中藥中黃曲霉毒素的檢測

1、中藥中黃曲霉毒素的測定中藥中黃曲霉毒素的測定目錄目錄真菌毒素簡介真菌毒素簡介黃曲霉毒素概述黃曲霉毒素概述黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測方法介紹黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測方法介紹黃曲霉毒素檢測藥典收載情況黃曲霉毒素檢測藥典收載情況藥典檢測方法詳解藥典檢測方法詳解注意事項及實驗室建議注意事項及實驗室建議真菌毒素簡介真菌毒素簡介真菌毒素真菌毒素：由產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)：由產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，由真菌菌核產(chǎn)生。生的有毒代謝產(chǎn)物，由真菌菌核產(chǎn)生。Mycotoxin：源于希臘語（：源于希臘語（Mykes）和拉丁語）和拉丁語（Toxicum）常見真菌毒素分類常見真菌毒素分類真菌種類真菌種類所產(chǎn)毒

2、素所產(chǎn)毒素曲霉屬曲霉屬黃曲霉毒素、赭曲霉毒素黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A A鐮刀菌屬鐮刀菌屬玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯酮、T-2T-2毒素、嘔毒素、嘔吐毒素、伏馬毒素吐毒素、伏馬毒素青霉屬青霉屬展青霉素、桔青霉素展青霉素、桔青霉素真菌毒素監(jiān)控意義真菌毒素監(jiān)控意義真菌毒素對食品安全的危害真菌毒素對食品安全的危害真菌毒素對種、養(yǎng)殖業(yè)的危害真菌毒素對種、養(yǎng)殖業(yè)的危害真菌毒素對制藥行業(yè)的危害（中藥）真菌毒素對制藥行業(yè)的危害（中藥）國際貿易中作為技術壁壘國際貿易中作為技術壁壘在國際反恐和戰(zhàn)爭中，真菌毒素可作為大規(guī)模在國際反恐和戰(zhàn)爭中，真菌毒素可作為大規(guī)模殺傷性生化武器殺傷性生化武器黃曲霉毒素概述黃曲霉毒素概述

3、黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等菌種產(chǎn)生的黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等菌種產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物次生代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素的發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素的發(fā)現(xiàn)1960年，在英國東南部一些農(nóng)場中，有大約年，在英國東南部一些農(nóng)場中，有大約10萬只火雞不明原由地突然死亡。萬只火雞不明原由地突然死亡。1961年發(fā)現(xiàn)火雞飼料中混有的花生粉能夠使大年發(fā)現(xiàn)火雞飼料中混有的花生粉能夠使大鼠誘發(fā)肝癌。鼠誘發(fā)肝癌。1962年，研究發(fā)現(xiàn)花生粉中含有一種熒光物質年，研究發(fā)現(xiàn)花生粉中含有一種熒光物質是導致?；痣u死亡的病因，這種熒光物質被證是導致?；痣u死亡的病因，這種熒光物質被證實為黃曲霉的代謝產(chǎn)物，故命名為實為黃曲霉的代謝產(chǎn)物，故命名為“黃

4、曲霉毒黃曲霉毒素素(Aflatoxins)”。存在極其廣泛存在極其廣泛主要存在于土壤，動植物及各種堅果中。家庭主要存在于土壤，動植物及各種堅果中。家庭自制發(fā)酵食品等也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。自制發(fā)酵食品等也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。一般在熱帶和亞熱帶地區(qū)，食品中黃曲霉毒素一般在熱帶和亞熱帶地區(qū)，食品中黃曲霉毒素的檢出率比較高。的檢出率比較高。未能及時曬干或儲藏不當?shù)募Z食容易產(chǎn)生，在未能及時曬干或儲藏不當?shù)募Z食容易產(chǎn)生，在農(nóng)作物正常的生長期中也可以形成。農(nóng)作物正常的生長期中也可以形成。毒性極強毒性極強1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構（的癌癥研究機構（I

5、ARC）劃定為）劃定為類致癌物，類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質，僅次肉毒毒素，是一種毒性極強的劇毒物質，僅次肉毒毒素，是目前已知霉菌中毒性最強的。是目前已知霉菌中毒性最強的。急性毒性：比氰化鉀大急性毒性：比氰化鉀大10倍，比砒霜大倍，比砒霜大68倍倍慢性毒性：肝臟損害，呈急性肝炎、出血性壞慢性毒性：肝臟損害，呈急性肝炎、出血性壞死、肝細胞脂肪變性和膽管增生。脾臟和胰臟死、肝細胞脂肪變性和膽管增生。脾臟和胰臟也有輕度的病變。也有輕度的病變。中藥中容易產(chǎn)生黃曲霉毒素的品中藥中容易產(chǎn)生黃曲霉毒素的品種種種子、果實、糧谷類中藥材種子、果實、糧谷類中藥材發(fā)酵類中藥材發(fā)酵類中藥材動物類中藥材動物類中藥

6、材油性成分多的中藥材油性成分多的中藥材含上述種類藥材的中成藥含上述種類藥材的中成藥黃曲霉毒素的種類及性質黃曲霉毒素的種類及性質根據(jù)在紫外線照射下產(chǎn)生熒光顏色的不同，根據(jù)在紫外線照射下產(chǎn)生熒光顏色的不同，分為分為B B族族和和G G族族兩大類及其衍生物兩大類及其衍生物藍色熒光藍色熒光黃綠色熒光黃綠色熒光化學結構化學結構基本結構：是一組化學結構類似的基本結構：是一組化學結構類似的二呋二呋喃香豆素喃香豆素的衍生化合物的衍生化合物目前發(fā)現(xiàn)約目前發(fā)現(xiàn)約20余種余種，已分離鑒定出，已分離鑒定出12種：種：B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。和毒醇。B1：最常見、毒性及致

7、癌性最強：最常見、毒性及致癌性最強化學結構式化學結構式理化性質理化性質黃曲霉毒素相對分子量黃曲霉毒素相對分子量312346難溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機難溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚在中性及酸性溶液中較穩(wěn)定，但在在中性及酸性溶液中較穩(wěn)定，但在pH為為13的強的強酸性溶液中稍有分解，在酸性溶液中稍有分解，在pH為為910的的堿性溶液堿性溶液中分解迅速中分解迅速純品為無色結晶純品為無色結晶耐高溫，黃曲霉毒素耐高溫，黃曲霉毒素B1的分解溫度為的分解溫度為268紫外線對低濃度黃曲霉毒素有一定的破壞性紫外線對低濃度黃

8、曲霉毒素有一定的破壞性黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測方法介紹黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測方法介紹薄層層析法：靈敏度低，定量困難薄層層析法：靈敏度低，定量困難HPLC-紫外檢測法：不衍生，靈敏度低，采用紫外檢測法：不衍生，靈敏度低，采用UPLC可以增強靈敏度可以增強靈敏度HPLC-熒光檢測法：需衍生，靈敏度高熒光檢測法：需衍生，靈敏度高高效液相色譜高效液相色譜-串聯(lián)質譜法：不需衍生，靈敏度串聯(lián)質譜法：不需衍生，靈敏度高，假陽性少，成本高高，假陽性少，成本高免疫化學分析方法免疫化學分析方法 酶聯(lián)免疫吸附法：酶聯(lián)免疫吸附法：快速、簡便、單一毒素、快速、簡便、單一毒素、假陽多假陽多 免疫親和柱免疫親和柱- -熒光分光光度法

9、熒光分光光度法：高效、無毒、：高效、無毒、假陽多假陽多 微柱篩選法微柱篩選法：半定量，測總量：半定量，測總量 一步式黃曲霉毒素檢測金標試紙法一步式黃曲霉毒素檢測金標試紙法：快速、：快速、現(xiàn)場大批量初篩現(xiàn)場大批量初篩黃曲霉毒素檢測藥典收載情況黃曲霉毒素檢測藥典收載情況2005年增補本附錄年增補本附錄 第一次增加了黃曲霉毒素測定法第一次增加了黃曲霉毒素測定法2010年版一部年版一部 正文：僵蠶、陳皮、酸棗仁、桃仁、胖大海品正文：僵蠶、陳皮、酸棗仁、桃仁、胖大海品種項下增加了黃曲霉毒素殘留量檢查種項下增加了黃曲霉毒素殘留量檢查 附錄：繼續(xù)收載了黃曲霉毒素測定法附錄：繼續(xù)收載了黃曲霉毒素測定法2010

10、年版一部第二增補本年版一部第二增補本修訂了附錄方法修訂了附錄方法 刪除了流速規(guī)定刪除了流速規(guī)定增訂了另一種衍生方法：即光化學衍生法增訂了另一種衍生方法：即光化學衍生法 取消了免疫親和柱的品牌規(guī)定取消了免疫親和柱的品牌規(guī)定2015年版四部通則年版四部通則2351黃曲霉毒素測定法黃曲霉毒素測定法 增加了第二法：高效液相色譜增加了第二法：高效液相色譜-串聯(lián)質譜法串聯(lián)質譜法 增加附注：增加附注：“當測定結果超出限度時，采用第二當測定結果超出限度時，采用第二法進行確認法進行確認”2015年版四部通則增加年版四部通則增加中藥中真菌毒素測定指導中藥中真菌毒素測定指導原則原則 基本原則（中藥中真菌毒素的分類、

11、監(jiān)控品種、基本原則（中藥中真菌毒素的分類、監(jiān)控品種、測定方法、限值擬定）測定方法、限值擬定） 基本內容（高效液相色譜法、高效液相色譜基本內容（高效液相色譜法、高效液相色譜-質質譜聯(lián)用法）譜聯(lián)用法）2015年版四部通則年版四部通則9302 中藥有害殘留物限量制中藥有害殘留物限量制定指導原則定指導原則中關于黃曲霉毒素的規(guī)定中關于黃曲霉毒素的規(guī)定 “由于黃曲霉毒素毒性強，目前國際上由于黃曲霉毒素毒性強，目前國際上不建議不建議設定黃曲霉毒素的安全耐受量和無毒作用劑量設定黃曲霉毒素的安全耐受量和無毒作用劑量，也無最大限量理論值計算公式，限量越低越，也無最大限量理論值計算公式，限量越低越好好”。中國藥典中

12、國藥典20152015年版正文收載品種年版正文收載品種根及根莖類：遠志根及根莖類：遠志果實種子類：大棗、肉豆蔻、決明子、麥芽、陳果實種子類：大棗、肉豆蔻、決明子、麥芽、陳皮、使君子、柏子仁、胖大海、蓮子、桃仁、檳皮、使君子、柏子仁、胖大海、蓮子、桃仁、檳郎、酸棗仁、薏苡仁郎、酸棗仁、薏苡仁動物類：僵蠶、水蛭、地龍、全蝎、蜈蚣動物類：僵蠶、水蛭、地龍、全蝎、蜈蚣共共19種種，較，較2010年版藥典年版藥典增加增加14種種黃曲霉毒素藥典檢測方法詳解黃曲霉毒素藥典檢測方法詳解液相條件：液相條件：C18，甲醇，甲醇-乙腈乙腈-水（水（40:18:42）衍生方式：衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化學衍生柱后

13、碘衍生、柱后光化學衍生混合對照品溶液的制備：混合對照品溶液的制備：液體標液液體標液（B1B2G1G2=10.310.3 ug/ml）梯度稀釋）梯度稀釋500倍倍供試品溶液的制備：供試品溶液的制備：15g粉末，粉末，3gNaCl，70%甲醇提取，免疫親和柱純化甲醇提取，免疫親和柱純化測定：測定： 吸取混合對照品溶液吸取混合對照品溶液5l、10l、15l、20l、25l，注入色譜儀，繪制標準曲線。，注入色譜儀，繪制標準曲線。吸取供試品溶液吸取供試品溶液20-25l，測定，測定方法來源：方法來源：中國藥典中國藥典2015年版四部通則年版四部通則2351黃曲霉毒素測定法黃曲霉毒素測定法基本步驟基本步驟

14、 提取提取 凈化（活化、上樣、洗雜、洗脫）凈化（活化、上樣、洗雜、洗脫） 測定測定 隨行質量控制（質控樣、隨行加樣回收）隨行質量控制（質控樣、隨行加樣回收）泵流操作架泵流操作架免疫親和柱免疫親和柱HPLC-熒光檢測器熒光檢測器光化學衍生器光化學衍生器自動固相萃取儀自動固相萃取儀凈化步驟凈化步驟取取15ml（離心后的提取液），加水至（離心后的提取液），加水至50ml濾過，取濾過，取20ml，通過免疫親和柱，通過免疫親和柱，流速流速3ml/min加水洗滌兩次，每次加水洗滌兩次，每次10ml過空氣過空氣10秒，將水擠出柱子秒，將水擠出柱子分次加甲醇分次加甲醇1.5ml，自然洗脫，過空氣，定容至，自然

15、洗脫，過空氣，定容至2ml免疫親和柱的原理免疫親和柱的原理利用利用抗原抗體免疫反抗原抗體免疫反應應的原理，使用大劑量的原理，使用大劑量的單克隆抗體，選擇性的單克隆抗體，選擇性的將樣品提取液中的黃的將樣品提取液中的黃曲霉毒素吸附，用水將曲霉毒素吸附，用水將雜質洗脫除去，再用甲雜質洗脫除去，再用甲醇定量將黃曲霉毒素洗醇定量將黃曲霉毒素洗脫，達到分離凈化目的脫，達到分離凈化目的黃曲霉毒素黃曲霉毒素單克隆抗體單克隆抗體雜質雜質黃曲霉毒素的衍生化黃曲霉毒素的衍生化衍生原因衍生原因 黃曲霉毒素黃曲霉毒素B1、G1熒光遇水要淬滅熒光遇水要淬滅，檢測前需要，檢測前需要衍生化衍生化藥典附錄收載的兩種衍生方法藥典

16、附錄收載的兩種衍生方法 碘衍生法：碘作為衍生劑，對衍生溫度有要碘衍生法：碘作為衍生劑，對衍生溫度有要求，試劑對儀器有腐蝕性，需要沖洗求，試劑對儀器有腐蝕性，需要沖洗 光化學衍生法：紫外光燈（光化學衍生法：紫外光燈（254nm ）照射，）照射，操作簡單，對衍生溫度無要求，不需要其他操作簡單，對衍生溫度無要求，不需要其他衍生劑，無需沖洗衍生劑，無需沖洗 對黃曲霉毒素對黃曲霉毒素B1和和G1進行衍生進行衍生，黃曲霉毒素，黃曲霉毒素B2和和G2不受該衍生步驟的影響不受該衍生步驟的影響AFB1AFG1黃曲霉毒素的衍生化黃曲霉毒素的衍生化黃曲霉毒素的衍生化黃曲霉毒素的衍生化結果報告結果報告低于檢測限低于檢

17、測限（標出檢測限）（標出檢測限）報告具體值報告具體值未檢出未檢出限度內限度內限度外限度外報告具體值報告具體值方法難點方法難點痕量分析痕量分析ppb級，要求高靈敏度級，要求高靈敏度毒性強，具有一定的風險性毒性強，具有一定的風險性安全防護措施安全防護措施基質復雜基質復雜注意事項注意事項取樣的代表性取樣的代表性 黃曲霉毒素在樣品中分布不均勻黃曲霉毒素在樣品中分布不均勻免疫親和柱的使用免疫親和柱的使用 儲存、使用溫度（使用說明書）儲存、使用溫度（使用說明書）安全防護安全防護 操作人員專門培訓，全程穿工作服佩戴手套操作人員專門培訓，全程穿工作服佩戴手套注意事項及實驗室建議注意事項及實驗室建議對照品的使用對照品的使用 使用黃曲霉毒素混合對照品使用黃曲霉毒素混合對照品，不使用黃曲霉毒，不使用黃曲霉毒素固體純品自行配置素固體純品自行配置 對照品貯備液避光、低溫、密閉