液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術-實驗指導(許煊煒)

1、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測技術實驗指導2021、2021級課程內(nèi)容(一個實驗8學時)：(1)ABSciexQtrap4500三重四級桿/離子阱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀的結構原理、操作及定性定量應用.(2)利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀快速測定水果中7種農(nóng)藥的殘留量.吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部參茸質(zhì)檢中央2021.03實驗一ABSciexQtrap4500三重四級桿/離子阱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀的結構原理、操作及定性定量應用一.實驗目的和意義通過學習液質(zhì)聯(lián)用儀的構成和使用方法,及其在定性、定量分析中的應用,培養(yǎng)學生使用液質(zhì)聯(lián)用儀進行儀器分析的水平,并培養(yǎng)學生嚴謹?shù)目茖W態(tài)度、細致的工作作風、實事求是的數(shù)據(jù)報告和

2、良好的實驗習慣準備充分、操作標準,記錄簡明,臺面整潔、實驗有序,良好的環(huán)保和公德意識.培養(yǎng)培養(yǎng)學生的動手水平、理論聯(lián)系實際的水平、統(tǒng)籌思維水平、創(chuàng)新水平、獨立分析解決實際問題的水平、查閱手冊資料并運用其數(shù)據(jù)資料的水平以及歸納總結的水平等.一檢測儀器1、儀器名稱高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀簡稱LC-MS-MS.型號：4500QTRAP美國AppliedBiosystems公司.2、儀器組成液相色譜局部：島津LC-30A,配有在線脫氣機、超高壓二元泵、自動進樣器；串聯(lián)質(zhì)譜局部：QTRAP4500,配有ESI離子源、串聯(lián)四級桿/線性離子阱.3、主要性能指標離子化方式：ESI電離質(zhì)量范圍：51700am

3、u分辨率：6900質(zhì)量穩(wěn)定T0.1amu/12h靈敏度：1pgreserpine,ESI+,MRM掃描m/z:609/195,信噪比S/N120:1掃描速度：4000amu/sec質(zhì)量準確度：0.01%全質(zhì)量數(shù)范圍4、方法原理高效液相色譜二元泵將流動相泵人系統(tǒng)并混合,自動進樣器將待測樣品注入流動相中,隨流動相進入色譜柱,由于樣品不同組分在色譜柱中保存時間不同,各組分被分開,依次進入離子源.在離子源中,各組分以ESI或APCI方式電離,被加速后進入質(zhì)量分析器.4500QTRAP的質(zhì)量分析器主要由Q1、Q2、Q3三組四級桿串聯(lián)組成.Q1可將分子離子按質(zhì)荷比m/z大小分開；Q2是碰撞室,可將母離子進

4、一步破碎為碎片離子；Q3具有四級桿和線性離子阱兩種功能,作為四級桿時可將分子離子或碎片離子按質(zhì)荷比大小分開,作為離子阱還可富集離子從而提升檢測靈敏度.各組分的不同離子在質(zhì)量分析器中被破碎、別離,并按質(zhì)荷比大小依次抵達監(jiān)測器,經(jīng)記錄即得到按不同質(zhì)荷比排列的離子質(zhì)譜圖.4500QTRAP通過串聯(lián)四級桿/線性離子阱兩種不同質(zhì)譜技術的結合,可以在單次分析中對復雜樣本中的單個成分同時進行定性和定量,也可以對多個化合物進行定量分析.整臺儀器的限制、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理、結果輸出均由PC計算機Windows操作系統(tǒng)支持下的Analyst軟件限制完成.二樣品1、樣品要求本儀器適合分子量在51700amu范圍內(nèi)的

5、有機樣品的定性及定量分析.待測樣品必須能溶解于水或其它有機溶劑中.假設樣品或配制的樣品溶液發(fā)生沉淀、揮發(fā)、變質(zhì)等異常現(xiàn)象時,應重新取樣或重新配制溶液.2、試劑要求所有的試劑均選用色譜純級,所用水的電導率應大于18KQ.流動相必須用0.2m或0.45m濾膜過濾前方可使用.3、別離條件要求在液相色譜儀上確定別離條件,使待測組分能完全別離,且該色譜條件中流動相不應含有不揮發(fā)性鹽,如磷酸鹽.三、操作步驟實施檢測操作的人員,必須熟悉該儀器的操作規(guī)程,儀器的工作狀態(tài)、包括檢測靈敏度和分辨率,必須滿足檢測工程的要求.1、開機前準備開機前應檢查儀器室內(nèi)電、氣的供給情況及空調(diào)機的工作狀態(tài)是否穩(wěn)定,檢查真空機械泵

6、泵油是否需要更換.只有當UPS工作正常,Gas1/Gas2、CurtainGas和ExhaustGas的壓力分別穩(wěn)定在0.35、0.35和0.7Mpa,環(huán)境溫度為1030C,相對濕度小于70%時才能開機.2、開機1翻開真空機械泵上的電源開關.2真空機械泵繼續(xù)工作至少15分鐘后,翻開MS電源主開關.3等真空度到達2X10-5Torr綠色指示燈不閃后,翻開PC計算機電源3、儀器調(diào)諧四、方法建立1 .在Analyst軟彳Tools菜單中選擇ProjectfCreateProjectProjectname項下輸入新建的Project名稱.注意,不要點選窗口中的其他按鈕！點擊OK,確認新建Project

7、.2 .在Analyst軟件界面下,雙擊導航欄內(nèi)HardwareConfiguration.在彈出窗口中選擇MassOnly,點擊ActivateProfile,激活MassOnly只聯(lián)接質(zhì)譜主機.3 .在導航欄內(nèi)單擊TuneandCalibrate,進入調(diào)諧模式.點擊上方工具條中的T鈕.此時,應注意到主機有撲聲音,說明進入調(diào)諧狀態(tài).此時右下角質(zhì)譜狀態(tài)顯示綠色.雙擊ManualTuning,進入質(zhì)譜參數(shù)設置及運行窗口.4 .使用1mL玻璃進樣針吸取適當標準溶液,置于進樣針座上.點擊MSMethod下拉菜單,選擇SyringePumpMethod,設定針泵流速FlowRate為10科L/min5

8、 .點擊StartSyringePump按鈕開針泵進樣.6 .返回MSMethod,選擇掃描模式ScanType為Q1MS,設定掃描速度ScanRate為10Da/s,設定掃描范圍StartStop設定為50化合物分子量.DP預輸入60.7 .點擊start開始采集數(shù)據(jù).運行穩(wěn)定后,注意觀察是否有預期的母離子出現(xiàn),并限制其響應值在名EE4以下.點擊stop,選擇第一個峰后面是同位素峰的平穩(wěn)段,雙擊,選中母離子.點擊右鍵,選擇DeletePane.8 .設定Scantype為產(chǎn)物離子掃描ProductIonMs2,掃描速度200Da/s,選擇掃描正/負離子,輸入母離子productof,設定掃描

9、范圍startstop為50MW+20,覆蓋可能的子離子質(zhì)量范圍,點擊compoud標簽,設定DP60,CE5.9 .點擊start,開始采集數(shù)據(jù),注意觀察是否有預期的母離子出現(xiàn).手動調(diào)節(jié)CE,以5eV為步長,逐漸增加.每次增加后稍作等待,直至目標化合物的子離子清楚看見.選擇平穩(wěn)的一段,雙擊,選擇子離子.10 .選才iScanType為MRM.設定參數(shù)表格中的Q1對應的母離子,Q3對應的子離子,timems為50,ID值設為名稱1定量,名稱2定性.11 .點擊EditRamp,在Parameter下選擇CollisionEnergy,點擊OK.點擊start開始采集數(shù)據(jù),記錄每個MRM通道的最

10、正確CE電壓.在MRM參數(shù)設定表中,右鍵點擊.選才iCollisionEnergyCE,調(diào)出表格中的CE歹U,輸入每個MRM通道的最正確CE電壓值,精確到個位數(shù).重復以上步驟,在Parameter項下選擇DeclusteringPotential,優(yōu)化并保存DP.完成后選擇菜單File/Save保存采樣方法,文件名.dam.五LCM魴法的建立：12 連接儀器：翻開HPLC質(zhì)譜電源,將HPLC系統(tǒng)接上柱子,將6號出口管線與離子源連好.調(diào)離子源噴霧針位置到2mm處,雙擊HardwareConfigure,在硬件配置菜單下單擊LCMS液相與質(zhì)譜聯(lián)用,單擊Activateprofile激活儀器,會聽到

11、笛的一聲,說明儀器已經(jīng)連接上.13 確認液質(zhì)同步：選擇工程之前優(yōu)化方法的時候已經(jīng)建立的工程；雙擊Buildacquisitionmethod新建方法,彈出新建方法模板.在模板左側(cè)點擊acquisitionmethod,模板右邊顯示對應的參數(shù),確認synchronizationmode選擇LCSync,表示液質(zhì)同步.14 設置MRM參數(shù)：點擊方法模板左側(cè)的MRM,在模板右側(cè)ScanType下選擇MRM;在polarity下選擇化合物極性：Positive正離子、Negative負離子；Duration為15min與液相別離相同的時間；表格中Q1:母離子分子量,Q3Da:子離子分子量,Timems

12、ec:50,ID欄：化合物名稱離子對名稱后空格加1為定量,空格加2為定性,在表格中右鍵分別單擊DP、CE,點擊工具欄的OPEN翻開之前優(yōu)化的方法參數(shù),調(diào)出DP,CE值,選中整行,Ctrl+c復制參數(shù),關閉窗口,再Ctrl+v粘貼參數(shù)；最后點擊Editparameter設置離子源參數(shù)：Source/Gas項用以下推薦值：CUR35,IS:5500正離子或-4500負離子,TEM600,GS160,GS270,點擊OK.4、設置液相參數(shù)：點擊模板左邊的shimadzuLCsystem,在右邊的pumps欄下,設置stoptime運行時間為15min,flow流速為1mL/min,A為水相設為95%

13、,B為有機相設為5%設置時改B,A自動,泵最大壓力為50;點擊timeprogram設置液相梯度：例咪門坐類梯度設置：Time(min)AB95%5%55%95%105%95%10.195%5%1595%5%接著在右邊的Autosampler欄下,設置清洗時間,在Rinsemode下選擇Beforeandafter前后都洗,并設置清洗時間為5s,清洗液用50%甲醇水.最后點擊保存按鈕,在保存窗口輸入該方法的名稱.五數(shù)據(jù)處理雙擊才T開Multiquilt,選擇工程,點擊File下的熒光棒型圖標,點擊sample,選擇需要的標準品和樣品數(shù)據(jù),點擊next,createnewmethod,為方法命名

14、,點擊next,選擇一個有代表性的樣品一般選擇濃度較大的標品數(shù)據(jù),設置分組同一物質(zhì)定量離子和定性離子設置為一組,并指定內(nèi)標,next,對每個物質(zhì)進行積分.設置積分參數(shù)：CausianSmoth平滑：一般是0,如有毛刺可改成1或2;ExpecetedTime保存時間：一般不動Expectedtime范圍：一般30s,表示在保存時間±5s范圍最小峰寬最小峰高背景噪音扣除：可調(diào)整目標峰基線以下被積分的面積,比例越高積分越往下,必要時調(diào)整.分峰因子：峰有分叉時設置,如有兩個分叉,設置為2,峰分叉不能大于2單位：設置單位,勾選Applyunitstoall可將此單位用于所有化合物點擊next,

15、點擊finish.在新跳出窗口內(nèi)將標準品選定,輸入濃度.查看各化合物積分是否正常,點擊第三個圖標查看標準曲線.實驗二利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀快速測定水果中7種農(nóng)藥的殘留量1實驗目的：1.1 讓學生了解利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定食品、農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留等有害化合物的分析流程.1.2 利用前2節(jié)課所學內(nèi)容實際處理樣品,增強學生實踐水平.1.3 進一步增強液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的操作和數(shù)據(jù)處理.2試劑或材料除非另有說明,僅使用分析純試劑,水為GB/T6682規(guī)定的二級水.2.1 乙睛C2H3N:色譜純.2.2 氯化鈉NaCl:140C枯燥4h.2.3 氨基固相萃取小柱：500mg/6mL或性能相當?shù)钠渌?/p>

16、固相萃取柱.2.4 二氯甲烷-甲醇混合液：二氯甲烷+甲醇體積比=95+5.2.5 標準品：見表1.2.6 農(nóng)藥標準溶液配制2.6.1 標準儲藏溶液1000mg/L的單分別準確稱取一定量精確至0.1mg農(nóng)藥標準品,用甲醇溶解,逐一配成農(nóng)藥標準儲藏液,密封貯存在-18C冰箱中,使用期為6個月.表19種農(nóng)藥標準品農(nóng)藥名稱純度多菌靈>98口比蟲咻>98咤蟲瞇>98¥硫磷>98阿維菌素>98克白威>98喀霉胺>982.6.2 混合農(nóng)藥標準溶液分別準確吸取一定體積的9種農(nóng)藥標準儲藏溶液4.8.1注入同一容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度配制成100mg/L的混合

17、標準儲藏液,-18C冰箱中密封閉光保存,使用期為3個月.2.6.3 混合標準工作液吸取一定體積的混合農(nóng)藥標準儲藏液,用甲醇配制成0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L的7種農(nóng)藥混合標準工作液,貯于4C以下冰箱中,需現(xiàn)用現(xiàn)配.3儀器設備3.1 電子天平：感量0.01g;3.2 破壁食物料理機：不低于20000r/min;3.3 均質(zhì)機：不低于20000r/min;3.4 恒溫水浴鍋；3.5 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；3.6 氮吹儀.4試驗步驟4.1 樣品制備4.1.1 鮮人參取不少于500g水果于破壁食物料理機中,以不低于20000r/min的轉(zhuǎn)速將

18、樣品制成糊漿狀,充分混勻后裝入樣品密封盒中直接測定或-18C保存,備用.4.2 樣品預處理4.2.1 提取稱取25g水果樣品水果品種當季待定,精確至0.01g,于100mL具塞離心管中,參加50mL乙睛,于勻質(zhì)機中高速勻質(zhì)1min,過濾至裝有7g氯化鈉的比色管中,振蕩200下,靜止分層,吸取10mL上層有機相于50mL濃縮管中,60C水浴中氮氣吹至近干,用2mL二氯甲烷甲醇混合液溶解殘渣,待凈化.4.2.2 凈化氨基柱用5mL二氯甲烷甲醇混合液溶解進行預處理,當溶劑液面達上層篩板外表時,再倒入上述濃縮管中待凈化溶液,用濃縮瓶接收,待液面下降至上層篩板外表,用8mL二氯甲烷甲醇混合液溶解分2次沖洗濃縮管并洗脫小柱,將濃縮瓶中洗脫液于40C水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至盡干,氮氣吹干后用2.5mL甲醇和2.5mL水定容,過0.22m濾膜待測.4.3 儀器參考條件4.3.1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：Qtrap4500三重四級桿/離子阱質(zhì)譜儀配島津30A超高效液相色譜儀,電噴霧離子源,美國ABSCIEX公司.4.3.2 色譜柱：KinetexXB-C18,2.1mmx150mmx2.6m4.3.3 流動相及流速見表14.3.4 色譜柱箱溫度：40C4.3.5 進樣體積：5.0L.表1流動相梯度及流速步驟總時間/min流速/(l