免疫自動化儀器分析

1、免疫自動化免疫自動化儀器分析儀器分析 醫(yī)學(xué)檢驗系 劉利東概論早期免疫分析通過觀察沉淀物形成，凝集及溶血現(xiàn)象發(fā)生來分析，如免疫擴散、免疫電泳、血凝試驗、補體結(jié)合等上世紀50年代末60年代初，利用AG-AB復(fù)合物形成使?jié)岫雀淖?，再用比濁計來比濁，但因其敏感性差未被接?0年代初，開始有自動檢測系統(tǒng)，但因其用的是激光為光源，固定波長，靈敏度較低，而且時間一般要23小時概論v70年代未，速率比濁計的出現(xiàn)，使抗原抗體結(jié)合的反應(yīng)在幾十秒內(nèi)出結(jié)果，可以說是免疫化學(xué)測定的革命的發(fā)展v隨著標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，免疫化學(xué)可以納入臨床化學(xué)檢驗范疇v如今，自動化免疫分析系統(tǒng)更加飛速發(fā)展v自動化免疫分析的基礎(chǔ)是抗原抗體的結(jié)合

2、，具有高特異性；手段多是利用標(biāo)記技術(shù)而將檢測信號放大，具有高靈敏度自動化免疫儀器種類（應(yīng)用技術(shù)）v免疫比濁分析技術(shù)v化學(xué)發(fā)光、電發(fā)光分析技術(shù)v熒光免疫分析技術(shù)v放射免疫分析技術(shù)v酶免疫分析技術(shù)v流式細胞術(shù)免疫比濁v利用抗原抗體結(jié)合后溶液的濁度變化而檢測的一種方法v此法準確快速，已成為免疫診斷技術(shù)中重要的檢測手段v比濁法與比色法散射免疫比濁分析法 基本原理：抗原抗體復(fù)合物對一定波長的光產(chǎn)生折射、偏轉(zhuǎn)，偏轉(zhuǎn)角度及散射光強度與復(fù)合物粒子的大小和量有關(guān)（圖）Rayleigh散射（圖） Mile散射Heidelberger曲線定時散射比濁分析v基本原理：免疫沉淀反應(yīng)和散射比濁分析結(jié)合之技術(shù)，反應(yīng)分兩個階

3、段，預(yù)反應(yīng)階段和反應(yīng)階段（圖）v保證抗原不過量的方法： 確保反應(yīng)體系抗體過量 對抗原過量進行閾值限定預(yù)反應(yīng)階段5ul樣本抗原過剩區(qū)閾值信號反 應(yīng) 階 段45ul樣本7.5秒2分鐘6分鐘（2+4分鐘）定時散射比濁反應(yīng)曲線圖定時散射比濁反應(yīng)曲線圖抗原不過量抗原過量速率散射比濁分析v基本原理：抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種動態(tài)測定法，適時檢測抗原抗體復(fù)合物形成的散射光信號v最快反應(yīng)時間（圖）v抗原過量檢測（圖）抗原濃度遞增抗原濃度遞增散射光峰值散射光峰值峰值信號與抗原抗體反應(yīng)之間的關(guān)系圖峰值信號與抗原抗體反應(yīng)之間的關(guān)系圖ABCDFGHI反應(yīng)時間（秒）06085散射率抗體過量抗原過量第二峰值信號抗原量檢測速率

4、峰值信號產(chǎn)生免疫透射比濁v基本原理：檢測信號是通過溶液的光，測量角度與正前方夾角為0（圖），保持抗體過量，形成可溶性AG-AB復(fù)合物，使介質(zhì)濁度發(fā)生改變。v實驗要求： 選擇親和力高的抗體，抗原抗體復(fù)合物要大、數(shù)量要多，反應(yīng)時間充分。單色器透射比濁計散射散射比濁計比濁計散射比濁和透射比濁的區(qū)別示意圖透射光透射光散射光散射光散射光散射光膠乳濁度測定法v基本原理是：將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時，則使膠乳顆粒發(fā)生凝集。單個膠乳顆粒在入射光波之內(nèi)不阻礙光線透過，兩個或兩個以上膠乳顆粒凝聚時則使透過光減少，這種減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比，當(dāng)然也與待測抗原量呈正比（

5、圖） 光波光波膠乳濁度測定法原理dd 2d影響免疫比濁的因素 v抗原抗體比例v抗體純度和效價v增聚劑（PEG）自動免疫濁度分析儀的要求v校準程序，使儀器處于正常的工作狀態(tài)v定標(biāo)程序，保證檢測結(jié)果的準確性v自動控制，保證實施實驗條件中的抗原抗體反應(yīng)體系要求v自動系統(tǒng)，障礙的檢測和預(yù)警。自動化免疫儀器種類（應(yīng)用技術(shù)）v免疫比濁分析技術(shù)v化學(xué)發(fā)光、電發(fā)光分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光、電發(fā)光分析技術(shù)v熒光免疫分析技術(shù)v放射免疫分析技術(shù)v酶免疫分析技術(shù)v流式細胞術(shù)化學(xué)發(fā)光自動免疫分析v化學(xué)發(fā)光是指在化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生光的發(fā)射現(xiàn)象v基本原理：標(biāo)記在抗原或抗體上的發(fā)光物質(zhì)在堿性介質(zhì)中氧化時產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的中間體，中間體回基

6、態(tài)時產(chǎn)生輻射，多余的能量為發(fā)射光子，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，再對光信號進行接收轉(zhuǎn)化，可得檢測物濃度v發(fā)光物質(zhì)須具備：氧化致發(fā)光、光量子產(chǎn)額高、理化性能好化學(xué)發(fā)光自動免疫分析類型v 化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA） 是一種用發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體的一類免疫分析法，用來標(biāo)記的發(fā)光物必須能參與發(fā)光反應(yīng)、標(biāo)記和偶聯(lián)后能穩(wěn)定、理化性質(zhì)和免疫特性不改變，多用吖啶酯類和苯酚類化合物。 化學(xué)發(fā)光自動免疫分析類型v化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA） 以催化反應(yīng)的酶為標(biāo)記物，抗原抗體結(jié)合后，其中的酶可對發(fā)光體系產(chǎn)生催化作用，產(chǎn)生發(fā)光效應(yīng)。發(fā)光信號與抗原抗體的量成正比。多用的發(fā)光體系是HRP-魯米諾。 化學(xué)發(fā)光自動免疫分析類型v微粒子

7、化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECIA） 也是一種酶免疫分析，用磁珠作為固相載體，增加反應(yīng)體積和分離效率。標(biāo)記的酶多為ALP。化學(xué)發(fā)光自動免疫分析類型v電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA） 一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光二個過程,其中應(yīng)用了“親和素-生物素”放大系統(tǒng)，使檢測的靈敏度大大提高v以雙抗體夾心法為例之圖示（圖）ECLIA體系結(jié)構(gòu)圖體系結(jié)構(gòu)圖ECLIA檢測流程圖一檢測流程圖一（雙抗體夾心的形成）（雙抗體夾心的形成）ECLIA檢測流程圖二檢測流程圖二 （生物素與親和素結(jié)合）（生物素與親和素結(jié)合）ECLIA檢測流程圖三檢測流程圖三 （磁珠吸引吸附于電極表面）（

8、磁珠吸引吸附于電極表面）ECLIA檢測流程圖四檢測流程圖四 （電極充電啟動電化學(xué)反應(yīng)）（電極充電啟動電化學(xué)反應(yīng)）ECLIA檢測流程圖五檢測流程圖五 （撤消磁場沖洗磁珠）（撤消磁場沖洗磁珠）化學(xué)發(fā)光自動免疫分析v化學(xué)發(fā)光免疫分析是免疫技術(shù)、發(fā)光技術(shù)和計算機系統(tǒng)的結(jié)合，具有特異性強、靈敏度高（pg/ml)、精密度好、準確度好等特點，越來越多的人體微量指標(biāo)應(yīng)用這種方法來檢測，已漸漸代替了RIA。自動化免疫儀器種類（應(yīng)用技術(shù)）v免疫比濁分析技術(shù)v化學(xué)發(fā)光、電發(fā)光分析技術(shù)v熒光免疫分析技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)v放射免疫分析技術(shù)v酶免疫分析技術(shù)v流式細胞術(shù)熒光免疫自動化v利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗原抗體的一種檢測方法

9、v由免疫反應(yīng)、熒光及計算機技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的技術(shù)v主要有時間分辨熒光免疫測定和熒光偏振免疫測定熒光免疫自動化v時間分辨熒光免疫測定（TRFIA）：AG-AB結(jié)合，某些熒光物質(zhì)發(fā)長壽命熒光，時間分辨技術(shù)v利用長壽命熒光物質(zhì)（鑭氏元素銪螯合物）標(biāo)記抗原或抗體，測定過程中，可利用延遲時間來消除非特異性的熒光干擾（圖） 。光強度激發(fā)短壽命熒光長壽命熒光延遲時間測量時間銪螯合物的激發(fā)、發(fā)射光譜熒光免疫自動化vTRFIA設(shè)計中的一些注意事項： Stakes位移（圖） 解離增強熒光免疫自動化v熒光偏振免疫測定：以小分子物質(zhì)與大分子物質(zhì)的旋轉(zhuǎn)差異而使它們對偏振光的吸收不同為依據(jù)檢測小分子藥物v熒光酶免疫分析：標(biāo)記

10、酶參與反應(yīng)波長300 400 500 600 700Stakes吸光度Stakes位移示意圖激發(fā)光激發(fā)光熒光熒光自動化免疫儀器種類（應(yīng)用技術(shù)）v免疫比濁分析技術(shù)v化學(xué)發(fā)光、電發(fā)光分析技術(shù)v熒光免疫分析技術(shù)v放射免疫分析技術(shù)v酶免疫分析技術(shù)v流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)流式細胞儀v流式細胞儀（流式細胞儀（FCM）是以激光為光源，檢測）是以激光為光源，檢測生物學(xué)顆粒理化性質(zhì)的儀器生物學(xué)顆粒理化性質(zhì)的儀器v生物學(xué)顆粒包括免疫復(fù)合物、生物學(xué)顆粒包括免疫復(fù)合物、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、細胞器、細胞、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、細胞器、細胞、染色體、真核細胞等染色體、真核細胞等v理化性質(zhì)則為細胞大

11、小、形狀、胞漿顆粒、理化性質(zhì)則為細胞大小、形狀、胞漿顆粒、DNA含量、酶活性等含量、酶活性等流式細胞儀vFCM綜合了激光技術(shù)、電子技術(shù)、流體力學(xué)、綜合了激光技術(shù)、電子技術(shù)、流體力學(xué)、細胞化學(xué)及計算機技術(shù)，被稱為實驗室細胞化學(xué)及計算機技術(shù)，被稱為實驗室“CT”vFCM現(xiàn)正廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、現(xiàn)正廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)、臨床檢腫瘤學(xué)、血液學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)、臨床檢驗學(xué)等驗學(xué)等流式細胞儀基本原理v基本原理：單個經(jīng)熒光染料染色的細胞經(jīng)過激光激發(fā)后，發(fā)射的熒光在不同的角度進行測量，并對其信號進行綜合分析（圖）v細胞分選原理：通過測量區(qū)的細胞若其參數(shù)符合實驗

12、設(shè)計的條件，在經(jīng)過偏轉(zhuǎn)板時被充上相應(yīng)的電荷并被偏轉(zhuǎn)收集（圖）v液流系統(tǒng)：樣本和鞘流液組成（圖）v光學(xué)系統(tǒng)：光源可為汞燈或激光激光v信號接收系統(tǒng)：散射光和熒光的檢測流式細胞儀基本組成側(cè)向熒光信號鞘流前向散射光流式細胞流動池示意圖噴嘴激光束散射光的檢測v信號的產(chǎn)生及強度（圖）v前向散射光（圖）v側(cè)向散射光（圖）信號的產(chǎn)生激光照射區(qū)信號檢測曲線細胞中熒光素今量與信號的關(guān)系信號的產(chǎn)生細胞中熒光素今量與信號的關(guān)系信號的產(chǎn)生激光器激光器激光探測器大顆粒小顆粒前散射光示意圖激光器激光器側(cè)向散射光探測器復(fù)雜顆粒簡單顆粒側(cè)向散射光示意圖熒光測量v熒光染料染色的細胞通過測量區(qū)時，細胞中特異性熒光物質(zhì)受激發(fā)產(chǎn)生熒光信號，后者強弱表示待測物質(zhì)的多少v熒光的檢測系統(tǒng)由濾光片和檢測器組成，濾光片的作用是使激發(fā)光波長盡可能接近熒光染料的激發(fā)光譜峰值，濾除非熒光信號，提高熒光的檢測強度流式細胞儀免疫分析的技術(shù)要求v儀器性能指標(biāo)：熒光分辨率、熒光靈敏度、前向角散色光靈敏度、前向角散光分辨率、分析/分選速度、分選純度、