第四章基因工程載體

1、vectors在基因工程操作中，把能攜帶外源在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體進(jìn)入受體細(xì)胞的細(xì)胞的DNA分子分子叫載體。叫載體。廣義上通常把能攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運廣義上通常把能攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運載工具叫載體。載工具叫載體。（1）具有對受體細(xì)胞的）具有對受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性可轉(zhuǎn)移性，可提高載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的，可提高載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的效率。效率。（2）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制原點復(fù)制原點或或整合位點整合位點，使得，使得外源基因可在受體細(xì)胞中大量繁殖或穩(wěn)定遺傳。外源基因可在受體細(xì)胞中大量繁殖或穩(wěn)定遺傳。（3）具有）具有多種單一的核酸酶切位點

2、多種單一的核酸酶切位點(多克隆位點多克隆位點)，可用于外源可用于外源基因的插入，同時不影響載體的擴增和繁殖?；虻牟迦?，同時不影響載體的擴增和繁殖。（4）具有合適的選擇標(biāo)記，便于重組）具有合適的選擇標(biāo)記，便于重組DNA分子的檢測。分子的檢測。（5）具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移，避免基因的非控制性）具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移，避免基因的非控制性擴散，給人類造成危害擴散，給人類造成危害 基因工程中基因工程中常用常用的載體有的載體有5類：類： 質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid） 單鏈單鏈DNA噬菌體噬菌體M13 噬菌體的衍生物噬菌體的衍生物 柯斯質(zhì)粒（柯斯質(zhì)粒（cosmid） 動物病毒（動物病毒（v

3、irus） 來源來源功能功能克隆載體克隆載體: 克隆一個基因或克隆一個基因或DNA片段片段表達(dá)載體表達(dá)載體: 用于一個基因的蛋白表達(dá)用于一個基因的蛋白表達(dá)整合載體整合載體: 把一個基因插入到染色體組中把一個基因插入到染色體組中一、質(zhì)粒（一、質(zhì)粒（plasmid） 是獨立于染色體以外的能自主復(fù)制的是獨立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。分子。存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。（1）分子小：）分子?。?1500 kb（2）編碼基因少：）編碼基因少： 23個中等大小的蛋白質(zhì)。個中等大小的蛋白質(zhì)。 （3）環(huán)形狀：）環(huán)形狀：雙鏈環(huán)狀雙

4、鏈環(huán)狀DNA。（酵母的（酵母的“殺傷質(zhì)粒殺傷質(zhì)?！笔鞘荝NA,編碼毒性糖蛋白編碼毒性糖蛋白）。）。如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細(xì)菌如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細(xì)菌一些額外的特性（非必須）。一些額外的特性（非必須）。 共價閉合環(huán)狀共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA)呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（super coil）Covalent close circular DNA 線形線形DNA （ linear ，lDNA）一條鏈上有一至數(shù)個缺口。一條鏈上有一至數(shù)個缺口。同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：型電泳遷移率不同：scDNA最快、最快、l DN

5、A次之、次之、ocDNA最慢。最慢。SCOCL超螺旋質(zhì)粒超螺旋質(zhì)粒開環(huán)和線性質(zhì)粒開環(huán)和線性質(zhì)粒染色體染色體DNA加入加入EB加入加入EB結(jié)合結(jié)合EB少少結(jié)合結(jié)合EB多多緊密密度高緊密密度高松散密度低松散密度低密度梯度離心分離密度梯度離心分離在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為：在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為： 接合型質(zhì)粒接合型質(zhì)粒:非接合型質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒能自我轉(zhuǎn)移能自我轉(zhuǎn)移不能自我轉(zhuǎn)移不能自我轉(zhuǎn)移1、依據(jù)質(zhì)粒自身傳遞的性質(zhì)分類、依據(jù)質(zhì)粒自身傳遞的性質(zhì)分類除了帶有自我除了帶有自我復(fù)制復(fù)制所必需的遺傳信息外所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌還帶有一套控制細(xì)菌配對配對和質(zhì)粒和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)接合轉(zhuǎn)移移的基因。的

6、基因。如：如：F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或F因子）：因子）：甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。又叫又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒。不符合基因工程的安全要求。不符合基因工程的安全要求。雖然帶有自我雖然帶有自我復(fù)制復(fù)制所必需的遺傳信息，但失所必需的遺傳信息，但失去了控制去了控制細(xì)菌配對細(xì)菌配對和和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，的基因，因此不能從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。因此不能從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。（1）R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）：質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）：帶有一種或數(shù)種帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基

7、因抗生素抗性基因，使寄主獲，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（得同樣的抗生素抗性性狀（resistance）。）。符合基因工程的安全要求。符合基因工程的安全要求?；前钒逼S青霉素卡那霉素四環(huán)素鏈環(huán)素汞鹽抗性帶有控制帶有控制大腸桿菌素（大腸桿菌素（colicin）合合成的基因。成的基因。大腸桿菌素對不帶大腸桿菌素對不帶Col質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。Col質(zhì)?；蛸|(zhì)?；騌質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，也可以成為接合型質(zhì)粒。也可以成為接合型質(zhì)粒。2、依據(jù)可否引起宿主細(xì)胞出現(xiàn)新性狀分類、依據(jù)可否引起宿主細(xì)胞出現(xiàn)新性狀分類顯性質(zhì)粒顯性質(zhì)粒:宿主細(xì)胞由于含有宿主細(xì)胞由于含有質(zhì)粒而獲

8、得新性狀質(zhì)粒而獲得新性狀隱蔽質(zhì)粒隱蔽質(zhì)粒:宿主細(xì)胞含有此類質(zhì)粒而無異樣性狀宿主細(xì)胞含有此類質(zhì)粒而無異樣性狀隱蔽是因為受檢測的手段的限制，而不能觀測到新性狀隱蔽是因為受檢測的手段的限制，而不能觀測到新性狀A(yù). 嚴(yán)緊型質(zhì)粒（嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent plasmid）拷貝數(shù)少拷貝數(shù)少，只有，只有13份拷貝。份拷貝。B. 松弛型質(zhì)粒（松弛型質(zhì)粒（relaxed plasmid）拷貝數(shù)多拷貝數(shù)多，有，有1060份拷貝。份拷貝。（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）。（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）。（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。3、依據(jù)質(zhì)粒的復(fù)制

9、特性分類、依據(jù)質(zhì)粒的復(fù)制特性分類親緣關(guān)系密切的質(zhì)粒一般屬于不親和性質(zhì)粒，如野生型質(zhì)粒與其衍生的重組質(zhì)粒往往屬于不親和性質(zhì)粒。 （攘外必先安內(nèi)） 不同質(zhì)粒有的可共存于同一細(xì)胞之中，但有的不行。把能同寓于一細(xì)胞中的不同質(zhì)粒稱為親和性質(zhì)粒。相反不能同寓于一細(xì)胞中的不同質(zhì)粒稱為不親和性質(zhì)?；虿幌嗳菪再|(zhì)粒。（1）分子量大，拷貝數(shù)低）分子量大，拷貝數(shù)低1. 天然質(zhì)粒的局限性天然質(zhì)粒的局限性第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長，分子長 9.1 kb。但只有一個但只有一個EcoR I切點充當(dāng)克隆位切點充當(dāng)克隆位點，點，Tetr 作為篩選標(biāo)志。作為篩選標(biāo)志。ColE1質(zhì)粒

10、的篩選標(biāo)志是大腸桿菌質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素素E1（colicin E1）。）?？梢酝ㄟ^插入失活篩選。但細(xì)菌群體容可以通過插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗易自發(fā)突變出抗colicin E1的細(xì)胞的細(xì)胞.colicin E1能殺死不含能殺死不含ColE1 質(zhì)粒的菌，質(zhì)粒的菌，形成形成“噬菌斑噬菌斑”。唯一的克隆位點唯一的克隆位點 EcoR I 正好位于這個正好位于這個基因的內(nèi)部?；虻膬?nèi)部。（1）具有復(fù)制起點（）具有復(fù)制起點（ORI）（2）具有抗菌素抗性基因）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點：）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點：是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩是篩選的標(biāo)志。

11、理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。種抗菌素抗性基因。用來插入外源用來插入外源DNA片段。且插入后不影片段。且插入后不影響復(fù)制功能。響復(fù)制功能。（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。A、選用合適的出發(fā)質(zhì)粒。出發(fā)質(zhì)粒（也稱為親本質(zhì)粒）中應(yīng)含有克隆載體必備的元件，如復(fù)制起始原點、用于選擇標(biāo)記的基因、克隆位點 B、獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件。 C、組裝合適的選擇標(biāo)記基因。 D、構(gòu)建過程中，應(yīng)盡可能的刪除載體上不必要的DNA序列，以縮小質(zhì)粒的分子量，提高外源DNA的裝載量。 E、構(gòu)建過程中，需要滅活出發(fā)質(zhì)粒上的某些編碼基因 氨芐青霉素抗性（氨芐青霉素抗性（Ampr）

12、卡那霉素抗性卡那霉素抗性 （Kanr） 四環(huán)素抗性四環(huán)素抗性 （Tetr） 鏈霉素抗性鏈霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性氯霉素抗性 （Cmlr）（1）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記：標(biāo)記：i）氨芐青霉素（）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。青霉素的衍生物。通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死應(yīng)，殺死生長的細(xì)菌生長的細(xì)菌。a）抑菌原理）抑菌原理b）細(xì)菌抗性原理）細(xì)菌抗性原理Ampr基因編碼基因編碼 -內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶，特異地，特異地切割氨芐青霉素的切割氨芐青霉素的 -內(nèi)酰胺環(huán)。內(nèi)酰胺

13、環(huán)。 通過與通過與50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死死。b）細(xì)菌抗性原理）細(xì)菌抗性原理Cmlr 編碼編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉，特異地使氯霉素乙酰化而失活。素乙?；Щ?。a）抑菌原理）抑菌原理a）殺菌原理）殺菌原理通過與通過與70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯讀。發(fā)生錯讀。殺死細(xì)菌殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理）細(xì)菌抗性原理Kanr 編碼的編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對，對卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。合作用。a）殺菌原

14、理）殺菌原理通過與通過與30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致mRNA錯譯。錯譯。殺死細(xì)菌殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理）細(xì)菌抗性原理Strr 編碼一種編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對鏈對鏈霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體30S亞亞基結(jié)合作用。基結(jié)合作用。b）細(xì)菌抗性原理）細(xì)菌抗性原理a）抑菌原理）抑菌原理通過于通過于30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死死生長的細(xì)菌生長的細(xì)菌。Tetr 編碼特異性蛋白質(zhì)，對細(xì)菌的膜結(jié)編碼特異性蛋白質(zhì)，對細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，組止四環(huán)素通

15、過細(xì)胞膜進(jìn)構(gòu)進(jìn)行修飾，組止四環(huán)素通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。營養(yǎng)標(biāo)記營養(yǎng)標(biāo)記其他標(biāo)記：如藍(lán)白斑篩選其他標(biāo)記：如藍(lán)白斑篩選當(dāng)帶有當(dāng)帶有抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的的載體載體進(jìn)入受體菌進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長。后，受體菌才能生長。不帶有不帶有抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的受體菌不能在的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長。生長?；罨钏浪揽剐曰蚩剐曰蚩咕乜咕兀?）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)

16、的特點。的特點。而且在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下而且在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個細(xì)胞的拷貝下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個細(xì)胞的拷貝數(shù)數(shù)1000300010003000個！個！適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。大量的基因產(chǎn)物。 但有特殊用途但有特殊用途:由由pSC101派生來的載體特點是分子量小，派生來的載體特點是分子量小，拷貝數(shù)低?？截悢?shù)低。當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時會當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時會嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動，導(dǎo)致嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代

17、謝活動，導(dǎo)致寄主菌死亡時，就需要低拷貝的載體。寄主菌死亡時，就需要低拷貝的載體。pLG338、pLG339、pHSG415等等不適合大量擴增不適合大量擴增DNA用。用。這是一類這是一類溫度敏感型復(fù)制控制溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒。質(zhì)粒。溫度低（低于溫度低（低于35 oC），拷貝數(shù)很少；），拷貝數(shù)很少； 溫度增加（溫度增加（35 oC）時，拷貝數(shù)會很快增）時，拷貝數(shù)會很快增加到加到1000個以上。個以上。如如pBEU1、pBEU2。runaway plasmid vectors1979年年B. E. Uhlin等構(gòu)建。等構(gòu)建。載體的克隆位點位于其某一個選擇性載體的克隆位點位于其某一個選擇性標(biāo)記基因內(nèi)

18、部。標(biāo)記基因內(nèi)部。如如pDF41、pDF42、pBR329?？咕乜剐钥咕乜剐酝庠赐庠碊NA無抗菌素抗性無抗菌素抗性如如pUR2、pTR262等。等。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。能在選擇培養(yǎng)基上生長。直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。選擇載體。Direct selection vectorsSmaIBamHIEcoRIHpaIEcoRIHindKil基因Pkn80（17kb）PKN80質(zhì)粒帶有來自Mu噬菌體DNA的EcoRI-C片段，它編碼一種ki

19、l基因，使Mu噬菌體非溶源菌株致死。 HindIII位點上插入外源DNA HindIII位點無插入外源DNA Kil基因無活性Kil基因有活性Mu噬菌體非溶源菌株致死Mu噬菌體非溶源菌株存活主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄錄翻譯信號控制之下。翻譯信號控制之下。注意啟動子的性質(zhì)，終止子、起始注意啟動子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。密碼、終止密碼的閱讀正確。復(fù)制起始點復(fù)制起始點ORI、 選擇標(biāo)記、選擇標(biāo)記、 多

20、克隆位點多克隆位點MCS2）大腸桿菌操縱子元件）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因阻遏基因 I 操縱基因操縱基因O 啟動基因啟動基因P 核糖體結(jié)合位點序列（核糖體結(jié)合位點序列（SD） 轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū)。轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū)。1）普通載體元件）普通載體元件1. pSC101第一個成功地用于克隆實驗的大腸桿菌質(zhì)第一個成功地用于克隆實驗的大腸桿菌質(zhì)粒載體。粒載體。（1）類型）類型天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。（2）長度）長度9.09 kb。（3）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記四環(huán)素抗性四環(huán)素抗性Tetr6個克隆位點：個克隆位點： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主

21、要使用主要使用EcoR I。（其中（其中Hind III、BamH I、Sal I 3個位個位于選擇標(biāo)記于選擇標(biāo)記Tetr的內(nèi)部）的內(nèi)部）（1）類型）類型天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。（2）長度）長度6.3 kb。（3）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記大腸桿菌素（大腸桿菌素（colicin）E1和對和對E1免疫的基因（免疫的基因（immE1）特點是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌特點是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個細(xì)胞個細(xì)胞1000-30001000-3000拷貝之多！拷貝之多！ colicin E1基因的結(jié)構(gòu)基因的結(jié)構(gòu)ceaim

22、mkil結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因免疫基因免疫基因溶菌基因溶菌基因 殺死不含有殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因細(xì)菌的原因cea + kil基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物 不被其他細(xì)菌的不被其他細(xì)菌的colicin E1所殺死的原因所殺死的原因imm基因基因EcoR I位于位于E1內(nèi)部，插入外源內(nèi)部，插入外源DNA會導(dǎo)會導(dǎo)致致E1失活，使受體菌不能合成失活，使受體菌不能合成E1（ColE1- -），但仍然表現(xiàn)出對），但仍然表現(xiàn)出對E1免疫型免疫型（ImmE1+ +）。）。EcoR IColicin E1外源外源DNA無無Colicin用對外源用對外源colicin E1的免疫性和自身不能的免疫性和自身不能合成合成coli

23、cin E1作選擇，操作非常繁雜。作選擇，操作非常繁雜。 對對colicin E1敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生抗產(chǎn)生抗colicin E1的頻率很高！的頻率很高！ColE1抗抗 colicinE1殺殺ColE1- -仍抗仍抗 colicinE1不殺不殺ColE1- -插入片段插入片段ColE1pSP2124質(zhì)粒的質(zhì)粒的Ampr基因基因（1）元件來源）元件來源F. Bolivar和和R.L. Rodriguez人工構(gòu)建載體。人工構(gòu)建載體。 復(fù)制起點復(fù)制起點 oripMB1系列（來源于系列（來源于ColE1）的的高拷貝高拷貝型復(fù)制起點型復(fù)制起點 Ampr基因基因 Tetr基

24、因基因pSC101的的Tetr 基因?；?。（2）長度）長度4363bp（3）選擇標(biāo)記）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點）克隆位點其中其中9個會導(dǎo)致個會導(dǎo)致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）；）； 3個會導(dǎo)致個會導(dǎo)致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24個克隆位點。個克隆位點。 雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記 插入失活，分兩次先后選擇：插入失活，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細(xì)胞沒有獲得載體的寄主細(xì)胞 在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞獲得載體的寄主

25、細(xì)胞 在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡氯霉素擴增之后，每個細(xì)胞可達(dá)氯霉素擴增之后，每個細(xì)胞可達(dá)10003000copy 安全安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。不能通過接合轉(zhuǎn)移。 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大載體越小越好。載體越小越好。 10kb的的DNA在純化過程中容易段裂。在純化過程中容易段裂。保留了轉(zhuǎn)移蛋白（保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的）的作用位點作用位點。能夠

26、被能夠被ColK質(zhì)粒編碼的質(zhì)粒編碼的mob蛋白識別，蛋白識別，如果再有如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！ 刪除刪除mobmob識別位點識別位點（如質(zhì)粒（如質(zhì)粒pBR327、pAT153等）。等）。pAT153：從從pBR322上切去上切去HaeII片段，既除片段，既除去了去了mob識別位點，又增加質(zhì)粒的識別位點，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)?？截悢?shù)。pBR325：在在pBR322位點上接入一段來自噬菌位點上接入一段來自噬菌體體PICm的的HaeII酶切片段（帶有氯霉酶切片段（帶有氯霉素抗性基因素抗性基因cmlr）。）。 cmlr上也帶一個上也帶一個EcoRI位點位點。使使Ec

27、oRI 也成為插入失活型位點。也成為插入失活型位點。University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基礎(chǔ)上改的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。造而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 復(fù)制起點復(fù)制起點pBR322的的 ori但其上失去了克隆位點。但其上失去了克隆位點。 Ampr 基因基因 lacZ的啟動子的啟動子大腸桿菌大腸桿菌 lacZ基因基因大腸桿菌大腸桿菌lacZ的的 -肽鏈序列，肽鏈序列， 是是LacZ 的氨基端片段。的氨基端片段。pBR322的的

28、Ampr基因基因（2）長度）長度約約2.7kb（3）克隆位點）克隆位點10個連續(xù)的單一限制酶切位個連續(xù)的單一限制酶切位點，位于點，位于lacZ基因的基因的5端。端。Ampicillin 抗性抗性和和 lacZ的的 肽互補肽互補（藍(lán)白（藍(lán)白斑）相結(jié)合。斑）相結(jié)合。 Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把無色的化合物能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個分解成半乳糖和一個深藍(lán)色深藍(lán)色的的物質(zhì)物質(zhì)5-溴溴-4-氯靛藍(lán)。氯靛藍(lán)。Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛藍(lán)氯靛藍(lán) -半乳糖苷酶半乳糖苷酶1） -肽（肽（

29、 lacZ ）：）： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片段端的一段氨基酸片段（11-41氨基酸）。氨基酸）。lacZ只有在只有在4 4聚體的狀態(tài)下才有功能聚體的狀態(tài)下才有功能. .C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚體聚體受體菌基因組的受體菌基因組的 -半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失氨基端有缺失（缺失 肽），不能形成肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解聚體的活性酶，不能分解Xgal 。受體菌株：受體菌株：JM系列系列、TG1、TG2

30、、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a。pUC質(zhì)粒載體上的質(zhì)粒載體上的lacZ 編碼編碼 肽與這個肽與這個缺失突變的缺失突變的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互補互補”，使它，使它能形成能形成4聚體。又能分解聚體。又能分解Xgal。產(chǎn)生藍(lán)。產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。色物質(zhì)。C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ 受體菌受體菌lacZpUC載體上載體上LacZ的的5端有一段多克隆位端有一段多克隆位點點(MCS)區(qū)，本身雖不干擾區(qū)，本身雖不干擾LacZ的合的合成，但插入外源基因就會阻止成，但插入外源基因就會阻止LacZ的的合成。不能互補。合成。不能互補。

31、 lacZ 5 3 肽移碼突變肽移碼突變lacZ 5 3 肽肽不互補不互補互補互補MCS外源外源DNAIPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操操縱子的啟動轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中縱子的啟動轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的的lacZ 的的C端部分端部分和載體的和載體的lacZ 肽肽都表達(dá)。從而互補。都表達(dá)。從而互補。但載體但載體MCSMCS上插入外源上插入外源DNADNA后，仍然后，仍然不能產(chǎn)生不能產(chǎn)生 肽！肽！IPTG通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有是否有DNADNA插入。插入。MCS無插入時，互補，藍(lán)菌斑。無插入時，互補，藍(lán)菌斑。

32、MCS有插入時，不互補，白菌斑。有插入時，不互補，白菌斑。 更小的分子量：更小的分子量：如如pUC18為為2682bp，pUC8為為2750bp。 選擇方便選擇方便Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。顯色、抗菌素雙重直接選擇。 克隆便利克隆便利具有多克隆位點（具有多克隆位點（MCS），使有兩個不），使有兩個不同粘性末端的外源同粘性末端的外源DNA方便地插入。方便地插入。 測序方便測序方便pUC的的MCS與與M13噬菌體載體的噬菌體載體的MCS完全相同，完全相同，便于把外源便于把外源DNA轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到M13載體上測序。載體上測序。1. pGEM-3Z由由pUC派生而來。派生而來。與與pUC的主要區(qū)

33、別是在的主要區(qū)別是在MCS的兩側(cè)分別的兩側(cè)分別加了一個噬菌體加了一個噬菌體啟動子啟動子T7和和SP6。T7啟動子啟動子SP6啟動子啟動子MCSlacZ Amprori可被可被T7和和SP6的的RNA聚合酶識別轉(zhuǎn)錄。聚合酶識別轉(zhuǎn)錄。 如果加入純化的如果加入純化的T7或或SP6 RNA聚合酶，聚合酶，在試管里就可以轉(zhuǎn)錄在試管里就可以轉(zhuǎn)錄mRNA 外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。 MCS與與pUC18的完全一樣。的完全一樣。2. pGEM-4Z：與與pGEM-3Z相同，只是相同，只是T7啟動子和啟動子和SP6啟動子的啟動子的位置互換位置互換。（1 1）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)）穿梭

34、質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)人工構(gòu)建的、具有人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點兩種不同復(fù)制起點和選和選擇標(biāo)記、可以在擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。的質(zhì)粒載體。Yeast復(fù)制起點復(fù)制起點E.coli復(fù)制起點復(fù)制起點E.coli選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記Yeast選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記MCS大腸桿菌大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體枯草桿菌穿梭載體 大腸桿菌大腸桿菌釀酒酵母穿梭載體釀酒酵母穿梭載體 大腸桿菌大腸桿菌動物細(xì)胞穿梭載體動物細(xì)胞穿梭載體 也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。菌、哺乳動物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。

35、可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來回轉(zhuǎn)移基因。間來回轉(zhuǎn)移基因?？寺?、構(gòu)建克隆、構(gòu)建表達(dá)表達(dá)E.coliAnimal cell 利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)AATTT vectorPCR productT4 DNA ligaseAA1. 質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個條件：質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個條件：（1）每個世代、每個質(zhì)粒至少要復(fù)制一次）每個世代、每個質(zhì)粒至少要復(fù)制一次（2）在細(xì)胞分裂時，復(fù)制過的質(zhì)粒必須分）在細(xì)胞分裂時，復(fù)制過的質(zhì)粒必須分 配到兩個子細(xì)胞中。配到兩個子細(xì)胞中。有主動分配和隨機分配兩種假說。有主動分配和隨機分配兩種假說。（1

36、）主動分配）主動分配天然質(zhì)粒。天然質(zhì)粒。具有一個控制質(zhì)?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)具有一個控制質(zhì)粒拷貝分配的功能區(qū)（Par），能以主動分配的方式確保質(zhì)），能以主動分配的方式確保質(zhì)粒能正確分配到兩個子細(xì)胞中。粒能正確分配到兩個子細(xì)胞中。人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體缺失了缺失了par區(qū)區(qū)，只，只能以隨機分配方式分到子細(xì)胞中。能以隨機分配方式分到子細(xì)胞中。人工質(zhì)粒。人工質(zhì)粒。（一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳）（一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳）但在一定條件下會出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。但在一定條件下會出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。在寄主菌細(xì)胞分裂的過程中，有一個細(xì)在寄主菌細(xì)胞分裂的過程中，有一個細(xì)胞沒有獲得質(zhì)?？截?/p>

37、，并最終繁殖成無胞沒有獲得質(zhì)粒拷貝，并最終繁殖成無質(zhì)粒的優(yōu)勢群體。質(zhì)粒的優(yōu)勢群體。（segregation instability）（structural instability）寄主基因組的寄主基因組的IS序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會使質(zhì)粒發(fā)生插入間的同源重組等都會使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失?；蛉笔?。ISdimer重組重組（1）新陳代謝負(fù)荷：）新陳代謝負(fù)荷：使寄主細(xì)胞生長減緩：使寄主細(xì)胞生長減緩：質(zhì)粒載體使寄主的世代時間延長約質(zhì)粒載體使寄主的世代時間延長約15%。 復(fù)制負(fù)荷復(fù)制負(fù)荷減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。 轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)

38、荷丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會成為優(yōu)勢群體！丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會成為優(yōu)勢群體！每個菌體中所擁有的質(zhì)粒拷貝數(shù)不完每個菌體中所擁有的質(zhì)?？截悢?shù)不完全相同，稱差度。全相同，稱差度。低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。差度（差度（variance）：）：是產(chǎn)生無質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。是產(chǎn)生無質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。野生型野生型E.coli中，質(zhì)粒在寄主的中，質(zhì)粒在寄主的重組酶重組酶作作用下會發(fā)生重組形成用下會發(fā)生重組形成二聚體質(zhì)粒二聚體質(zhì)粒。二聚

39、體災(zāi)難（二聚體災(zāi)難（dimer catastrophe）：）：含有大分子量插入片段的質(zhì)粒載體普遍含有大分子量插入片段的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體。能形成質(zhì)粒寡聚體。二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！導(dǎo)致質(zhì)粒失控。導(dǎo)致質(zhì)粒失控。噬菌體是一類細(xì)菌病毒（噬菌體是一類細(xì)菌病毒（Bacteriophage）。）。一、噬菌體的一般特性一、噬菌體的一般特性結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)： 蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著著DNA（雙鏈、單（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀鏈、線性、環(huán)狀等）。等）。single linear DNA (about 182,000 bp)T2 Genomic DNA護(hù)套

40、分為兩種：分為兩種：1. 溶菌周期：溶菌周期：感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。菌體。烈性噬菌體（烈性噬菌體（virulent phage)感染細(xì)菌后，將自己的感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌整合到細(xì)菌的染色體的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶中。形成這一過程稱為溶源化（源化（lysogenization)。整合到細(xì)菌染色體的噬菌體整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱為稱為原原噬菌體噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。，

41、隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。溫和噬菌體（溫和噬菌體（temperate phage)原噬菌體（原噬菌體（prophage)：單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：的絲狀大腸桿菌噬菌體：（2）復(fù)制型（）復(fù)制型（RF）是雙鏈環(huán)狀）是雙鏈環(huán)狀DNA。（3）RF DNA和和ssDNA都能都能轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染感受態(tài)感受態(tài) 大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑。大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑。（5）可產(chǎn)生大量的含有外源）可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片插入片 段的段的單鏈分子單鏈分子，便于作探針或測序。，便于作探針或測序。（1）+DNA。（。（ssDNA）（4）不存在包裝限制。）不存在包裝限制。RF dsDNA在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝

42、形式在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在。存在。成熟的噬菌體里只包裝有成熟的噬菌體里只包裝有 + DNA，也，也容易提取。容易提取。M13噬菌體只感染噬菌體只感染雄性雄性大腸桿菌。大腸桿菌。 但但M13 DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌?？梢赞D(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。6407 bp。（2）DNA長度長度（3）DNA提純提純雖然不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生雖然不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生長變慢，約為正常的長變慢，約為正常的1/23/41/23/4）M13通過雄性細(xì)菌的通過雄性細(xì)菌的F性須性須注入其注入其+DNA+DNA合成合成DNA，形成，形成RF dsDNADNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄mRNA、合成、合成+DNA、翻譯形

43、、翻譯形成噬菌體蛋白成噬菌體蛋白組裝成新的噬菌體組裝成新的噬菌體M13，擠出寄主細(xì)胞擠出寄主細(xì)胞+DNA-DNAmRNAM13外殼蛋白外殼蛋白組裝成子代組裝成子代M13+DNA注入大腸桿菌注入大腸桿菌復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯+DNA指導(dǎo)合成指導(dǎo)合成+DNA200個個 RF DNA每個細(xì)胞可以放出約每個細(xì)胞可以放出約10001000個個M13M13顆粒！顆粒！M13噬菌體噬菌體包裝包裝DNA分子的能力可達(dá)分子的能力可達(dá)M13DNA長度的長度的6倍。倍。M13基因組中只有基因基因組中只有基因II與基因與基因IV之間之間存在一段存在一段507bp的基因間隔區(qū)。的基因間隔區(qū)。（1）克隆區(qū)域的選定）克隆

44、區(qū)域的選定 基因間隔區(qū)（基因間隔區(qū)（intergenic region, IG區(qū)）區(qū)）IG區(qū)內(nèi)只有一個區(qū)內(nèi)只有一個 BsuI 切點。切點。其余其余9個個BsuI限制性位點分布在其它部位。限制性位點分布在其它部位。 酶切位點酶切位點M13J. Messing證明，證明，IG區(qū)存在區(qū)存在M13的的復(fù)制起復(fù)制起點點，但可以插入外源，但可以插入外源DNA而不影響而不影響M13噬菌體的活力。噬菌體的活力。在在IG區(qū)內(nèi)插入一個大腸桿菌的區(qū)內(nèi)插入一個大腸桿菌的LacZ（ -肽序列肽序列)。 利用利用 -肽序列中的三個單一酶切位肽序列中的三個單一酶切位點（點（Bgl II、Ava II 和和 Pvu I）。）

45、。 在在IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點第一個第一個M13載體：載體：M13mp1：M13 RFBsuI不完全消化不完全消化各種長度的線性片段各種長度的線性片段（其中應(yīng)有只在（其中應(yīng)有只在IGIG上切開的線性上切開的線性全長全長M13M13）E.coli lac基因的基因的Hind II 片段片段(lacI、lacP、lacO、lacZ）連接連接M13mp1JM101宿主宿主只有在只有在IG區(qū)插入?yún)^(qū)插入lacZ才能存活并才能存活并在在Xgal上出現(xiàn)互補的藍(lán)噬菌斑上出現(xiàn)互補的藍(lán)噬菌斑加上常用的酶切位點。加上常用的酶切位點。 M13載體系列的命名載體系列的命名M13mpn n代表系

46、列數(shù)字代表系列數(shù)字 對對M13mp1的改進(jìn)的改進(jìn)B. Gronenborn和和J. Messing1978年把年把LacZ 5端的第端的第16個核苷酸個核苷酸G突變成突變成A，產(chǎn)生了一個產(chǎn)生了一個EcoR I切點。切點。M13mp2：5ATGACCATGATTACGGATTCA-Me用用N-甲基甲基-N-亞硝基脲亞硝基脲 把把G甲基化甲基化 5ATGACCATGATTACGGATTCA-轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染E.coli。mG與與T配對，復(fù)制兩次后配對，復(fù)制兩次后 5ATGACCATGATTACGAATTCA-EcoRI切點切點用用EcoRI切切M13mp1M13mp2選擇能切開的選擇能切開的 線性分子線性

47、分子再環(huán)化再環(huán)化M13mp1在在M13mp2的的LacZ的的5端加上一段人工端加上一段人工合成的多克隆位點（合成的多克隆位點（MCS）。）。M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19對應(yīng)有相同對應(yīng)有相同MCS的的pUC系列載體：系列載體：pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19成為成為M13mp系列載體：系列載體：12與與pUC18相同相同（1）有）有MCS，便于克隆不同的酶切片段，便于克隆不同的酶切片段（2） Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇顯色反應(yīng)，可供直接選擇（3）無包裝限制，克隆能力大）無包

48、裝限制，克隆能力大（4）可以克隆雙鏈）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈分子中的每一條鏈子代子代M13噬菌體中包含的是單連噬菌體中包含的是單連+DNA。MCS+-+-+-編碼鏈編碼鏈非編碼鏈非編碼鏈外源外源DNA不同的酶切不同的酶切不同的酶切不同的酶切插入插入M13 vectorM13 RF+-+-+-外源外源DNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染E. coli成熟的子代成熟的子代M13中中+ 插入外源插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降 實際克隆能力小于實際克隆能力小于1500bp1500bp。雖無包裝限制，雖無包裝限制，并非無限包裝！并非無限包裝！由由質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體與與單鏈?zhǔn)删w載體單鏈?zhǔn)?/p>

49、菌體載體的復(fù)制起點的復(fù)制起點結(jié)合而成的新型載體系列。結(jié)合而成的新型載體系列。MCS噬菌體噬菌體ori質(zhì)粒質(zhì)粒oriAmprlacZ lacI約約3000bp（比（比M13?。┬。┛寺∧芰Υ罂寺∧芰Υ竽懿迦肽懿迦?0kb的外源的外源DNA。兩種復(fù)制形式兩種復(fù)制形式分子量小分子量小既具有質(zhì)粒的復(fù)制起點，又具有噬菌體既具有質(zhì)粒的復(fù)制起點，又具有噬菌體的復(fù)制起點。的復(fù)制起點。既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制，既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制，又能在噬菌體內(nèi)進(jìn)行單鏈復(fù)制。又能在噬菌體內(nèi)進(jìn)行單鏈復(fù)制。輔助噬菌體用來復(fù)制和包裝噬菌粒載體。輔助噬菌體用來復(fù)制和包裝噬菌粒載體。 構(gòu)成構(gòu)成1）M13的基因

50、間隔區(qū)（的基因間隔區(qū)（IG）2）pUC18/pUC19質(zhì)粒載體：質(zhì)粒載體：帶有帶有M13復(fù)制起點。復(fù)制起點。質(zhì)粒復(fù)制起點質(zhì)粒復(fù)制起點 Ampr lacZ MCSMCSpUC18/pUC19 oriAmprlacZ lacIM13 ori3.2kb兩種不同的復(fù)制模式兩種不同的復(fù)制模式1）雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式）雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式受受pUC本身的復(fù)制起點（來源于本身的復(fù)制起點（來源于ColE1）的控制。）的控制。每個細(xì)胞能達(dá)到每個細(xì)胞能達(dá)到500500個拷貝。個拷貝。來源于來源于M13的復(fù)制起點被的復(fù)制起點被輔助噬菌體輔助噬菌體的基因的基因II產(chǎn)物控制。產(chǎn)物控制。外殼蛋白外殼蛋白復(fù)制蛋白復(fù)制蛋白輔助輔助M

51、13包裝包裝當(dāng)寄主細(xì)胞被當(dāng)寄主細(xì)胞被輔助噬菌體輔助噬菌體M13感染后。感染后。1）輔助噬菌體：）輔助噬菌體：自身的自身的復(fù)制起點發(fā)生了突變復(fù)制起點發(fā)生了突變，復(fù)制效率，復(fù)制效率低下，但感染細(xì)菌后能表達(dá)出低下，但感染細(xì)菌后能表達(dá)出外殼蛋白外殼蛋白和復(fù)制蛋白和復(fù)制蛋白，幫助噬菌粒載體復(fù)制。，幫助噬菌粒載體復(fù)制。如如M13K07等。等。2）包裝：）包裝：輔助噬菌體輔助噬菌體外殼蛋白和外殼蛋白和 復(fù)制蛋白復(fù)制蛋白噬菌粒載體噬菌粒載體ssDNA噬菌體噬菌體Stratagene公司發(fā)展的一類噬菌粒載體。公司發(fā)展的一類噬菌粒載體。由由pUC質(zhì)粒載體、質(zhì)粒載體、f1噬菌體的復(fù)制起點和噬菌體的復(fù)制起點和T3、T

52、7噬菌體的啟動子噬菌體的啟動子組成。組成。 特點特點 組成組成MCS兩側(cè)分別加上兩側(cè)分別加上T3和和T7噬菌體的噬菌體的啟動子。加入適當(dāng)?shù)氖删w啟動子。加入適當(dāng)?shù)氖删wRNA聚聚合酶，就可以定向體外轉(zhuǎn)錄。合酶，就可以定向體外轉(zhuǎn)錄。1）定向體外轉(zhuǎn)錄）定向體外轉(zhuǎn)錄2）兩種復(fù)制模式）兩種復(fù)制模式既能以質(zhì)粒的形式復(fù)制，又能以噬既能以質(zhì)粒的形式復(fù)制，又能以噬菌體的形式復(fù)制包裝。菌體的形式復(fù)制包裝。3）選擇方便）選擇方便有有Ampr和和lacZ，可以進(jìn)行，可以進(jìn)行Amp抗性抗性選擇和選擇和Xgal-IPTG藍(lán)白斑選擇。藍(lán)白斑選擇。4）插入方便）插入方便18個單一酶切位點的個單一酶切位點的MCSSK：表示：

53、表示lacZ的的轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向是沿是沿MCS上的上的 SacI KpnI +（f1+）：單鏈）：單鏈復(fù)制起始方向復(fù)制起始方向背離背離 lacZ，能回收，能回收lacZ的編碼鏈（的編碼鏈（+）pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-）KS：反向（：反向（ KpnI SacI ，MCS相反）相反）-（f1-）：能回收）：能回收lacZ的非編碼鏈（的非編碼鏈（-）pCR系列載體系列載體Invitrogen公司開發(fā)的公司開發(fā)的線性線性噬菌粒載體。噬菌粒載體。 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)pUC的質(zhì)粒部分、的質(zhì)粒部分、 f1噬菌體噬菌體ori、Kanr和和Ampr抗性。抗性。MCS的中

54、部已經(jīng)切開，各有一個的中部已經(jīng)切開，各有一個3端突出的端突出的T。 特點特點PCR產(chǎn)物往往在產(chǎn)物往往在3端突出一個端突出一個A，所，所以能與這個載體直接連接。以能與這個載體直接連接。克隆的克隆的PCR產(chǎn)物能被兩側(cè)的產(chǎn)物能被兩側(cè)的EcoRI切下來回收。切下來回收。pGEM-T vectorpGEM-T EasyvectorG418抗性抗性可在真核生物表達(dá)可在真核生物表達(dá)pTARGETTM載體包含巨細(xì)胞病毒CMV早期增強子/啟動子，可啟動基因在多種細(xì)胞中高水平表達(dá)。這個載體還包含一個新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Neo)，可用抗生素G- 418篩選細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株。 （1）噬菌體展示（）噬菌體展示（Phag

55、e display）將外源蛋白（多肽、酶、抗體、將外源蛋白（多肽、酶、抗體、DNA結(jié)結(jié)合蛋白）結(jié)合到噬菌體的外殼蛋白上形合蛋白）結(jié)合到噬菌體的外殼蛋白上形成融合蛋白，表達(dá)于成融合蛋白，表達(dá)于噬菌體的外表面噬菌體的外表面。G. P. Smith1985年發(fā)明。年發(fā)明。絲狀噬菌體（絲狀噬菌體（M13、f1等）外殼顆粒的等）外殼顆粒的一端，有一端，有3-5個基因個基因編碼的蛋白質(zhì)編碼的蛋白質(zhì)（g3p），在識別和吸附大腸桿菌的過），在識別和吸附大腸桿菌的過程中起作用。程中起作用。M13把外源把外源DNA片段插入基因片段插入基因的序列的序列前端前端，并保持兩者的閱讀框正確，表達(dá)出融合并保持兩者的閱讀框正

56、確，表達(dá)出融合蛋白。蛋白。啟動子啟動子外源外源DNAM13基因基因oriM13 display vector外源外源多肽多肽（1）長度為）長度為48502 bp； （2）雙鏈線性）雙鏈線性DNA； （3）但在兩端有）但在兩端有cos位點，可以環(huán)化。位點，可以環(huán)化。 DNA兩端各有兩端各有12bp的粘性末端，粘性末的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點。位點。1. DNA分子的特點分子的特點 cos位點（位點（cohensive-end site）：）： DNA進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)后，可形成雙鏈環(huán)狀進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)后，可形成雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（復(fù)制型（RF DNA）。）。DN

57、A上有至少上有至少61個基因，有一半是必須的，個基因，有一半是必須的，與自身的活動有關(guān)，成簇排列。與自身的活動有關(guān)，成簇排列。 其他約其他約1/3是是非必須基因（非必須基因（位于尾部合成至阻位于尾部合成至阻遏蛋白基因之間的區(qū)段）。遏蛋白基因之間的區(qū)段）。 噬菌體感染細(xì)菌的早期：雙鏈進(jìn)行噬菌體感染細(xì)菌的早期：雙鏈進(jìn)行 型復(fù)制。型復(fù)制。（1） 型復(fù)制型復(fù)制感染的晚期：啟動滾環(huán)復(fù)制機制。感染的晚期：啟動滾環(huán)復(fù)制機制。形成多聯(lián)體形成多聯(lián)體 DAN分子。分子。滾環(huán)滾環(huán)復(fù)制復(fù)制這種多聯(lián)體分子必須在這種多聯(lián)體分子必須在cos位點被切斷位點被切斷成單體分子才能被包裝起來。成單體分子才能被包裝起來。（1）構(gòu)建原

58、理：）構(gòu)建原理：（2）構(gòu)建過程）構(gòu)建過程在這個非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點在這個非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點 引進(jìn)某些突變表型，作為選擇標(biāo)記引進(jìn)某些突變表型，作為選擇標(biāo)記 突變某些基因，使它成為安全載體突變某些基因，使它成為安全載體 刪除刪除 DNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點必須區(qū)段上常用的限制酶切點 噬菌體噬菌體DNA上本身有上本身有5個個 EcoR I 和和7 個個Hind III切點！切點！刪除刪除 噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。 插入型載體（插入型載體（insertion vectors)：如如 gt10、 gt11、 BV2、 NM540、 NM1590、

59、NM607插入位點位于載體合成活性插入位點位于載體合成活性阻遏物區(qū)阻遏物區(qū)域域（cI基因）內(nèi)?；颍﹥?nèi)。EcoR I gt10插入導(dǎo)致載體不能合成阻遏物，插入導(dǎo)致載體不能合成阻遏物， 載體載體DNA不能進(jìn)入溶源期，受體菌全部裂解，形成不能進(jìn)入溶源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。清晰的噬菌斑。 沒有外源沒有外源DNA插入的插入的 載體感染受體菌形成載體感染受體菌形成混濁噬菌斑混濁噬菌斑。如如 NM1149載體的兩個克隆位點（載體的兩個克隆位點（EcoR I 和和Hind III）都是位于）都是位于cI基因內(nèi)部。基因內(nèi)部。在在 基因組中引入了基因組中引入了LacZ序列。（其上含序列。（其上含

60、有一個有一個EcoR I 克隆位點）。克隆位點）。感染感染LacZ突變的大腸桿菌，經(jīng)突變的大腸桿菌，經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)，的誘導(dǎo)，利用利用Xgal的顯色反應(yīng)的顯色反應(yīng)作選擇標(biāo)記。作選擇標(biāo)記。EcoR ICharon16A 兩個多克隆位點區(qū)以反向重復(fù)形式分別位兩個多克隆位點區(qū)以反向重復(fù)形式分別位于于 DNA的非必須區(qū)兩端。的非必須區(qū)兩端。用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來，與用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來，與用同樣酶切成的外源用同樣酶切成的外源DNADNA片段置換。片段置換?？芍脫Q區(qū)可置換區(qū)MCSMCS如：如： EMBL4、Charon40等。等。13 EMBL4的可置換片段內(nèi)部還有的可置換片段內(nèi)部