無菌操作技術(shù)原理及實(shí)驗(yàn)

1、無菌操作技術(shù)原理及實(shí)驗(yàn)無菌操作技術(shù)定義：指在實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。目的：n 保證培養(yǎng)物不被環(huán)境中微生物污染；n 防止被檢微生物在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。范圍：n 微生物無菌操作技術(shù)；n 細(xì)胞無菌培養(yǎng)。微生物無菌操作技術(shù)及接種技術(shù)原理：o 無菌技術(shù)：指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。o 接種：將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程。1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀無菌操作材料：無菌器材準(zhǔn)備： 滅菌器材：槍頭、玻璃

2、器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等進(jìn)行高壓滅菌處理。培養(yǎng)基的制備： 目的菌：大腸桿菌 LB培養(yǎng)基：（蛋白胨易吸濕，應(yīng)迅速稱??；稱取一種藥品后，藥匙洗凈擦干后再稱另一種藥品。）蛋白胨易吸濕，應(yīng)迅速稱取；稱取一種藥品后，藥匙洗凈擦干后再稱另一種藥品。） pH: 7.4-7.6；（勿調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響各離子濃度。）（勿調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響各離子濃度。） 分裝要求：（分裝時(shí)，不要使培養(yǎng)基沾在瓶口，以免玷污瓶塞而引起污染。）（分裝時(shí)，不要使培養(yǎng)基沾在瓶口，以免玷污瓶塞而引起污染。） 液體：試管：試管高度的1/4； 三角瓶：不超過容積的1/2； 固體：試管：不超過1/5，滅菌后制成斜面； 平皿：15ml。 滅菌

3、條件：121，20min。（溫度時(shí)間不宜過高過長(zhǎng)，以免破壞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）（溫度時(shí)間不宜過高過長(zhǎng)，以免破壞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)） 抗生素的加入：放至50，握緊3s不燙手。 無菌檢查：將滅菌培養(yǎng)基放入37的培養(yǎng)24-48h后觀察。滅菌方式： 輻射滅菌：輻射滅菌：60CO-射線，醫(yī)療器械、容器、生產(chǎn)輔助用品、不受輻射破壞的原料藥及成品等。 干熱滅菌法干熱滅菌法：利用干熱空氣達(dá)到殺滅微生物或消除熱原物質(zhì)的方法。 160170*120min 以上、170180*60min 以上或250*45min。 適用于耐高溫但不宜用濕熱滅菌法滅菌的物品滅菌，如玻璃器具、金屬材質(zhì)容器、纖維制品、 固體試藥、液狀石蠟等均可采用本法滅菌

4、。 濕熱滅菌法：濕熱滅菌法：熱力滅菌中最有效、應(yīng)用最廣泛。121、30min。藥品、容器、培養(yǎng)基、無菌 衣、膠塞以及其他遇高溫和潮濕不發(fā)生變化或損壞的物品，均可采用本法滅菌。 氣體滅菌法：氣體滅菌法：環(huán)氧乙烷、氣態(tài)過氧化氫、甲醛、臭氧（O3）等。 過濾除菌法：過濾除菌法：除菌濾膜分親水和疏水，孔徑一般不超過0.22um。過濾器不得對(duì)被濾過成分有吸附作用，也不能 釋放物質(zhì)，不得有纖維脫落。 紫外線滅菌：紫外線滅菌：UVC200-300nm，254-257nm滅菌能力最強(qiáng)。 原理：誘導(dǎo)胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制；產(chǎn)生臭氧共同殺菌。高壓滅菌鍋操作步驟及注意事項(xiàng)： 儀

5、器檢查：儀器擺放在水平地面上，周圍有空隙。 加水：水位至平臺(tái)處，不要過多。使用去離子水。 擺放：相互間有適當(dāng)縫隙，有利于蒸汽的穿透，提高滅菌效果。 密封：順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，直到不到旋轉(zhuǎn)為止。 加熱：打開開關(guān)，檢查溫度和時(shí)間。 排氣：打開放氣閥價(jià)格你干冷空氣排出。 滅菌：干冷空氣排出 后，擰緊閥門。 結(jié)束：關(guān)閉開關(guān)，壓力降至0打開放氣閥排盡余氣后方可打開高壓鍋。注意： 高壓帶有液體的瓶子時(shí)要旋松瓶蓋，防止瓶?jī)?nèi)壓力過大使瓶子碎裂；包有報(bào)紙的物品，立即進(jìn)行干燥處理?？股氐呐渲萍氨４妫?選用合適溶劑溶解后，0.22um過濾除菌。 氨芐青霉素：-20長(zhǎng)期保存，4保存一個(gè)月，37保存2-3天。 卡那霉素、四環(huán)

6、素、鏈霉素：-20長(zhǎng)期保存，4、37比氨芐保存時(shí)間稍長(zhǎng)，四環(huán)素避光保存。無菌環(huán)境的要求與保持：無菌環(huán)境 無菌室超凈工作臺(tái)（原理：在特定的空間內(nèi)，潔凈空氣（過濾空氣）按 設(shè)定的方向流動(dòng)而形成的。）使用前打開紫外燈照射使用前打開紫外燈照射4060分鐘分鐘開啟超凈工作臺(tái)工作電源，關(guān)閉紫外燈，并用開啟超凈工作臺(tái)工作電源，關(guān)閉紫外燈，并用75%的酒精或的酒精或0.5%過氧乙酸噴灑擦拭消毒工作臺(tái)面。過氧乙酸噴灑擦拭消毒工作臺(tái)面。使用中，有機(jī)玻璃罩受到污染，嚴(yán)禁用酒精棉球擦拭，請(qǐng)用含水棉布檫拭；使用中，有機(jī)玻璃罩受到污染，嚴(yán)禁用酒精棉球擦拭，請(qǐng)用含水棉布檫拭；請(qǐng)保持超凈臺(tái)整潔、干燥，不要堆積雜物；請(qǐng)保持超凈

7、臺(tái)整潔、干燥，不要堆積雜物；使用完畢，關(guān)閉煤氣開關(guān)或酒精燈；使用完畢，關(guān)閉煤氣開關(guān)或酒精燈；使用完畢后，使用完畢后，用消毒液擦拭工作臺(tái)面，關(guān)閉工作電源，重新開啟紫外燈照射用消毒液擦拭工作臺(tái)面，關(guān)閉工作電源，重新開啟紫外燈照射15分鐘分鐘. .定期將初效過濾器拆下清洗，清洗周期一般為定期將初效過濾器拆下清洗，清洗周期一般為3-63-6個(gè)月；個(gè)月；高效空氣過濾器的使用期限為十八個(gè)月。高效空氣過濾器的使用期限為十八個(gè)月。定期做無菌試驗(yàn)，以測(cè)定凈化臺(tái)是否符合無菌要求。定期做無菌試驗(yàn)，以測(cè)定凈化臺(tái)是否符合無菌要求。超凈臺(tái)的使用與維護(hù)無菌操作要求：（1 1）在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動(dòng)作；）在操作中不應(yīng)

8、有大幅度或快速的動(dòng)作；（2 2）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放。）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放。（3 3）在火焰）在火焰上方上方操作，水平距離操作，水平距離5cm范圍內(nèi)為無菌區(qū)域。范圍內(nèi)為無菌區(qū)域。（4 4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；（5 5）在接種培養(yǎng)物時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕、準(zhǔn)）在接種培養(yǎng)物時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕、準(zhǔn)。（6 6）不能用嘴直接吸吹吸管。）不能用嘴直接吸吹吸管。（7 7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時(shí)置于盛有）帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時(shí)置于盛有5%5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。（8 8） 酒精燈使用時(shí)，酒精燈使用時(shí)，酒精量不超其容

9、積的酒精量不超其容積的2/3，也不能少于，也不能少于1/3。接種技術(shù)： 常用接種方法： 斜面接種 劃線接種 液體接種 穿刺接種 接種的基本程序：滅菌接種工具滅菌接種工具沾取標(biāo)本沾取標(biāo)本接種接種滅菌接種工具滅菌接種工具殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染標(biāo)本殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染標(biāo)本殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染環(huán)境殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染環(huán)境操作需在無菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行操作需在無菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無菌室、超凈工作臺(tái)使用前后需進(jìn)行消毒。無菌室、超凈工作臺(tái)使用前后需進(jìn)行消毒。實(shí)驗(yàn)使用的物品使用前后需嚴(yán)格滅菌實(shí)驗(yàn)使用的物品使用前后需嚴(yán)格滅菌 斜面接種：斜面接種：從已生長(zhǎng)好的菌

10、種斜面上挑取少量菌種移植至另一新鮮斜面培養(yǎng)基上的接種方法。 用于需氧性微生物的接種。1)標(biāo)記：接種前在試管上注明菌名、接種日期、接種人姓名2)點(diǎn)燃酒精燈。3)接種步驟： 由斜面菌接種到液體培養(yǎng)基（如試管或三角瓶等）中的方法。意義：質(zhì)粒的擴(kuò)增，蛋白的大量表達(dá)。操作方法： 與斜面法基本一致，只是在將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基時(shí)使環(huán)在液體與 管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，塞上棉塞再輕輕搖勻。 如果菌種是培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中時(shí)，一般用移液管或滴管接種 液體接種液體接種劃線劃線接種與平板涂布接種與平板涂布使混合的細(xì)菌呈單個(gè)分散生長(zhǎng)，形成單個(gè)菌落，以便獲得純菌、活菌計(jì)數(shù)。方法： 分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多

11、的標(biāo)本 連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本分區(qū)劃線法分區(qū)劃線法連續(xù)劃線法連續(xù)劃線法注意： 平板倒置放置（防止皿蓋水珠滴在菌落上；重力作用下營(yíng)養(yǎng)下沉為菌體提供營(yíng)養(yǎng)）。 平皿底部標(biāo)注姓名、日期及樣品名，防止平皿較多時(shí)錯(cuò)蓋皿蓋弄亂樣品。用接種針從菌種斜面上挑取少量菌體并把它穿刺到固體或半固體的深層培養(yǎng)基中的接種方法。 用于厭氣性細(xì)菌培養(yǎng)、檢查細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力、保藏菌種。 只適宜于細(xì)菌和酵母的接種培養(yǎng)穿刺穿刺接種接種接種步驟： （1）手持試管 （2）旋松棉塞 （3）接種針灼燒滅菌，把在穿刺中可能伸入試管的其他部位也灼燒滅菌 （4）拔出棉塞 （5）取菌：用冷卻接種針的針尖沾取少量菌種 （6）穿刺：將接種針自培養(yǎng)基中心平穩(wěn)、快速垂直刺入培養(yǎng)基，至接近試管 底部，然后沿接種線拔出 （7）塞上棉塞 （8）接種針灼燒滅菌細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞室無菌環(huán)境的保持與維護(hù)： 進(jìn)入細(xì)胞室前，在緩沖間換實(shí)驗(yàn)服、換拖鞋；每天早上打掃細(xì)胞并紫外照射半小時(shí)。 培養(yǎng)箱的使用與維護(hù)： 定期滅菌； 按位置擺放細(xì)胞瓶，方便查找，以免長(zhǎng)時(shí)間敞開培養(yǎng)箱； 不準(zhǔn)對(duì)著打開的培養(yǎng)箱說話，以免培養(yǎng)箱的污染； 細(xì)胞從培養(yǎng)箱取出時(shí)，擰緊瓶蓋。 細(xì)胞放進(jìn)培養(yǎng)箱時(shí)，70%酒精擦拭瓶口； 超凈臺(tái)內(nèi)處理細(xì)胞時(shí)，防止操作人的手及任何物品從細(xì)胞瓶口上方經(jīng)過，嚴(yán)格在酒精燈附近進(jìn)行操作。1. 無菌操作的定義