單克隆抗體的制備、純化及鑒定

1、單克隆抗體的制備、純化及鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簡(jiǎn)慰寺】贵w制備是細(xì)胞免疫學(xué)的一個(gè)重要里程碑，它涵蓋了細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、免疫動(dòng)物和抗體效價(jià)檢測(cè)等各個(gè)方面內(nèi)容。了解單克隆抗體制備的原理、主要步驟和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)能大量無(wú)限增殖，但不能分泌特異性抗體；而抗原免疫的B淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無(wú)限增殖。將免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了兩個(gè)親代細(xì)胞的特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限制增殖的特性，乂具有免疫B細(xì)胞合成和分泌特異性抗體的能力。經(jīng)在HAT培養(yǎng)基含有次黃喋吟（H）、氨基喋吟（A）和胸腺嚅噬核苜（T）中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，未融合的脾細(xì)胞因不能在體外長(zhǎng)期

2、存活而死亡；未融合的骨髓瘤細(xì)胞合成DNA的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶吟阻斷，乂因缺乏次黃喋吟-鳥(niǎo)喋吟-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）,不能利用培養(yǎng)基中的次黃喋吟完成DNA的合成過(guò)程而死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃喋吟-鳥(niǎo)喋吟-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。經(jīng)過(guò)克隆選擇，可篩選出能產(chǎn)生特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)，即可無(wú)限制地大量制備單克隆抗體。三、試劑與器材：細(xì)胞培養(yǎng)板、解剖器械、平血、酶標(biāo)儀、加樣器、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡等。四、操作方法：1、抗原制備；一般而言，抗原的純度不很重要，特別是免疫原性較強(qiáng)的抗原。A.可溶性抗原（

3、蛋白質(zhì)）以1mg/ml5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐劑乳化，分多點(diǎn)小鼠皮下注射，總量為0.3ml0.6ml,間隔35周再同樣注射一次，10天后，斷尾取血一滴，測(cè)抗體效價(jià)，選滴度高的小鼠做融合試驗(yàn)。一個(gè)月后可以經(jīng)靜脈(尾靜脈)給予無(wú)佐劑抗原0.2ml0.4ml,34天后，殺死小鼠取脾做融合用。B.顆粒性抗原如抗原來(lái)源方便，可以不加佐劑而增加免疫次數(shù)，縮短間隔時(shí)間。例如用羊紅血球免疫小白鼠，以1%濃度每只皮下注射0.2ml,每周2次，共免疫58次，取脾前3天，再免疫一次即可。有人認(rèn)為最后一次免疫劑量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。2、免疫動(dòng)物；目前應(yīng)用最廣的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠為好

4、。就品系而言以Balb/c小白鼠應(yīng)用最廣，因?yàn)樗械男“资蠊撬枇鱿稻鶑腂alb/c小白鼠系誘導(dǎo)出來(lái)。Balb/c系小白鼠必須用純系的，雌雄均可，以812周齡為宜。大白鼠也可，能產(chǎn)生較多量的單克隆抗體?，F(xiàn)在已經(jīng)在小鼠雜交瘤的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小鼠-大鼠，小鼠-人以及人-人雜交瘤技術(shù)。免疫程序、劑量和方法是關(guān)系到是否能得到所需要的單克隆抗體的關(guān)鍵之0正常小鼠脾臟含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B淋巴細(xì)胞，一只純種小白鼠估計(jì)能產(chǎn)生1.0X1075.0X107種不同的抗體。因此一只正常的小白鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤融合，只能有千萬(wàn)分之一的機(jī)會(huì)獲得某一種特定抗體。所以為了提高得到某種雜交瘤的機(jī)會(huì)，必須加強(qiáng)免疫，使產(chǎn)生

5、特異性抗體的B淋巴細(xì)胞大量增加。B淋巴細(xì)胞的不同發(fā)育階段對(duì)獲得陽(yáng)性雜交瘤也有很大影響。有人認(rèn)為處在轉(zhuǎn)化時(shí)期的B淋巴細(xì)胞可能更易于融合，而免疫以后78天，雖然是抗體產(chǎn)生的高峰時(shí)期，但形成有活力的雜交瘤細(xì)胞的可能反而減少。故一般認(rèn)為加強(qiáng)免疫后的第三天應(yīng)殺鼠取脾做細(xì)胞融合。3、免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備；脾細(xì)胞制備免疫過(guò)的血活抗體滴度高的Balb/c鼠，拉頸或用CO2處死小白鼠。(2) 將小鼠放于70%灑精中浸泡消蠹，取出固定于板上，在無(wú)菌條件下取脾。把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。(4)用鑲子輕輕擠壓脾，做成脾細(xì)胞懸液，用毛細(xì)管將懸液移入小試管中。（5

6、）直立小試管3min,使大塊的結(jié)締組織下沉，把細(xì)胞懸:液移入離心管中。以2.5%FCS1640充滿離心管，并以400g離心7min10min（與此同時(shí)應(yīng)開(kāi)始制備骨髓細(xì)胞）。（7）把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮。（8）重復(fù)、步驟。計(jì)算細(xì)胞，以臺(tái)盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80%為合格。骨髓瘤細(xì)胞制備骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細(xì)胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞。選擇骨髓瘤細(xì)胞的條件：該瘤細(xì)胞系的來(lái)源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；骨髓瘤細(xì)胞必須是靜息狀態(tài)，不產(chǎn)生T球蛋白或不

7、分泌到細(xì)胞外；骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要一個(gè)較高的細(xì)胞密度，最好106個(gè)細(xì)胞/ml;生長(zhǎng)速度快，繁殖時(shí)間短。目前常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株有：S194/5XXO-BU-1;SP2/0Ag14（簡(jiǎn)稱SP2）;P2X?Ag8-653（簡(jiǎn)稱653）;FO以653最為常用，它是由礦物油4甲基一15烷（Pristane,降植烷）誘發(fā)出來(lái)的一種漿細(xì)胞瘤（MinerolOilplasmacytoma,MOPC）并經(jīng)過(guò)培育形成一株8-氮鳥(niǎo)喋吟有抵抗力的業(yè)系。骨髓瘤細(xì)胞一般由有關(guān)單位直接引入，保存于-195C液氮罐中，試驗(yàn)時(shí)復(fù)蘇、增殖、傳代即可。由于骨髓瘤細(xì)胞是半貼壁狀態(tài)，很容易脫落，因此不需要胰酶處理。

8、為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，在融合前，可將培養(yǎng)基內(nèi)加入15g/ml8-氮鳥(niǎo)喋吟。取約1X1076X107對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（即培養(yǎng)15h20h）的骨髓瘤細(xì)胞，在室溫離心（400g）10min,沉淀以2.5%FCS1640液再懸:浮并計(jì)數(shù)。飼養(yǎng)細(xì)胞在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，單個(gè)的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長(zhǎng)繁殖，加入的細(xì)胞稱之為飼養(yǎng)細(xì)胞（Feedercell）。在細(xì)胞融合和單克隆的選擇過(guò)程中，就是在少量的或單個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上使其生長(zhǎng)繁殖成群體，因此在這一過(guò)程中必須使用飼養(yǎng)細(xì)胞。許多種類的動(dòng)物細(xì)胞都可以做飼養(yǎng)細(xì)胞，如正常的脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、腹腔滲出細(xì)胞等，常選用腹腔滲出細(xì)胞，其中主要

9、是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞，另一方面巨噬細(xì)胞可以吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，為融合細(xì)胞的生長(zhǎng)造成良好的環(huán)境。腹腔細(xì)胞的來(lái)源可以是與骨髓瘤細(xì)胞同系鼠。也可以是其他種類的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。(1) 拉頸處死小鼠。(2) 70%灑精浸泡消蠹10min。(3) 用手術(shù)剪將小鼠腹部剪開(kāi)一小口，剝開(kāi)皮膚，露出腹腔。(4) 用注射器將4ml11.6%蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體，加入離心管。(5) 1000rymin離心10min。(6) 取上活，以HAT選擇培養(yǎng)液將細(xì)胞制成懸:液。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，使每毫升含40萬(wàn)個(gè)活細(xì)胞

10、。以1ml吸管將細(xì)胞種入微量培養(yǎng)血，每孔0.05ml,含2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即可供細(xì)胞融合和克隆化之用。如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量少，則可以在細(xì)胞換液時(shí)再加入一些。4、細(xì)胞融合；小鼠骨髓瘤可以在體外培養(yǎng)液中中存并大雖繁殖，經(jīng)過(guò)用某神抗原免疫的小鼠及淋巴細(xì)胞能分泌某種抗體，但小鼠的B淋巴細(xì)胞在一般培養(yǎng)某中不易存活。如將小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與分泌霜種抗體的B淋巴細(xì)胞在融合因子(聚乙二醇，PEG)作用下產(chǎn)生融合，則融合的細(xì)胞既具有腫瘤細(xì)胞易分裂增殖的特性，乂具有B淋巴細(xì)胞分泌特異性抗體的能力，在HAT選擇培養(yǎng)基中可以選擇得到雜交細(xì)胞。這種融合的被稱為淋巴細(xì)胞雜交瘤的細(xì)胞可以在體

11、外培養(yǎng)液中大量繁殖生長(zhǎng)，從培養(yǎng)液上活中可以收集到大量某B淋巴細(xì)胞產(chǎn)物一一單克隆抗體。(1) 、取末次免疫后的第3天小鼠脾細(xì)胞懸:液，將108小鼠脾細(xì)胞與1-5X107SO2/O小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合丁50毫升刻度離心管中，經(jīng)1000轉(zhuǎn)/分離心7分鐘；（2）、棄上活液，盡可能除得十凈，用手指輕叩離心管底部，使沉淀混勻如糊狀，離心管置37C水中進(jìn)行水浴（一小燒杯中），準(zhǔn)備融合；3）、將37C水浴中保溫的50%PEG1.0毫升（實(shí)際應(yīng)用0.7毫升）用滴管緩慢滴入離心管中，在60秒鐘內(nèi)滴完，在37C水浴中邊滴邊搖邊離心管，使細(xì)胞保存在混勻狀態(tài)；4）、加完P(guān)EG后，將細(xì)胞懸:液放在37C水浴中靜置90秒鐘，

12、立即在24分鐘內(nèi)加入15毫升無(wú)血活的RPMI-1640培養(yǎng)基（37C）,開(kāi)始要一滴一滴地加，由于稀釋使PEG停止作用。注意盡可能不攪動(dòng)細(xì)胞；5）、再經(jīng)100轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。棄去上活液，加25毫升HAT培養(yǎng)液，輕輕混勻，將混懸液分裝已有巨噬細(xì)胞的兩個(gè)24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5毫升；6）、將培養(yǎng)板放在水蒸汽飽和CO2孵箱中，37C孵育。CO2含量為5%;7）、每23天換一次HAT培養(yǎng)液，連續(xù)2周觀察雜交瘤細(xì)胞是否出現(xiàn)。2周后使用HT培養(yǎng)基。5、雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)；6、雜交瘤細(xì)胞的篩選；7、雜交瘤細(xì)胞的克隆化；8、單克隆抗體的檢定；9、分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立；10、單克隆抗體的大量制

13、備。五、關(guān)鍵步驟與注意事項(xiàng)：1、整個(gè)制備過(guò)程需嚴(yán)格無(wú)菌2、細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)注意適時(shí)更換培養(yǎng)液雜交瘤細(xì)胞的大量繁殖克隆化的細(xì)胞可以在體外進(jìn)行大量培養(yǎng)，收集上活液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過(guò)體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限，其不能超過(guò)特定的細(xì)胞濃度，且每天要換培養(yǎng)液。而體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細(xì)胞具有從親代淋巴細(xì)胞得來(lái)的腫瘤細(xì)胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠(無(wú)胸腺的裸鼠)，雜交瘤細(xì)胞就開(kāi)始無(wú)限地繁殖，直至宿主死亡。產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的小鼠腹水和血活中含有大量的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，這種抗體的效價(jià)往往高于培養(yǎng)細(xì)胞上活液的1001000倍。利用免疫

14、抑制劑，如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細(xì)胞血活等，可以加速和促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。(1) 材料經(jīng)高壓滅菌的降植烷。(2) Balb/c鼠：58周齡。(3) 雜交瘤細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。(4) RPMI1640培養(yǎng)液1. 新生牛血活操作方法(1)于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后19周內(nèi)種植細(xì)胞。收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，用5%FCS-1640液洗滌一次,1000r/min離心10min。FCS1640液配成1.0X107(3) 取樣，用臺(tái)盼蘭染色，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，重新用5%細(xì)胞/ml的懸:液。(4) 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細(xì)胞，每只腹腔注射1ml(含1.0X107個(gè)細(xì)胞/ml)。接種后1

15、0天左右時(shí)間腫瘤體積最大，此時(shí)可由腹腔抽取腹水，每隔13天取1次，可取10次。血活可由腋下動(dòng)脈或心臟采血后分離。1. 單克隆抗體的提純材料20mMol/LpH7.87.9TrisHCl緩沖液20mMol/LNaCl20mMol/LpH7.87.9TrisHCl緩沖液40mMol/LNaCl20mMol/LpH7.87.9TrisHCl緩沖液80mMol/LNaCl20mMol/LpH7.87.9TrisHCl緩沖液飽和硫酸鉉液DEAE一纖維素柱操作方法(1) 小鼠腹水用冷PBS液稀釋4倍后，于1.00X105轉(zhuǎn)離心30min,去沉淀。(2) 在4C于上活中緩緩滴加飽和硫酸鉉液，邊加邊攪拌，使溶

16、液最終為50%硫酸鉉濃度。(3) 此溶液置冰中30min60min，然后5000r/min離心10min,去上活。(4) 將沉淀溶于TrisHCl緩沖液(40mMol/LNaCl)中(溶液可能混濁)。(5) 裝入透析袋于TrisHCl緩沖液(20mMol/LNaCl)中透析除鹽。(6) 離心去沉淀。溶液稀釋(1:100或更局倍稀釋)后，于280nm測(cè)蛋白含量，估計(jì)蛋白質(zhì)含量1A280unit=0.8mg蛋白質(zhì)一般每ml腹水中，含有總蛋白約25mg36mg。(7) 過(guò)DEAE一纖維素柱：纖維素柱高40cm,以20mMol/LNaClTris緩沖液平衡。透析樣品以Tris緩沖液等量稀釋。樣品進(jìn)入柱

17、床速度為1ml2ml/min，以NaCl線形梯度洗脫。大部分單克隆IgG于40mMol/L和80mMol/LNaCl洗脫，也有極少例外的單克隆抗體于120mMol/L150mMol/LNaCl洗脫。測(cè)OD280nm收集蛋白峰，單克隆IgG保存?zhèn)溆秒s交瘤產(chǎn)生各種免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM,究竟是哪種為主，則決定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多為產(chǎn)生IgM的B淋巴細(xì)胞。免疫多次的多為IgG。1 單克隆抗體的鑒定.雜交瘤細(xì)胞染色體的檢查采用秋水仙素裂解法進(jìn)行。2.單克隆抗體的類型、業(yè)型的測(cè)定：購(gòu)買(mǎi)兔抗小鼠Ig類型和業(yè)型的標(biāo)準(zhǔn)抗血活，采用瓊脂擴(kuò)散法或ELISA夾心法測(cè)定單抗的Ig

18、類型和業(yè)型。3.單抗的特異性鑒定可以采用各種方法，如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術(shù)等，同時(shí)還需做免疫阻斷試驗(yàn)等。4. 單抗的效價(jià)測(cè)定可采用凝集反應(yīng)、ELISA或放射免疫測(cè)定。不同的測(cè)定方法效價(jià)不同。培養(yǎng)上活液的效價(jià)遠(yuǎn)不如腹水的效價(jià)。采用凝集反應(yīng)，腹水效價(jià)可達(dá)5X104。而采用ELISA檢查，腹水效價(jià)可達(dá)1.0X106。單抗的效價(jià)以培養(yǎng)上活和腹水的稀釋度表小。5. 必要時(shí)還可以測(cè)定單抗的親和力和識(shí)別抗原表位的能力測(cè)定。動(dòng)物的選擇Balb/c小目前應(yīng)用最廣的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠為好。就品系而言以白鼠應(yīng)用最廣，因?yàn)樗械男“资蠊撬枇鱿稻鶑腂alb/c小白鼠系誘導(dǎo)出來(lái)。Bal

19、b/c系小白鼠必須用純系的，雌雄均可，以812周齡為宜。大白鼠也可，能產(chǎn)生較多量的單克隆抗體?，F(xiàn)在已經(jīng)在小鼠雜交瘤的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小鼠一大鼠，小鼠一人以及人一人雜交瘤技術(shù)。免疫一般而言，抗原的純度不很重要，特別是免疫原性較強(qiáng)的抗原。免疫程序、劑量和方法是關(guān)系到是否能得到所需要的單克隆抗體的關(guān)鍵之0正常小鼠脾臟含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B淋巴細(xì)胞，一只純種小白鼠估計(jì)能產(chǎn)生1.0X1075.0X107種不同的抗體。因此一只正常的小白鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤融合，只能有千萬(wàn)分之一的機(jī)會(huì)獲得某一種特定抗體。所以為了提高得到某種雜交瘤的機(jī)會(huì)，必須加強(qiáng)免疫，使產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞大量增加。B淋巴細(xì)胞的不

20、同發(fā)育階段對(duì)獲得陽(yáng)性雜交瘤也有很大影響。有人認(rèn)為處在轉(zhuǎn)化時(shí)期的B淋巴細(xì)胞可能更易于融合，而免疫以后78天，雖然是抗體產(chǎn)生的高峰時(shí)期，但形成有活力的雜交瘤細(xì)胞的可能反而減少。故一般認(rèn)為加強(qiáng)免疫后的第三天應(yīng)殺鼠取脾做細(xì)胞融合。1.可溶性抗原（蛋白質(zhì)）以1mg/ml5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐劑乳化，分多點(diǎn)小鼠皮下注射，總量為0.3ml0.6ml,間隔35周再同樣注射一次，10天后，斷尾取血一滴，測(cè)抗體效價(jià)，選滴度高的小鼠做融合試驗(yàn)。一個(gè)月后可以經(jīng)靜脈（尾靜脈）給予無(wú)佐劑抗原0.2ml0.4ml,34天后，殺死小鼠取脾做融合用。.顆粒性抗原如抗原來(lái)源方便，可以不加佐劑而增加免疫次數(shù)，縮短間隔

21、時(shí)間例如用羊紅血球免疫小白鼠，以1%濃度每只皮下注射0.2ml,每周2次，共免疫58次，取脾前3天,再免疫一次即可。有人認(rèn)為最后一次免疫劑量要大,大到近于免疫耐受的程度更好。單克隆抗體技術(shù)：細(xì)胞的選擇脾細(xì)胞材料免疫過(guò)的血活抗體滴度高的Balb/c鼠。1640培養(yǎng)液2.5%FCS-1640營(yíng)養(yǎng)液操作方法拉頸或用CO2處死小白鼠。(1) 將小鼠放于70%灑精中浸泡消蠹，取出固定于板上，在無(wú)菌條件下取脾。把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。(4) 用鑲子輕輕擠壓脾，做成脾細(xì)胞懸液，用毛細(xì)管將懸液移入小試管中。(5) 直立小試管3min,使大塊的結(jié)締組織下沉，把

22、細(xì)胞懸:液移入離心管中。以2.5%FCS1640充滿離心管，并以400g離心7min10min(與此同時(shí)應(yīng)開(kāi)始制備骨髓細(xì)胞)。(7) 把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮。(8) 重復(fù)、步驟。(9) 計(jì)算細(xì)胞，以臺(tái)盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80%為合格。骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細(xì)胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞。選擇骨髓瘤細(xì)胞的條件：該瘤細(xì)胞系的來(lái)源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；骨髓瘤細(xì)胞必須是靜息狀態(tài)，不產(chǎn)生Y球蛋白或不分泌到細(xì)胞外；骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要一個(gè)較

23、高的細(xì)胞密度，最好106個(gè)細(xì)胞/ml;生長(zhǎng)速度快，繁殖時(shí)間短。目前常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株有：S194/5XXO-BU1;SP2/0Ag14（簡(jiǎn)稱SP2）;P2X?Ag8-653（簡(jiǎn)稱653）;FO以653最為常用，它是由礦物油4甲基一15烷（Pristane,降植烷）誘發(fā)出來(lái)的一種漿細(xì)胞瘤（MinerolOilplasmacytoma,MOPC）并經(jīng)過(guò)培育形成一株8-氮鳥(niǎo)喋吟有抵抗力的業(yè)系。骨髓瘤細(xì)胞一般由有關(guān)單位直接引入，保存于-195C液氮罐中，試驗(yàn)時(shí)復(fù)蘇、增殖、傳代即可。由于骨髓瘤細(xì)胞是半貼壁狀態(tài)，很容易脫落，因此不需要胰酶處理。為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，在融合前，可將培養(yǎng)

24、基內(nèi)加入15g/ml8一氮鳥(niǎo)喋吟。取約1X1076X107對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（即培養(yǎng)15h20h）的骨髓瘤細(xì)胞，在室溫離心（400g）10min,沉淀以2.5%FCS1640液再懸浮并計(jì)數(shù)。飼養(yǎng)細(xì)胞在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，單個(gè)的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長(zhǎng)繁殖，加入的細(xì)胞稱之為飼養(yǎng)細(xì)胞（Feedercell）。在細(xì)胞融合和單克隆的選擇過(guò)程中，就是在少量的或單個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上使其生長(zhǎng)繁殖成群體，因此在這一過(guò)程中必須使用飼養(yǎng)細(xì)胞。許多種類的動(dòng)物細(xì)胞都可以做飼養(yǎng)細(xì)胞，如正常的脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、腹腔滲出細(xì)胞等，常選用腹腔滲出細(xì)胞，其中主要是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好

25、處是：一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞，另一方面巨噬細(xì)胞可以吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，為融合細(xì)胞的生長(zhǎng)造成也可以是其他種類的良好的環(huán)境。腹腔細(xì)胞的來(lái)源可以是與骨髓瘤細(xì)胞同系鼠小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。1. 材料(1) 小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若十只。(2) 11.6%蔗糖溶液(經(jīng)10磅30min高壓滅菌)。2. 操作方法(1) 拉頸處死小鼠。(2) 70%灑精浸泡消蠹10min。(3) 用手術(shù)剪將小鼠腹部剪開(kāi)一小口，剝開(kāi)皮膚，露出腹腔。(4) 用注射器將4ml11.6%蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體，加入離心管。(5) 1000r/min離心10min。(6) 取

26、上活，以HAT選擇培養(yǎng)液將細(xì)胞制成懸:液。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，使每毫升含40萬(wàn)個(gè)活細(xì)胞。(7) 以1ml吸管將細(xì)胞種入微量培養(yǎng)血，每孔0.05ml，含2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即可供細(xì)胞融合和克隆化之用。如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量少，則可以在細(xì)胞換液時(shí)再加入一些。單克隆抗體技術(shù)：抗體檢測(cè)用檢測(cè)抗體的方法從雜交細(xì)胞中篩選出生產(chǎn)指定抗體的雜交株是很重要的。檢測(cè)抗體的方法很多，從沉淀反應(yīng)到放射免疫測(cè)定。由于細(xì)胞培養(yǎng)液中的抗體濃度通常是很低的，而且傳統(tǒng)的檢測(cè)方法多是以多價(jià)抗原與多克隆抗血活相反應(yīng)。雜交瘤產(chǎn)生的抗體則是單克隆的，所以并不是每項(xiàng)方法都能適用。一定要選擇敏感的、快速的、

27、一次乂能檢測(cè)多份樣品的方法。常用的檢測(cè)方法如下：1.試管溶血反應(yīng)檢測(cè)法材料：雜交瘤細(xì)胞，換液后至少兩天才收取培養(yǎng)液；綿羊紅血球，洗滌三次后，配成1%懸液；豚鼠補(bǔ)體，無(wú)菌采取補(bǔ)體，以pH7.2PBS稀釋成20%溶液，分裝小瓶，于-40C保存。使用時(shí)以補(bǔ)體和壓積紅血球5:1(V/V)的量進(jìn)行吸收，4C30min,然后2000r/min離心10min,去紅血球，取上活液備用；0.01Mol/LpH7.2PBS液。(1) 操作方法：在小試管中，加入0.1ml雜交瘤細(xì)胞用過(guò)的培養(yǎng)液，再加入0.1mlpH7.2的PBS液，然后倍比稀釋至一定的稀釋度；加入0.1ml補(bǔ)體和1%綿羊紅血球0.1ml,混勻后置3

28、7C水浴1h；觀察結(jié)果，以綿羊紅血球完全溶解的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液的最高稀釋倍數(shù)為抗體的溶血效價(jià)。2.斑點(diǎn)檢測(cè)法抗紅血球表面的單克隆抗體與澆灌在瓊脂板的紅血球結(jié)合，進(jìn)而結(jié)合補(bǔ)體，而發(fā)生溶血斑點(diǎn)，對(duì)著光源用肉眼即可判定。(1)材料：綿羊紅血球，處理同試管法，最后配成25%紅血球懸:液；新鮮豚鼠血活(同試管法處理);瓊脂糖，配成0.6%PBS液，水浴中溶化；0.01Mol/LpH7.2PBS液；兔抗羊紅血球抗體。 （2）操作方法：將溶化的0.6%瓊脂糖倒入一試管中，置45C48C水浴中；加0.1ml25%紅血球懸:液，0.1ml豚鼠補(bǔ)體，迅速混勻，傾注一十凈載玻片上；凝固后，在凝膠表面固定區(qū)域滴加2m

29、l待測(cè)樣品，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血活和對(duì)照試液；待溶液全部滲入凝膠后，置濕盤(pán)；37C溫育1h2h,觀察并判定結(jié)果。強(qiáng)陽(yáng)性（）中等陽(yáng)性（）弱陽(yáng)性（）陰性（-）必要時(shí)可置室溫過(guò)夜，再判定一次。2 .膜熒光檢測(cè)法（1）材料：培養(yǎng)液HEM或RPMI1640;熒光試劑：異硫割酸熒光素（FITC）標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白；50%甘油緩沖液：1份甘油加1份體積0.05Mol/LpH7.2PBS液混合即成；熒光顯微鏡、載玻片、蓋玻片、吸管等。（2）操作方法：用培養(yǎng)液洗滌二次細(xì)胞，懸:浮成2.0X107/ml;50pl細(xì)胞懸液加50l培養(yǎng)上活液混合，置4C30min,用培養(yǎng)液洗滌3次，1000r/min離心；以50HFITC

30、一抗小鼠免疫球蛋白重新懸浮壓積細(xì)胞，水浴30min60min；用冷培養(yǎng)液洗3次細(xì)胞，重新懸?。蝗∫坏渭?xì)胞懸液滴在玻片上，復(fù)蓋片，用甘油緩沖液封固，置熒光顯微鏡下觀察。著色細(xì)胞也可以在固定后觀察，一滴細(xì)胞懸液，涂片、風(fēng)十，用95%灑精固定10min，固定后的載玻片用PBS洗滌，蓋上蓋玻片，進(jìn)行觀察。3 .免疫球蛋白和業(yè)類球蛋白的檢測(cè)以瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)法進(jìn)行，此法簡(jiǎn)單易操作,特異性好。注意必須將培養(yǎng)液濃縮1050倍，否則做雙向瓊擴(kuò)不出現(xiàn)沉淀線。其檢測(cè)方法為：(1) 制備各種兔抗小鼠IgG14、IgM12、IgA12和K、入抗血活，也可直接購(gòu)買(mǎi)。(2) 取5ml培養(yǎng)物的上活液緩慢加入0.5ml的飽和硫

31、酸鉉溶液，混勻，靜置3h,離心沉淀，去上活，沉淀加0.05ml蒸僻水溶解。(3) 制成1%瓊脂糖凝膠板，打孔。中間孔加20l濃縮上活液，周?chē)准?0l特異性抗血活，以10l正常小鼠血活作對(duì)照。也可以采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)以及放射免疫等方法檢測(cè)。單克隆抗體的制備雜交瘤細(xì)胞的大量繁殖克隆化的細(xì)胞可以在體外進(jìn)行大量培養(yǎng)，收集上活液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過(guò)體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限，其不能超過(guò)特定的細(xì)胞濃度，且每天要換培養(yǎng)液。而體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細(xì)胞具有從親代淋巴細(xì)胞得來(lái)的腫瘤細(xì)胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠(無(wú)胸腺的

32、裸鼠)，雜交瘤細(xì)胞就開(kāi)始無(wú)限地繁殖，直至宿主死亡。產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的小鼠腹水和血活中含有大量的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，這種抗體的效價(jià)往往高于培養(yǎng)細(xì)胞上活液的1001000倍。利用免疫抑制劑，如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細(xì)胞血活等，可以加速和促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。材料(1)經(jīng)高壓滅菌的降植烷。(2)Balb/c鼠：58周齡。(2) 雜交瘤細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。(3) RPMI1640培養(yǎng)液1. 新生牛血活操作方法(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后19周內(nèi)種植細(xì)胞。(2) 收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，用5%FCS-1640液洗滌一次,1000r/min離心10min。取樣，用臺(tái)盼蘭染色，計(jì)

33、活細(xì)胞數(shù)，重新用5%FCS1640液配成1.0X107細(xì)胞/ml的懸:液。(4) 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細(xì)胞，每只腹腔注射1ml(含1.0X107個(gè)細(xì)胞/ml)。接種后10天左右時(shí)間腫瘤體積最大，此時(shí)可由腹腔抽取腹水，每隔13天取1次，可取10次。血活可由腋下動(dòng)脈或心臟采血后分離。單克隆抗體的提純(1)20mMol/LpH7.87.9TrisHCl緩沖液20mMol/LNaCl20mMol/LpH7.87.9TrisHCl緩沖液40mMol/LNaCl20mMol/LpH7.87.9TrisHCl緩沖液80mMol/LNaCl20mMol/LpH7.87.9TrisHCl緩沖液飽和硫

34、酸鉉液DEAE一纖維素柱2.操作方法(1) 小鼠腹水用冷PBS液稀釋4倍后，于1.00X105轉(zhuǎn)離心30min,去沉淀。(2) 在4C于上活中緩緩滴加飽和硫酸鉉液，邊加邊攪拌，使溶液最終為50%硫酸鉉濃度。(3) 此溶液置冰中30min60min，然后5000r/min離心10min,去上活。(4) 將沉淀溶于TrisHCl緩沖液(40mMol/LNaCl)中(溶液可能混濁)(5) 裝入透析袋于TrisHCl緩沖液(20mMol/LNaCl)中透析除鹽(6) 離心去沉淀。溶液稀釋(1:100或更局倍稀釋)后，于280nm測(cè)蛋白含量，估計(jì)蛋白質(zhì)含量1A280unit=0.8mg蛋白質(zhì)一般每ml腹水中，含有總蛋白約25mg36mg。(7) 過(guò)DEAE一纖維素柱：纖維素柱高40cm,以20mMol/LNaClTris緩沖液平衡。透析樣品以Tris緩沖液等量稀釋。樣品進(jìn)入柱床速度為1ml2ml/min，以NaCl線形梯度洗脫。大部分單克隆IgG于40mM