真菌檢測步驟

1、真菌檢查步驟1 .采集標本淺部真菌的標本有毛發(fā)、皮屑、甲屑、痂等，標本在分離前常先用75%的乙醇消毒。深部真菌的標本可根據(jù)情況取痰、尿液、糞便、膿液、口腔或陰道分泌物、血液、腦脊液、各種穿刺液和活檢組織，采集標本時應注意無菌操作。2 .檢查方法真菌檢查的方法主要有：(1)直接涂片：為最簡單而重要的診斷方法。取標本置玻片上，加一滴10%KOH溶液，蓋上蓋玻片，在酒精燈火焰上稍加熱，待標本溶解，輕輕加壓蓋玻片使標本透明即可鏡檢?？捎糜跈z查有無菌絲或抱子，但不能確定菌種。(2)墨汁涂片：用于檢查隱球菌及其他有莢膜的抱子。醫(yī)學教育|網(wǎng)搜集整理方法是取一小滴墨汁與標本(如腦脊液)混合，蓋上蓋玻片后直接鏡

2、檢。(3)涂片或組織切片染色：涂片染色可更好地顯示真菌形態(tài)和結構。革蘭染色適用于白念珠菌、抱子絲菌等；瑞氏染色適用于組織胞漿菌；組織切片通常用PAS染色，多數(shù)真菌可被染成紅色。(4)培養(yǎng)檢查：可提高真菌檢出率，并能確定菌種。標本接種于葡萄糖蛋白月東瓊脂培養(yǎng)基上，置室溫或37c培養(yǎng)13周，必要時可行玻片小培養(yǎng)協(xié)助鑒定。菌種鑒定常根據(jù)菌落的形態(tài)及顯微鏡下形態(tài)判斷，對某些真菌，有時尚需配合其他鑒別培養(yǎng)基、生化反應、分子生物學方法確定。四、真菌學檢驗的基本技術（1） 直接鏡檢是最簡單也是最有用的實驗室診斷方法，常用的方法有：氫氧化鉀/復方氫氧化鉀法：標本置于載玻片上，加一滴浮載液，蓋上蓋玻片，放置片刻

3、或微加熱，即在火焰上快速通過23次，不應使其沸騰，以免結晶，然后輕壓蓋玻片，驅(qū)逐氣泡并將標本壓薄，用棉拭或吸水紙吸去周圍溢液，置于顯微鏡下檢查。檢查時應遮去強光，先在低倍鏡下檢查有無菌絲和抱子，然后用高倍鏡觀察抱子和菌絲的形態(tài)、特征、位置、大小和排列等。浮載液：A.10%20%的KOH配方：氫氧化鉀1020g,蒸儲水加至100ml,待氫氧化鉀完全溶解后搖勻存放在塑料瓶內(nèi)，適用于皮屑、甲屑、毛發(fā)、痂皮、痰、糞便、組織、町監(jiān)等的檢查。B.復方氫氧化鉀溶液配方：氫氧化鉀(AR)10g,二甲基亞碉(AR)40ml,甘油50ml,蒸儲水加至100ml,配制方法：將氫氧化鉀先加入30ml蒸儲水中溶解后，再

4、依次加入DMSO甘油搖勻后，用蒸儲水加到100ml,裝入塑料瓶內(nèi)。此配方的優(yōu)點是：配方中加DMSO能促進角質(zhì)的溶解，有甘油涂片不易干，不易制成氫氧化鉀結晶，氫氧化鉀的濃度相對低，腐蝕性亦低，為進行大面積普查或大批量采集標本作鏡檢帶來了方便。膠紙粘貼法：用1cmx1.5cm的透明雙面膠帶貼于取材部位數(shù)分鐘后自取材部位揭下，撕去復帶在上面的底板紙貼在載玻片上，使原貼在取材部位的一面暴露在上面，再進行革蘭染色或過碘酸錫夫染色，在操作過程中應注意雙向膠帶粘貼在載玻片上時不可貼反，而且要充分展平，否則影響觀察。涂片染色檢查法：在載玻片上滴1滴生理鹽水，將所采集的標本均勻涂在載玻片上，自然干燥后，火焰固定

5、或甲醇固定。再選擇適當?shù)娜旧椒ǎ旧?，以高倍鏡或油鏡觀察。常見鏡檢染色方法有：革蘭染色。所有真菌、放線菌均為革蘭染色陽性，被染成藍黑色。適用于酵母菌、抱子絲菌、組織抱漿菌及諾卡菌、放線菌的感染。乳酸酚棉藍染色：用于各種真菌培養(yǎng)物的鏡檢。印度墨汁：用于檢測腦脊液（CSF）中的新生隱球菌?？顾崛旧河糜诳顾峋爸Z卡菌的診斷。瑞氏染色：用于組織胞漿菌和馬內(nèi)菲青霉的檢測。過碘酸錫夫染色（PAS）:用于體液滲出液和組織勻漿等。真菌胞壁中的多糖染色后呈紅色，細菌和中性細胞偶可呈假陽性，但與真菌結構不同，不難區(qū)別。嗜銀染色（GMS:真菌可染成黑色，主要用于測定組織內(nèi)真菌。（2） 真菌培養(yǎng)從臨床標本中對致

6、病真菌進行培養(yǎng)，目的是為了進一步提高對病原體檢出的陽性率，以彌補直接鏡檢的不足，同時確定致病菌的種類。真菌培養(yǎng)檢查除需要一般細菌檢驗用到的器具外，還應準備真菌專用的接種針、接種環(huán)、或接種鉤（用鉗絲或饃絲制成）、微型小鏟、刀片、針頭等，常規(guī)分離鑒定使用的培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖瓊脂（SDA斜面培養(yǎng)基，加0.05%氯霉素，還有多種性質(zhì)的培養(yǎng)基（見第二部分）以滿足各種不同的需要，可酌情選用接種的方法，根據(jù)不同的臨床標本，大體可分為點植法和劃線法兩種。點植法：適用于皮屑、甲屑、毛發(fā)、痂皮、組織等有形固體標本，將標本直接與培養(yǎng)基表面點狀接觸。劃線法：適用于痰、分泌物、膿液、組織液、組織塊的研磨液等液體標本，用

7、接種針（環(huán)）劃線接種在培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)方法有多種，接臨床標本接種時間分為直接培養(yǎng)法和間接培養(yǎng)法；按培養(yǎng)方法分為試管法、平皿法（大培養(yǎng)）和玻片法（小培養(yǎng)）。直接培養(yǎng)：采集標本后直接接種于培養(yǎng)基上。間接培養(yǎng)：采集標本后，暫保存，以后集中接種。試管培養(yǎng)：是臨床上最常用的培養(yǎng)方法之一，培養(yǎng)基置于試管中，主要用于臨床標本分離的初代培養(yǎng)和菌種保存。大培養(yǎng)：將培養(yǎng)物接種在培養(yǎng)皿或特別的培養(yǎng)瓶內(nèi)，主要用于純菌種的培養(yǎng)和研究。小培養(yǎng)：主要用于菌種鑒定，大致分為三種：玻片法，方塊法和鋼圈法。A.玻片法：在消毒的載玻片上，均勻地澆上熔化的培養(yǎng)基，不宜太厚。凝固后接種待鑒定菌株，置于平皿中，保濕。待有生長后，蓋上消毒

8、的蓋玻片，顯微鏡下直接觀察，常用米粉吐溫瓊脂培養(yǎng)基觀察白念珠菌的頂端厚壁抱子和假菌絲。B.方塊法：適用于霉菌菌落的培養(yǎng)。取無菌平皿倒入約15ml熔化的培養(yǎng)基，待凝固后用無菌小鏟或接種刀劃成1cm2大小的小塊。取一小塊移在無菌載玻片上，然后在小塊上方四邊的中點接種待鑒定菌株，蓋上消毒的蓋玻片，放入無菌平皿中的V形玻棒上，底部鋪上無菌濾紙，并加入少量無菌蒸儲水，孵育，待菌落生長后直接將載玻片置顯微鏡下觀察。C.鋼圈法：先將固體石蠟加熱熔化，取直徑約2cm,厚度約0.5cm有孔口的不銹鋼小鋼圈，火焰消毒后趁熱浸入石蠟油，旋即取出冷卻，石蠟油即附著于小鋼圈中。再取一無菌載玻片，火焰上稍加熱，將小鋼圈平

9、置其上，孔口向上。小鋼圈上石蠟油遇載玻片的熱即熔化后凝固，鋼圈就會固定在載玻片上。用無菌注射器經(jīng)孔口注入熔化的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基量約占小鋼圈容量的1/2,注意避免氣泡。待培養(yǎng)基凝固后取一消毒蓋玻片，火焰上加熱后，趁熱蓋在小鋼圈表面，也即固定其上。最后用接種針伸入孔口進行接種。這種方法的優(yōu)點是形成一種封閉式培養(yǎng)，在顯微鏡下直接觀察菌落時可避免抱子吸入人體，而且不易被污染，蓋玻片也可取下染色后封固制片保存。（3）培養(yǎng)檢查標本接種后，每周至少檢查2次，觀察以下指標：菌落外觀：A.生長速度：緩慢生長菌：714d,快速生長菌：27do一般淺部真菌超過2周深部真菌超過4周仍無生長，可報告陰性。B.外觀：a.扁

10、平。b.疣狀。c.折疊規(guī)則或不規(guī)則。d.纏結或墊狀。e.其他。C.大小：菌落大小用cm來表示，菌落大小與生長速度和培養(yǎng)時間有關。D.質(zhì)地：a.平滑狀。b.粉狀。c.粒狀。d.棉花狀。e.粗毛斗犬。f.皮革大。g.粘液狀。h.膜狀。E.1B色：不同的菌種表現(xiàn)出不同的顏色，呈鮮艷或暗淡。致病性真菌的顏色多較淡，呈白色或淡黃色，而且其培養(yǎng)基也可變色，如馬爾尼菲青霉等，有些真菌菌落不但正面有1g色，其背面也有深淺不同的1g色。菌落的顏色與培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、移種代數(shù)等因素有關。所以，菌落的H色雖在菌種鑒定上有重要的參考價值，但除少數(shù)菌種外，一般不作為鑒定的重要依據(jù)。F.菌落的邊緣：有些菌

11、落的邊緣整齊，有些不整齊。G.菌落的高度和下沉現(xiàn)象：有些菌落下沉現(xiàn)象明顯，如黃癬菌、絮狀表皮癬菌等，更有甚者菌落有時為之裂開。H.滲出物：一些真菌如青霉、曲霉的菌落表面會出現(xiàn)液滴。I.變異：有些真菌的菌落日久或多次傳代培養(yǎng)而發(fā)生變異，菌落顏色減退或消失，表面氣生菌絲增多，如絮狀表皮癬菌在23周后便發(fā)生變異。顯微鏡檢查：小培養(yǎng)可置普通顯微鏡下直接觀察，而試管和平皿培養(yǎng)的菌落則需挑起后做涂片檢查。五、組織病理學檢查真菌病的組織病理檢查與直接鏡檢培養(yǎng)同樣具有相當重要的價值，尤其對深部真菌病的診斷意義更大，如用特殊染色可提高陽性率。真菌的組織病理反應與其他一些疾病的組織病理反應極其相似，往往只有在仔細

12、研究了病理切片并發(fā)現(xiàn)了真菌之后才考慮到真菌病的診斷。而在這種情況下，標本已被固定，培養(yǎng)有時已不可能進行，組織病理切片就成了真菌感染的主要依據(jù)。所以臨床上在送病理標本的同時，要盡可能考慮到真菌感染的可能，以便同時采集標本送真菌實驗室進行真菌學檢查。真菌在組織內(nèi)一般表現(xiàn)為：抱子：酵母和雙相型真菌在組織內(nèi)表現(xiàn)為抱子。菌絲：許多真菌在組織中只表現(xiàn)為菌絲。組織中發(fā)現(xiàn)無色分隔、分支的菌絲多為念珠菌和曲霉。粗大、不分隔少分支的菌絲為接合菌，多為毛霉、根霉、犁頭霉等。粗大、少分支有隔的菌絲為蛙糞霉菌。棕色菌絲為暗色絲抱霉病，由暗色抱科真菌引起。菌絲和抱子，主要見于念珠菌感染。顆粒：為組織內(nèi)由菌絲形成的團塊。球

13、囊或內(nèi)抱囊：球囊內(nèi)含有內(nèi)抱子，為球抱子菌或鼻泡子菌在組織內(nèi)的特征性結構。組織病理片中根據(jù)形態(tài)和染色能基本確定種名的真菌為：莢膜組織胞漿菌、杜波伊斯組織胞漿菌、副球抱子菌、皮炎芽生菌、鏈狀芽生菌、粗球抱子菌、新生隱球菌和鼻泡子菌等。根據(jù)組織病理中真菌的形態(tài)能確定屬而不能確定種的病為：放線菌病、奴卡菌病、無綠藻病、念珠菌病、曲霉病和不育大抱子菌病等。多個屬的真菌感染可引起相同的臨床表現(xiàn)，在組織病理中真菌的形態(tài)無法區(qū)別的病有皮膚著生芽生菌病、暗色絲抱霉病、接合菌病、皮膚癬菌病和足菌腫等。足菌腫的顆粒若染色適當，很易確定為放線菌性或真菌性的，也能區(qū)別出細菌性顆粒。真菌性顆粒中的菌絲又分為無色或暗色兩大

14、類。各種病原菌基本上形成各自顏色、大小、形成和結構的顆粒，可以初步區(qū)別，但最后確定必須依靠真菌培養(yǎng)。六、血清學方法隨著診斷技術的進展，以免疫學方法檢測真菌病已成為可能，引起深部真菌感染的病原菌主要有白念珠菌、曲霉菌和隱球菌等，傳統(tǒng)的檢測方法主要為血培養(yǎng)和組織活檢，但血培養(yǎng)歷時太長，且深部真菌感染的病原菌常不易培養(yǎng)成功，陽性率較低。而深部真菌感染的臨床征象錯綜復雜，又使得組織活檢缺乏典型改變，影響正確診斷，這些都使得這些方法所起的作用極為有限，真菌的抗原、抗體及代謝產(chǎn)物的血清學檢查用于深部真菌感染的實驗室檢測，可取得很好的效果。目前常用的免疫診斷方法有：特異性抗原的檢測：A.乳膠凝集試驗（LA）。B.酶聯(lián)免疫試驗（EIA）。C.熒光免疫測定法（FA）。特異性抗體檢測：由于受檢者都為免疫低下患者，因其致陽性率低，故現(xiàn)已少用。七、分子生物學方法近年來隨著分子生物學的發(fā)展，已有聚合酶鏈反應（PCR擴增、分子探針、限制性酶切片段長度多態(tài)性分析（RFLP