.流動(dòng)相必須用0.2m或0.45m濾膜過(guò)濾前方可使用.3、別離條件要求在液相色譜儀上確定別離條件,使待測(cè)組分能完全別離,且該色譜條件中流動(dòng)相不應(yīng)含有不揮發(fā)性鹽,如磷酸鹽.三、操作步驟實(shí)施檢測(cè)操作的人員,必須熟悉該儀器的操作規(guī)程,儀器的工作狀態(tài)、包括檢測(cè)靈敏度和分辨率,必須滿(mǎn)足檢測(cè)工程的要求.1、開(kāi)機(jī)前準(zhǔn)備開(kāi)機(jī)前應(yīng)檢查儀器室內(nèi)電、氣的供給情況及空調(diào)機(jī)的工作狀態(tài)是否穩(wěn)定,檢查真空機(jī)械泵

6、泵油是否需要更換.只有當(dāng)UPS工作正常,Gas1/Gas2、CurtainGas和ExhaustGas的壓力分別穩(wěn)定在0.35、0.35和0.7Mpa,環(huán)境溫度為1030C,相對(duì)濕度小于70%時(shí)才能開(kāi)機(jī).2、開(kāi)機(jī)1翻開(kāi)真空機(jī)械泵上的電源開(kāi)關(guān).2真空機(jī)械泵繼續(xù)工作至少15分鐘后,翻開(kāi)MS電源主開(kāi)關(guān).3等真空度到達(dá)2X10-5Torr綠色指示燈不閃后,翻開(kāi)PC計(jì)算機(jī)電源3、儀器調(diào)諧四、方法建立1 .在Analyst軟彳Tools菜單中選擇ProjectfCreateProjectProjectname項(xiàng)下輸入新建的Project名稱(chēng).注意,不要點(diǎn)選窗口中的其他按鈕！點(diǎn)擊OK,確認(rèn)新建Project

7、.2 .在Analyst軟件界面下,雙擊導(dǎo)航欄內(nèi)HardwareConfiguration.在彈出窗口中選擇MassOnly,點(diǎn)擊ActivateProfile,激活MassOnly只聯(lián)接質(zhì)譜主機(jī).3 .在導(dǎo)航欄內(nèi)單擊TuneandCalibrate,進(jìn)入調(diào)諧模式.點(diǎn)擊上方工具條中的T鈕.此時(shí),應(yīng)注意到主機(jī)有撲聲音,說(shuō)明進(jìn)入調(diào)諧狀態(tài).此時(shí)右下角質(zhì)譜狀態(tài)顯示綠色.雙擊ManualTuning,進(jìn)入質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置及運(yùn)行窗口.4 .使用1mL玻璃進(jìn)樣針吸取適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于進(jìn)樣針座上.點(diǎn)擊MSMethod下拉菜單,選擇SyringePumpMethod,設(shè)定針泵流速FlowRate為10科L/min5

8、 .點(diǎn)擊StartSyringePump按鈕開(kāi)針泵進(jìn)樣.6 .返回MSMethod,選擇掃描模式ScanType為Q1MS,設(shè)定掃描速度ScanRate為10Da/s,設(shè)定掃描范圍StartStop設(shè)定為50化合物分子量.DP預(yù)輸入60.7 .點(diǎn)擊start開(kāi)始采集數(shù)據(jù).運(yùn)行穩(wěn)定后,注意觀(guān)察是否有預(yù)期的母離子出現(xiàn),并限制其響應(yīng)值在名EE4以下.點(diǎn)擊stop,選擇第一個(gè)峰后面是同位素峰的平穩(wěn)段,雙擊,選中母離子.點(diǎn)擊右鍵,選擇DeletePane.8 .設(shè)定Scantype為產(chǎn)物離子掃描ProductIonMs2,掃描速度200Da/s,選擇掃描正/負(fù)離子,輸入母離子productof,設(shè)定掃描

9、范圍startstop為50MW+20,覆蓋可能的子離子質(zhì)量范圍,點(diǎn)擊compoud標(biāo)簽,設(shè)定DP60,CE5.9 .點(diǎn)擊start,開(kāi)始采集數(shù)據(jù),注意觀(guān)察是否有預(yù)期的母離子出現(xiàn).手動(dòng)調(diào)節(jié)CE,以5eV為步長(zhǎng),逐漸增加.每次增加后稍作等待,直至目標(biāo)化合物的子離子清楚看見(jiàn).選擇平穩(wěn)的一段,雙擊,選擇子離子.10 .選才iScanType為MRM.設(shè)定參數(shù)表格中的Q1對(duì)應(yīng)的母離子,Q3對(duì)應(yīng)的子離子,timems為50,ID值設(shè)為名稱(chēng)1定量,名稱(chēng)2定性.11 .點(diǎn)擊EditRamp,在Parameter下選擇CollisionEnergy,點(diǎn)擊OK.點(diǎn)擊start開(kāi)始采集數(shù)據(jù),記錄每個(gè)MRM通道的最

10、正確CE電壓.在MRM參數(shù)設(shè)定表中,右鍵點(diǎn)擊.選才iCollisionEnergyCE,調(diào)出表格中的CE歹U,輸入每個(gè)MRM通道的最正確CE電壓值,精確到個(gè)位數(shù).重復(fù)以上步驟,在Parameter項(xiàng)下選擇DeclusteringPotential,優(yōu)化并保存DP.完成后選擇菜單File/Save保存采樣方法,文件名.dam.五LCM魴法的建立：12 連接儀器：翻開(kāi)HPLC質(zhì)譜電源,將HPLC系統(tǒng)接上柱子,將6號(hào)出口管線(xiàn)與離子源連好.調(diào)離子源噴霧針位置到2mm處,雙擊HardwareConfigure,在硬件配置菜單下單擊LCMS液相與質(zhì)譜聯(lián)用,單擊Activateprofile激活儀器,會(huì)聽(tīng)到

11、笛的一聲,說(shuō)明儀器已經(jīng)連接上.13 確認(rèn)液質(zhì)同步：選擇工程之前優(yōu)化方法的時(shí)候已經(jīng)建立的工程；雙擊Buildacquisitionmethod新建方法,彈出新建方法模板.在模板左側(cè)點(diǎn)擊acquisitionmethod,模板右邊顯示對(duì)應(yīng)的參數(shù),確認(rèn)synchronizationmode選擇LCSync,表示液質(zhì)同步.14 設(shè)置MRM參數(shù)：點(diǎn)擊方法模板左側(cè)的MRM,在模板右側(cè)ScanType下選擇MRM;在polarity下選擇化合物極性：Positive正離子、Negative負(fù)離子；Duration為15min與液相別離相同的時(shí)間；表格中Q1:母離子分子量,Q3Da:子離子分子量,Timems

12、ec:50,ID欄：化合物名稱(chēng)離子對(duì)名稱(chēng)后空格加1為定量,空格加2為定性,在表格中右鍵分別單擊DP、CE,點(diǎn)擊工具欄的OPEN翻開(kāi)之前優(yōu)化的方法參數(shù),調(diào)出DP,CE值,選中整行,Ctrl+c復(fù)制參數(shù),關(guān)閉窗口,再Ctrl+v粘貼參數(shù)；最后點(diǎn)擊Editparameter設(shè)置離子源參數(shù)：Source/Gas項(xiàng)用以下推薦值：CUR35,IS:5500正離子或-4500負(fù)離子,TEM600,GS160,GS270,點(diǎn)擊OK.4、設(shè)置液相參數(shù)：點(diǎn)擊模板左邊的shimadzuLCsystem,在右邊的pumps欄下,設(shè)置stoptime運(yùn)行時(shí)間為15min,flow流速為1mL/min,A為水相設(shè)為95%

13、,B為有機(jī)相設(shè)為5%設(shè)置時(shí)改B,A自動(dòng),泵最大壓力為50;點(diǎn)擊timeprogram設(shè)置液相梯度：例咪門(mén)坐類(lèi)梯度設(shè)置：Time(min)AB95%5%55%95%105%95%10.195%5%1595%5%接著在右邊的Autosampler欄下,設(shè)置清洗時(shí)間,在Rinsemode下選擇Beforeandafter前后都洗,并設(shè)置清洗時(shí)間為5s,清洗液用50%甲醇水.最后點(diǎn)擊保存按鈕,在保存窗口輸入該方法的名稱(chēng).五數(shù)據(jù)處理雙擊才T開(kāi)Multiquilt,選擇工程,點(diǎn)擊File下的熒光棒型圖標(biāo),點(diǎn)擊sample,選擇需要的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)據(jù),點(diǎn)擊next,createnewmethod,為方法命名

14、,點(diǎn)擊next,選擇一個(gè)有代表性的樣品一般選擇濃度較大的標(biāo)品數(shù)據(jù),設(shè)置分組同一物質(zhì)定量離子和定性離子設(shè)置為一組,并指定內(nèi)標(biāo),next,對(duì)每個(gè)物質(zhì)進(jìn)行積分.設(shè)置積分參數(shù)：CausianSmoth平滑：一般是0,如有毛刺可改成1或2;ExpecetedTime保存時(shí)間：一般不動(dòng)Expectedtime范圍：一般30s,表示在保存時(shí)間±5s范圍最小峰寬最小峰高背景噪音扣除：可調(diào)整目標(biāo)峰基線(xiàn)以下被積分的面積,比例越高積分越往下,必要時(shí)調(diào)整.分峰因子：峰有分叉時(shí)設(shè)置,如有兩個(gè)分叉,設(shè)置為2,峰分叉不能大于2單位：設(shè)置單位,勾選Applyunitstoall可將此單位用于所有化合物點(diǎn)擊next,

15、點(diǎn)擊finish.在新跳出窗口內(nèi)將標(biāo)準(zhǔn)品選定,輸入濃度.查看各化合物積分是否正常,點(diǎn)擊第三個(gè)圖標(biāo)查看標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).實(shí)驗(yàn)二利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀快速測(cè)定水果中7種農(nóng)藥的殘留量1實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.1 讓學(xué)生了解利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定食品、農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留等有害化合物的分析流程.1.2 利用前2節(jié)課所學(xué)內(nèi)容實(shí)際處理樣品,增強(qiáng)學(xué)生實(shí)踐水平.1.3 進(jìn)一步增強(qiáng)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的操作和數(shù)據(jù)處理.2試劑或材料除非另有說(shuō)明,僅使用分析純?cè)噭?水為GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水.2.1 乙睛C2H3N:色譜純.2.2 氯化鈉NaCl:140C枯燥4h.2.3 氨基固相萃取小柱：500mg/6mL或性能相當(dāng)?shù)钠渌?/p>

16、固相萃取柱.2.4 二氯甲烷-甲醇混合液：二氯甲烷+甲醇體積比=95+5.2.5 標(biāo)準(zhǔn)品：見(jiàn)表1.2.6 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液配制2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)藏溶液1000mg/L的單分別準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量精確至0.1mg農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解,逐一配成農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)藏液,密封貯存在-18C冰箱中,使用期為6個(gè)月.表19種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品農(nóng)藥名稱(chēng)純度多菌靈>98口比蟲(chóng)咻>98咤蟲(chóng)瞇>98¥硫磷>98阿維菌素>98克白威>98喀霉胺>982.6.2 混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液分別準(zhǔn)確吸取一定體積的9種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)藏溶液4.8.1注入同一容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度配制成100mg/L的混合

17、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)藏液,-18C冰箱中密封閉光保存,使用期為3個(gè)月.2.6.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液吸取一定體積的混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)藏液,用甲醇配制成0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L的7種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,貯于4C以下冰箱中,需現(xiàn)用現(xiàn)配.3儀器設(shè)備3.1 電子天平：感量0.01g;3.2 破壁食物料理機(jī)：不低于20000r/min;3.3 均質(zhì)機(jī)：不低于20000r/min;3.4 恒溫水浴鍋；3.5 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；3.6 氮吹儀.4試驗(yàn)步驟4.1 樣品制備4.1.1 鮮人參取不少于500g水果于破壁食物料理機(jī)中,以不低于20000r/min的轉(zhuǎn)速將

18、樣品制成糊漿狀,充分混勻后裝入樣品密封盒中直接測(cè)定或-18C保存,備用.4.2 樣品預(yù)處理4.2.1 提取稱(chēng)取25g水果樣品水果品種當(dāng)季待定,精確至0.01g,于100mL具塞離心管中,參加50mL乙睛,于勻質(zhì)機(jī)中高速勻質(zhì)1min,過(guò)濾至裝有7g氯化鈉的比色管中,振蕩200下,靜止分層,吸取10mL上層有機(jī)相于50mL濃縮管中,60C水浴中氮?dú)獯抵两?用2mL二氯甲烷甲醇混合液溶解殘?jiān)?待凈化.4.2.2 凈化氨基柱用5mL二氯甲烷甲醇混合液溶解進(jìn)行預(yù)處理,當(dāng)溶劑液面達(dá)上層篩板外表時(shí),再倒入上述濃縮管中待凈化溶液,用濃縮瓶接收,待液面下降至上層篩板外表,用8mL二氯甲烷甲醇混合液溶解分2次沖洗濃縮管并洗脫小柱,將濃縮瓶中洗脫液于40C水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至盡干,氮?dú)獯蹈珊笥?.5mL甲醇和2.5mL水定容,過(guò)0.22m濾膜待測(cè).4.3 儀器參考條件4.3.1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：Qtrap4500三重四級(jí)桿/離子阱質(zhì)譜儀配島津30A超高效液相色譜儀,電噴霧離子源,美國(guó)ABSCIEX公司.4.3.2 色譜柱：KinetexXB-C18,2.1mmx150mmx2.6m4.3.3 流動(dòng)相及流速見(jiàn)表14.3.4 色譜柱箱溫度：40C4.3.5 進(jìn)樣體積：5.0L.表1流動(dòng)相梯度及流速步驟總時(shí)間/min流速/(l