基因工程思考題答案

1、第二章1. 名詞解釋(1)順反子(cistron):基因所對應的一段核昔酸序列被稱為順反子(cistron),一個順反子編碼一種完整的多肽鏈。它是遺傳的功能單位。轉位因子(transposableelements):是指可以從染色體基因組上的位置轉移到另一個位置，甚至在不同的染色體之間躍遷的基因成分。(3) 基因組(genome：細胞中，一套完整單倍體的遺傳物質的總合。啟動子(promoter):是DN曜上一段能與RNAit合酶結合并能起始轉錄的序列，其大小不等，具有轉錄目標基因的mRNA勺功能。啟動子是基因表達不可缺少的重要元件?；?gene)，基因是DNA#子中含有特定遺傳信息的一段核昔

2、酸序列，是遺傳物質的最小功能單位。(4) 順反子(cistron):基因所對應的一段核昔酸序列被稱為順反子(cistron),一個順反子編碼一種完整的多肽鏈。它是遺傳的功能單位。終止子(terminator)，在基因3端下游外側與終止密碼子相鄰的一段非編碼的核昔酸短序列，具有終止轉錄的功能，叫做終止子(terminator)。斷裂基因(splitgene),真核生物的結構基因是不連續(xù)的，編碼氨基酸的序列被非編碼序列所打斷，因而被稱為斷裂基因(splitgene)。在編碼序列之間的序列稱為內(nèi)含子(intron),被分隔開的編碼序列稱為夕卜顯子(exon)0順式作用元件(cis-actingele

3、ments),指那些與結構基因表達調控相關、能夠被基因調控蛋白特異性識別和結合的DN海列。包括啟動子、上游啟動子元件、增強子、加尾信號和一些反應元件等。反式作用因子(trans-actingelements),可結合順式作用元件而調節(jié)基因轉錄活性的蛋白質因子稱為反式作用因子(trans-actingelements)。(13) 反應元件(responseelements),是一類能介導基因對細胞外的某種信號產(chǎn)生反應的DNA列，被稱為反應元件(responseelements)。(14) 增強子(enhancer)，是一段DNA序列，其中含有多個能被反式作用因子識別與結合的順式作用元件，反應作用

4、因子與這些元件結合后能夠調控(通常為增強)鄰近基因的轉錄。(15) 轉位因子(transposableelements):是指可以從染色體基因組上的位置轉移到另一個位置，甚至在不同的染色體之間躍遷的基因成分。轉座子(transposon,Tn),是一類較大的可移動成分，它是由幾個基因組成的特定的DNA>t段，除有關轉座的基因外，至少帶有一個與轉座作用無關并決定宿主性狀的基因(如抗藥性基因)。(16) 假基因(pseudogene)，假基因是多基因家族中的成員，因其堿基順序發(fā)生某些突變而失去功能，不能表達或表達異常，生成無生物活性的多肽。(17) 重疊基因(overlappinggenes

5、)，或嵌套基因(nestedgenes),是指基因的核昔酸序列(或閱讀框)是彼此重疊的基因，稱為重疊基因或嵌套基因。(18) 基因家族(genefamily),就是指核背酸序列或編碼產(chǎn)物的結構具有一定程度同源性的一組基因。(19) 反向重復序列，是指兩個順序相同的拷貝在DNAS上呈反向排列。有兩種形式，一種形式是兩個反向排列的拷貝之間隔著一段間隔序列；另一種形式是兩個拷貝反向串聯(lián)在一起，中間沒有間隔序列，這種結構亦稱回文結構(palindrome)。(20) 看家基因(housekeepinggene),在幾乎所有細胞中或發(fā)育過程中持續(xù)表達的基因，被稱為看家基因。鋅指(zincfingers)

6、結構，由約30個氨基酸殘基組成的一段多肽序列，其中4個氨基酸殘基(兩個是半脫氨酸兩個是組氨酸，或4個都是半脫氨酸)以配位鍵與Zn?相互結合，形成指狀結構，常存在于真核轉錄因子的DNA結合結構域中。亮氨酸拉鏈(leucinezippers)，是指在一段肽鏈中每隔7個氨基酸殘基就有一個亮氨酸殘基，這段肽鏈所形成的以-螺旋就會出現(xiàn)一個由亮氨酸殘基組成的疏水面，而另一面則是由親水性氨基酸殘基所構成的親水面。由亮氨酸殘基組成的疏水面即為亮氨酸拉鏈條，兩個具有亮氨酸拉鏈條的反式作用因子，能借疏水作用形成二聚體。(21) 基因重排(generearangement),是指某些基因片段改變原來存在順序，通過調

7、整有關基因片段的銜接順序，重新組成為一個完整的轉錄單位。RN漏輯(RNAediting),是一種較為獨特的遺傳信息加工的方式，即轉錄后的mRN成編碼區(qū)發(fā)生核昔酸改變的現(xiàn)象，是在RNA分子上出現(xiàn)的一種修飾現(xiàn)象（26）分子伴侶（molecularchaperone）,是指能幫助新生肽鏈折疊，使之成為成熟蛋白質，但本身并不參與共價反應的物質，大部分為蛋白質。DNasel超敏位點（hypersensitivesite）:染色體DNA中轉錄較為活躍的區(qū)域，組蛋白相對缺乏，并對核酸酶（DNasel）高度敏感，故名。2. 簡述乳糖操縱子中CAP的正性調節(jié)作用機制。降解物基因活化蛋白（catabolitege

8、neactivationprotein,CAP是一種同二聚體，其分子內(nèi)有DNA結合區(qū)和cAMP結合位點。CAP與cAMP結合形成復合物才能刺激操縱子結構基因的轉錄。當葡萄糖濃度低時，會使cAM咻度升高，形成cAMP-CAF®合物，并與啟動子上游的CAPM點結合，刺激RNA聚合酶的轉錄作用，使轉錄效率提高50倍，然而這種作用的前提條件是無阻遏效應存在。當葡萄糖濃度較高時，cAMP度降低，cAMP與CAU吉合受阻，轉錄效率下降，由此可見，乳糖操縱子結構基因的高表達既需要有誘導劑的存在（消除阻遏效應），又要求無葡萄糖或低濃度葡萄糖的條件（促進cAMP-CAF®合物的形成，刺激轉錄

9、）。3. 比較原核基因組與真核基因組的結構與功能特點1原核生物基因組僅由一條環(huán)狀雙鏈DN附子組成，含有1個復制起點，無染色體結構，基因的轉錄和翻譯在同一區(qū)域進行。1.多條染色體，兩份同源的基因組，而原核生物的基因組則是單拷貝的。基因組龐大、復雜，具有許多復制起點，每個復制子大小不一。2.具有操縱子結構這是原核基因組的一個突出的結構特點。2.無明顯操縱子結構，存在大量反式作用因子與賦作用元件的相互作用調節(jié)3.編碼曾基因組中約占50%編碼順序不重疊，其轉錄產(chǎn)物多為多順反子結構。3.非編碼的順序占絕大部分，約占90恕上?；蚪M中非編碼的順序所占比例是真核生物與細菌、病毒的重要區(qū)別。4.多順反子結構，

10、無內(nèi)含子，是連續(xù)的，因此轉錄后不需要剪切。4.單順反子結構，即一分子mRNA只目匕翻洋成種蛋白質。存在斷裂基因。5.基因組中重復序列很少5.含有大量重復順序，這是真核生物基因組的重要特點。6.存在移動基因，包括插入序列和轉座子6肩基因家族，功能相關的基因構成各種基因家族，它們可串聯(lián)在f,亦可相距很遠。4. 簡述真核表達調控的主要環(huán)節(jié)和調控方式。（一）DNM平的調控：（1）染色質結構對基因表達的調控作用，（2）基因修飾，（3）基因重排，（4）基因擴增。（二）轉錄水平的調控（轉錄起始的調控）（1）反式作用因子的活性調節(jié)；（2）反式作用因子與順式元件的結合；（3）反式作用因子的組合式調控作用（三）轉

11、錄后水平調控（1）“加帽”和“加尾”的調控；（2）mRNAfe擇性剪接對表達的調控；（3）RN遍輯的調控；（4）mRNA專運調節(jié)（四）翻譯水平的調控（1）翻譯起始調控；（2）mRNAB定性對翻譯的影響（五）翻譯后水平的調控（1）信號肽的切除；（2）新生肽鏈的修飾；（3）肽鏈的剪接與正確折疊第三章核酸分離純化應注意哪些事項？一般的分離純化分為哪些步驟？各步的要點是什么？分離純化核酸應注意：應保證核酸一級結構的完整性，防止降解；排除其它分子的污染。為了保證核酸結構與功能的研究，完整的一級結構是最基本的要求，因為遺傳信息全部貯存在一級結構之內(nèi)。保持核酸的完整性，即保持其天然狀態(tài)。細胞內(nèi)的核酸酶活力很

12、高，在制取過程中必須防止核酸酶對核酸的降解。防止化學因素（酸堿等）和物理因素（高溫或機械剪切等）引起核酸變性或破壞。制備RNA要特別注意防止核酸酶的作用，因為RNase分布很廣，活力很高；而對DNAS重要的是防止張力剪切作用，因為DNA子子特別長，容易斷裂。核酸的純化：首先是去除蛋白質。要點：從細胞裂解液等復雜的分子混合物中純化核酸，要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質后，再用有機溶劑抽提。從核酸溶液中去除蛋白質常用酚/氯仿抽提法，在氯仿中加入少許異戊醇的目的在于減少蛋白質變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。用氯仿抽提處理，去除核酸溶液中的痕量酚。要點：如果下一步驟中酶反應的條件要求嚴格，最可靠的方法是

13、再用水飽和的乙醍抽提一次，以徹底去除核酸樣品中的痕量酚與氯仿，然后在68C水浴中放置10分鐘使痕量乙醍蒸發(fā)掉。6.PCR反應的基本原理是什么？每個循環(huán)包括哪些步驟？有何應用價值？PCRS應的基本原理：首先是雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下加熱時便會分離成兩條單鏈的DN陽子，然后DN麻合酶以單鏈DNA為模板并利用反應混合物中的四種脫氧核昔三磷酸（dNTP©合成新生的DNA互補鏈。此外，DNA聚合酶同樣需要有一小段單鏈DNA啟動（“引導”）新鏈的合成。每一個溫度循環(huán)周期均是由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等三個步驟組成。應用價值：PCR技術不僅可以用來擴增與分離目的基因，而且在臨床醫(yī)療診斷

14、、胎兒性別鑒定、癌癥治療的監(jiān)控、基因突變與檢測、分子進化研究，以及法醫(yī)學等諸多領域都有著重要的應用。9.PCR的引物設計應遵守哪些原則？如何對體系反應條件按優(yōu)化？原則：PCR引物合成的DNA段通常長1525堿基，其中EC約占50%在設計時必須特別注意引物之間不能互配形成雙鏈結構，引物內(nèi)部也不能形成發(fā)夾結構。引物的3'末端必須與目的片段完全相配。引物的5'末端可以不與目的片段互補，可以包含內(nèi)切酶位點或啟動子序列，但在下一輪反應中，這些序列會被同樣合成。有時在擴增僅知其表達產(chǎn)物的目的片段時，可以在引物中設計成簡并密碼子。體系反應條件按優(yōu)化：首先是使模板DNAW離成為單鏈，這個過程可

15、以通過加熱完成，在9095C條件下，根據(jù)模板DNAM雜程度，調整變性溫度和時間。一般情況下選擇94C,30秒可使各種復雜的DNA分子完全變性。過高溫度或高溫持續(xù)時間過長，會對TaqDN麻合酶活性和dNTP分子造成損害。變性后的DNAffl速冷卻至4060C,可使引物和模板DNA發(fā)生結合。復性溫度的選擇，可以根據(jù)引物的長度及其G+C含量確定。長度在1525bp之間時，引物的退火溫度可通過Tm=4(G+C+2(A+T)計算得到。PC板應的延伸溫度建議選擇的7075C之間，此時，TaqDNA聚合酶具有最高活性。當引物在16個核昔酸以下時，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。此時，可采用使反應溫度緩

16、慢升高到7075C的方法。PCR延伸反應的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1kb以內(nèi)的片段，延伸時間1分鐘即可；擴增片段在1kb以上則需加長延伸時間。其他參數(shù)選定后，PCR®環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA勺濃度。理論上2025次循環(huán)之后，PCRT物的積累即可達到最大值，實際操作中因此不管模板濃度是多少，2030次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。10.解釋以下名詞：反向PCR不對稱PCR反轉錄PCR多重PCR反向PCR:用于擴增位于靶DN職段之外的兩側的未知DNAff列。不對稱PCR可用于制備單鏈模板DNA這種方法除了使用的兩種引物濃度相差100倍之外，其它方面與標準的PCR并沒有本質的區(qū)別。

17、反轉錄PCR用于擴增被反轉錄成cDN快式的特定RNAf列。多重PCR技術：即在同一試管中加入多對引物，擴增同一模板的幾個區(qū)域。12.簡述核酸雜交的基本過程，核酸印跡轉膜有哪些方法？核酸雜交的基本過程：將核酸從細胞中分離純化后，在體外與探針雜交，或直接在細胞內(nèi)進行雜交的過程。核酸印跡轉膜有：Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、斑點雜交及狹縫印跡雜交。第四章1、什么是DNA限制性內(nèi)切酶；基因工程中常用的是哪種類型，如何命名？答：DNA限制性內(nèi)切酶：是能識別并切割雙鏈DNAf列內(nèi)部特定核昔酸序列的DNM解酶。它可以將外源DN醐斷，從而限制外源DNA勺侵入并使之失去活力，但對自身的DN

18、A卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進行的，故名限制性內(nèi)切酶（簡稱限制酶）。基因工程中常用的是II型限制性內(nèi)切酶。人們使用限制性內(nèi)切酶寄主菌的種屬名稱，來命名限制性內(nèi)切酶，即以微生物屬名第1字母（大寫）和種名前兩字母（小寫）寫成斜體三字母，例如，大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示。菌株名以非斜體在此三字母后，若菌株有幾種不同限制性內(nèi)切酶時，則以羅馬字母區(qū)分，如Hindi、Hind"、Hindm等等。4、利用逆轉錄酶和mRN/板合成cDNA勺主要步驟是什么？答：（1）以具有poly（A）結構的mRN敝模板，并以12-18

19、個堿基長的多聚胸腺密嚏寡核昔酸oligo（d片段作引物，在逆轉錄酶的5'-3'聚合酶活性催化下，合成出與模版mRNA勺單鏈互補的cDNA鏈。具有poly（A）結構的mRN扉采用一定的抽提方法從生物體內(nèi)分離純化而來，在mRN庫鏈的3'端是由一連串堿基A組成的多腺喋吟尾巴。胸腺口密嚏可以與腺喋吟配對互補，所以采用oligo(d!做引物，與mRNA3端的poly(A)尾巴結合。(2)堿水解法除去mRN膜板之后，單鏈cDNA能夠自我折疊形成發(fā)夾環(huán)結構，折疊的短鏈即成為第二條cDNA鏈合成的引物，反轉錄酶或Klenow酶就可催化第二條鏈cDNA合成。(3)采用SI核酸酶消化法，除

20、去單鏈區(qū)的發(fā)夾環(huán)結構，就可將獲得完整的DNA子。6、為什么通過堿性磷酸酶處理可以防止質粒載體DNA自連的作用？答：堿性磷酸酶可催化除去DNARNA勺5'磷酸基團。堿性磷酸酶處理過的DNA片段缺少連接酶所要求的5'磷酸末端，因此它們不能進行自我連接。在質粒載體與外源DNA1接構建重組質粒時，使用堿性磷酸酶處理酶切過的質粒，可以降低載體DNA的自連。1. 第五章以pBR322為例，論述質粒載體必須具備哪些條件？(1) 具有復制起點，在宿主細胞中能自主復制。(2) 帶有盡可能多的單一限制性酶切位點，以供外源DNAt段定點插入。(3) 具有合適的選擇標記基因，為宿主細胞提供易于檢測的表

21、型特征。(4) 具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。2. 試述入噬菌體載體是如何進行構建的？(1) 去除入DN用E必需區(qū)，增加承載外源DNAt段的容量。去除多余的限制酶切割位點，確定12個單酶切位點作為克隆位點。(2) 入DNA的非必需區(qū)組入選擇標記基因，以方便對重組子進行篩選。(3) 建立重組的入DNA分子的體外包裝系統(tǒng)，高效的感染受體細胞。5. 簡述表達載體需要哪些基本元件？各有什么作用？在克隆載體的基礎上，表達載體的構成特別強調與表達強弱相關的構成元件如啟動子、終止子、核糖體結合位點等。啟動子：啟動子位于轉錄起始點上游，是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRN給成的序列，是啟動基因

22、轉錄所必需的一段DNA順式調控元件。沒有啟動子，基因就不能轉錄。終止子：在一個基因的3'端或是一個操縱子的3'端往往還有一特定的核昔酸序列，它有終止轉錄的功能，這一DNA序列稱為轉錄終止子(terminator)。在構建表達載體時，為了防止由于克隆的外源基因的表達干擾了載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性，一般都在多克隆位點的下游插入一段很強的核糖體RNA勺轉錄終止子。(1) 核糖體結合位點：核糖體(rRN3是蛋白質合成的場所，mRNAT效地翻譯依賴于mRNA勺穩(wěn)定性及其與核糖體結合的能力。6. 論述雙元載體的概念及構建原理。雙元表達載體由2個分別含有T-DN倚口Vir區(qū)的相容性突變Ti質粒構成，

23、即微型Ti質粒(min-Tiplasmid)和輔助Ti質粒(helperTiplasmid)。利用二元載體進行遺傳轉化時，首先要將外源基因構建到微型Ti質粒上，再將微型Ti質粒轉入含有輔助Ti質粒的土壤農(nóng)癌桿菌菌株中，用該菌株侵染植物組織，含目的基因的T-DNA可整合到植物基因組中。雙元載體不僅構建方便，而且其T-DNA整合進入植物細胞不需要帶進許多冗余DNA序列，轉化效率高于一兀載體。第六章1、克隆基因的方式有哪些？目前基因克隆的手段多種多樣，概括起來主要包括兩種策略：一種是構建大容量或者經(jīng)特定手段優(yōu)化的基因文庫，然后利用一定的篩選方法從中分離、鑒定出需要進行研究的目的基因；另外一種策略是在

24、基因序列已知的基礎上，通過PCFT增、改造或者人工化學合成的方法獲得目的基因。目前幾種常見的基因克隆手段，如基因組DNA文庫、cDNA文庫、PCFT增法、人工化學合成法、差異克隆技術等。2、試述基因組文庫的構建流程及其影響因素。構建流程一般來說，構建基因組文庫的基本步驟有五步：高分子量DNA的制備；外源DNA>t段與載體分子的重組；重組載體轉化受體細胞；陽性克隆的挑選；基因組文庫的評價和鑒定。影響因素（1）載體的種類與質量；（2）高分子量的染色體DNA勺獲得；（3）避免DNA的降解；（4）選用的限制性核酸內(nèi)切酶對基因組DNA的切割頻率及酶切反應條件。；（5）插入DNA段的大小；（6）插入

25、DNA>t段與載體的比例；（7）DNA勺總濃度；（8）連接的溫度3、用于擴增基因的PCR法有哪些？各有什么特點？(1) RT-PC磋，是一種從細胞mRN呼高效擴增cDNAf列的方法，它將反轉錄與PCRT增技術相結合。(2) 反向PCR用于擴增已知目的基因序列側翼的DNAt段，即根據(jù)已知的目的基因DNAff列設計引物，以已知序列和未知序列的環(huán)化DNA分子為模板來擴增未知DNAff列。(3) 錨定PCR是一種根據(jù)已知目的基因的一小段序列信息來快速擴增已知序列上游或下游片段的技術。連接介導的PCR在只知道DNA-端的序列的情況下，能夠對未知的一端序列進行測序和對體內(nèi)甲基化圖譜或DNAEP跡進行

26、分析。(4) 盒式PCR盒式PC河特異性地擴增cDNA或基因組DNA±的未知區(qū)域。(5) RACE是一種通過反轉錄和PC瞰術進行cDN麻端快速擴增，得到基因轉錄本的未知序列，從而獲得mRNAE整序列的一種方法。4、什么是cDN8庫？它的基本構建流程是怎樣的？以mRN的模板，在體外經(jīng)逆轉錄酶催化反轉錄成cDNA與適當載體連接后轉化受體菌并繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRN>e息的cDNA隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫?；緲嫿鞒蹋阂话銇碚f，構建cDNA文庫的基本步驟有五步：制備mRNA第一鏈cDNA合成；第二鏈cDNA的合成；雙鏈cDNA的修飾及克?。粚嫿ǖ腸DNA文庫進

27、行鑒定，測定文庫的代表性以及重組cDNA片段的序列完整性。7、人工合成長片段基因的方法有哪些?長片段基因的合成，通常的策略是將需要合成的基因分成若干個相互重疊的片段，先利用化學合成法分別合成這些小片段，然后讓這些片段退火配對，最后利用連接酶和聚合酶將這些片段連接成完整的基因序列。包括退火-連接法、多步退火-延伸-連接法和由內(nèi)向外多步退火-延伸合成法。12、轉化后對重組子進行篩選的方法有哪些？重組子的篩選方法多種多樣，是由載體的類型、插入DNA>t段大小和性質，以及受體細胞的遺傳特性等的不同決定的。主要包括兩類：一、依據(jù)載體的選擇性標記對轉化子進行初步篩選，包括抗藥性篩選法、顯色篩選法、營

28、養(yǎng)缺陷型篩選法和噬菌斑篩選法。二、菌落原位雜交法14、對DNA&行定點突變的方法有哪些？DNAS點突變的方法分為兩大類。第一類是基于PCR的點突變，包括重疊延伸PCR法、大引物PCR法、特殊位置堿基的定點突變和擴增環(huán)狀質粒全長的突變。第二類是不依賴于PCR勺定點誘變方法，包括盒式誘變、寡核昔酸介導的誘變和Kunkel法第七章1.什么是RBSRBSffi基因表達中有何作用？RBS,即核糖體結合位點，是指緊靠啟動子下游的，從轉錄起始位點開始延伸幾十個堿基長度的一段序列，翻譯起始密碼子AUGffi常位于它的中心位置，是核糖體RNAiM別與結合的位點。作用：SD序列是翻譯起始密碼子（AUG上游

29、5-13個核昔酸處的一段富含喋吟UAAGGAGGU:部或者其中的一部分序列，在翻譯起始階段與核糖體小亞基16SrRNA的3'端相互作用，以正確定位起始密碼子。2.外源基因在原核生物中表達時，蛋白質的存在形式有哪些？各有什么優(yōu)缺點？ 包涵體表達：優(yōu)點：包涵體的形成有利于防止宿主蛋白酶對表達蛋白的降解。缺點：包涵體形成后，表達蛋白不具有生物活性，因此必須溶解包涵體并對表達蛋白進行復性；另外，由于表達產(chǎn)物形成包涵體，負責水解起始密碼子編碼的甲硫氨酸的水解酶，不能對所有的表達蛋白質都起作用，這樣就可能產(chǎn)生N-末端帶有甲硫氨酸的目的蛋白質的衍生物，而非生物體內(nèi)的天然蛋白，這可能會對某些蛋白質的性

30、質產(chǎn)生影響。分泌型表達：優(yōu)點：簡化了發(fā)酵后處理的純化工藝；減少了外源蛋白在細胞內(nèi)被蛋白酶降解的幾率；通過對分泌表達的設計有利于形成正確的空間構象，獲得有較好生物學活性或免疫原性的蛋白質。 融合型表達：優(yōu)點：能以較高的效率進行，因為受體菌自身蛋白基因的SD序列和堿基組成等有利于基因的表達。外源蛋白以融合蛋白的方式表達時易于分離分離純化，可根據(jù)受體菌蛋白的結構和功能特點，利用受體菌蛋白的特異性抗體、配體或底物親和層析等技術分離純化融合蛋白，然后通過蛋白酶水解或化學法特異性裂解受體菌蛋白與外源蛋白之間的肽鍵，獲得純化的外源蛋白產(chǎn)物。3. 分離純化基因工程菌的表達產(chǎn)物策略的制定要考慮哪些因素？表達系統(tǒng)

31、的影響；表達產(chǎn)物性質的影響；初始物料、雜質等因素的影響；生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)條件的影響。分離純化基因表達產(chǎn)物的過程一般包括哪些步驟？各有哪些細節(jié)需要注息？一般都包括對發(fā)酵液進行預處理、回收菌體、細胞破碎、離心分離、樣品的濃縮與預處理、柱層析和電泳等步驟。 發(fā)酵液的預處理：主要包括改變發(fā)酵液物理性狀（如加熱、調節(jié)pH值、絮凝等）以及改善固液分離特性（通過過濾等方法實現(xiàn)固液分離）兩類方法,根據(jù)被分離物質的性質可選擇某一種或者其中的幾種方法相結合使用。 細胞分離：通過原核細胞培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)液，無論目標蛋白位于細胞內(nèi)還是被分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，首先都應該將細胞與培養(yǎng)液進行分離，一般通過離心沉降或者過濾的方

32、式進行分離。 細胞破碎：對于在胞內(nèi)表達的蛋白質，將細胞與液態(tài)相分離后，就要考慮將細胞破碎，以使目標蛋白質從胞內(nèi)釋放到提取液中，然后進行目的產(chǎn)物的純化。 離心分離：高速離心的離心力一般在10000g的范圍以內(nèi)，主要用來去除未破碎的細胞和細胞壁碎片等。如果基因表達產(chǎn)物是小分子可溶性蛋白，還可以進行超速離心（100000g以上）以除去細胞膜碎片等雜質。 柱層析：根據(jù)蛋白質的不同用途，需要對表達的特異性蛋白質進行進一步的分離純化。 親和層析：是利用固定化配基與目的蛋白質之間特異的生物親和力進行吸附，如抗原與抗體、受體與激素、酶與底物或抑制劑、操縱基因與阻遏蛋白、凝集素與糖類以及核酸與有關蛋白之間的結合

33、。 電泳：蛋白質電泳通常采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE。PAGET分為Native-PAGE和SDS-PAGEM種，前者主要用于不能變性的表達蛋白的分離與純化，后者則用于可通過變性的方法作進一步純化的特異性表達蛋白。該電泳純的樣品可用來進行氨基酸序列分析、免疫學分析和醫(yī)學研究等。4. 重組質粒發(fā)生逃逸的原因有哪些？ 重組質粒在細胞分裂時不均勻分配，造成受體菌種所含的重組質?？截悢?shù)存在差異； 來自受體細胞的遺傳影響； 重組質粒所攜帶的外源基因過度表達，抑制了受體細胞的正常生長，以致原來體系中數(shù)目極少的不含重組質粒的菌體經(jīng)過若干代繁殖后在數(shù)量上占據(jù)優(yōu)勢； 重組質粒因種種原因被受體細胞分泌運輸至胞

34、外，這種情況多發(fā)生在細菌處于高溫或含表面活性劑（如SDS、某些藥物（如利福平）以及染料（如聽嚏類）的環(huán)境中。第八章1對作為表達目標蛋白宿主的酵母細胞有什么基本要求？ 答：對作為表達目標蛋白宿主的酵母細胞的基本要求是安全無毒，沒有致病性。遺傳背景清楚，容易進行遺傳操作。外源DNA容易導入宿主細胞，轉化效率高。培養(yǎng)條件簡單，容易進行高密度發(fā)酵。有較強的蛋白質分泌能力。有類似高等真核生物的蛋白質翻譯后的修飾加工能力。2什么叫穿梭載體？指出酵母穿梭表達載體pYES2每個元件的功能。答：穿梭表達載體是由來自酵母的部分核酸序列和細菌的部分核酸序列所組成，其原核部分主要包括可以在大腸桿菌中復制的起點序列（O

35、ri）和特定的抗生素抗性基因序列，這兩個部分主要是作為在大腸桿菌宿主時增殖和篩選組分。酵母部分包括酵母轉化子的篩選組分，主要是與宿主互補的營養(yǎng)缺陷型基因序列（如：HIS4基因序列）或特定的抗生素抗性基因序列（如：抗Zeoein的基因序列），以及編碼特定蛋白的基因啟動子和終止子序列。pYES2每個元件的功能:2mori:酵母細胞復制起點，URA3酵母細胞尿口密嚏營養(yǎng)篩選標記；Amp氨節(jié)青霉素抗性篩選標記；PUCori:大腸桿菌復制起點；CYCTTCYC基因加尾信號；Pgal1:gal基因啟動子；f1ori:f1噬菌體復制起點。3提高外源基因在酵母中的表達水平，考慮從哪些方面入手？答：為提高外源基

36、因在酵母中的表達水平，可以考慮從以下方面入手：一、轉錄水平控制外源基因在酵母中的表達和基因的轉錄水平有密切的關系，篩選高效的啟動子就顯得十分重要，強啟動子還可以表達多種基因。二、表達載體的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性表達載體在細胞中的拷貝數(shù)對外源基因在酵母中的表達有明顯的影響。釀酒酵母和其他一些酵母有多拷貝的內(nèi)源質粒，以這類質粒為基礎可以建成高拷貝質粒表達載體。三、其他因素還有一些因素應該考慮，其中包括采取提高翻譯效率的措施，如：優(yōu)化翻譯起始區(qū)前后mRNA勺二級結構，在外源基因中盡量選用酵母偏愛的密碼子等；避免表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的降解；選擇或改造宿主，如：采用二倍體宿主、采用釀酒酵母以外的酵母菌作為宿主；優(yōu)化

37、工程菌發(fā)酵工藝，如：提高發(fā)酵密度、控制發(fā)酵階段和發(fā)酵時間等等。四、酵母表達系統(tǒng)的新的應用方向近年來，酵母表達系統(tǒng)除了用來高效表達外源基因，獲得基因工程產(chǎn)品外，還開辟了一些新的應用方向。（1）.用于人類基因組研究。（2）.用于分析蛋白質相互作用。（3）.用于蛋白質、藥物、抗體等的快速篩選。第九章1動物細胞表達系統(tǒng)中常用的表達載體有哪些？答案：根據(jù)載體進入宿主細胞的方式，可將表達載體分為病毒載體與質粒載體。其中病毒載體有逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒載體等。質粒載體又分為整合型和附加體型載體兩類。整合型載體無復制能力，需整合于宿主細胞染色體內(nèi)方能穩(wěn)定存在；而附加體型載體則是在細胞內(nèi)以染色體外可自我復制的附加體形式存在。4什么是轉基因動物？答案：轉基因動物是指由于外源DNA導入（包括同一物種的DNA動物的基因組而產(chǎn)生了可以遺傳的改變的動物。這些可以遺傳的改變包括：外源DNA片段至少整合到一條染色體的一個位點上；外源DNA勺插入使基因組中任何一個基因的結構發(fā)生改變；外源DNA勺插入使染色體發(fā)生重排；導入可以持久