wzc高級生化4-蛋白質(zhì)的分離分析

1、（一）材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎（一）材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎 分離提純某一種蛋白質(zhì)時，首先要把蛋白質(zhì)從組分離提純某一種蛋白質(zhì)時，首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)，不喪失織或細(xì)胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性。活性。1. 1. 機(jī)械破碎法機(jī)械破碎法 利用機(jī)械力的剪切作用，使細(xì)胞破碎。常用設(shè)利用機(jī)械力的剪切作用，使細(xì)胞破碎。常用設(shè)備有，高速組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽等。備有，高速組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽等。2. 2. 滲透破碎法滲透破碎法 在低滲條件使細(xì)胞溶脹而破碎。在低滲條件使細(xì)胞溶脹而破碎。3. 3. 反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法 生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而生物

2、組織經(jīng)凍結(jié)后，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破。該法簡單方便，但對溫度變化敏使細(xì)胞脹破。該法簡單方便，但對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。4. 4. 超聲波法超聲波法 使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞破碎。均而使細(xì)胞破碎。5. 5. 酶法酶法 如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等。如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等。( (二二) ) 蛋白質(zhì)的抽提蛋白質(zhì)的抽提 通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來。通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來。所用緩沖液的所用緩沖液的pHpH、離子強(qiáng)度、組成成分等應(yīng)根據(jù)性質(zhì)離子強(qiáng)度、組成成分等應(yīng)根據(jù)性質(zhì)而定。

3、而定。 如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（活性劑（SDSSDS、tritonX-100tritonX-100等），使膜結(jié)構(gòu)破壞，利等），使膜結(jié)構(gòu)破壞，利于蛋白質(zhì)與膜分離。于蛋白質(zhì)與膜分離。 在抽提過程中，應(yīng)注意溫度，避免劇烈攪拌等，在抽提過程中，應(yīng)注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。以防止蛋白質(zhì)的變性。 蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。的。 性質(zhì)性質(zhì) 方法方法v 分

4、子大小分子大小 透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾v 溶解度溶解度 等電點沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等電點沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀v 電荷電荷 電泳、離子交換層析電泳、離子交換層析v 吸附性質(zhì)吸附性質(zhì) 吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析）析）v 特異性結(jié)合特異性結(jié)合親和層析親和層析蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)的分離純化方法分子大小分子大小透析和超過濾：透析和超過濾：透析指利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜而與小透析指利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜而與小分子分離；超濾是利用壓力或離心力使小分子溶質(zhì)通過半透膜分子分離；超濾是利用壓力或離

5、心力使小分子溶質(zhì)通過半透膜而蛋白質(zhì)被截留在膜上而分離。而蛋白質(zhì)被截留在膜上而分離。密度梯度離心：密度梯度離心：蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，時，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與其自身密度相等的介質(zhì)密度梯且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與其自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成度時，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成不同的區(qū)帶。不同的區(qū)帶。凝膠過濾：凝膠過濾：即分子排阻層析。凝膠顆粒內(nèi)部為多孔的網(wǎng)狀結(jié)即分子排阻層析。凝膠顆粒內(nèi)部

6、為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大分子最先流出層析柱。構(gòu)。大分子最先流出層析柱。溶解度溶解度等電點沉淀和等電點沉淀和pHpH控制控制鹽溶和鹽析：鹽溶和鹽析：中性鹽在低濃度時可增加蛋白質(zhì)的溶解度，中性鹽在低濃度時可增加蛋白質(zhì)的溶解度，即鹽溶。原因是蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋即鹽溶。原因是蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而與水分子相互作用加強(qiáng)；當(dāng)離子強(qiáng)白質(zhì)分子彼此排斥，而與水分子相互作用加強(qiáng)；當(dāng)離子強(qiáng)度增大到足夠高時，此時與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)接觸的自由水度增大到足夠高時，此時與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)接觸的自由水被移去以溶劑化鹽離子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露，使蛋被移去以溶劑化鹽離子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)

7、疏水基團(tuán)暴露，使蛋白質(zhì)因疏水作用凝聚沉淀。白質(zhì)因疏水作用凝聚沉淀。有機(jī)溶劑分級分離法：有機(jī)溶劑分級分離法：一是降低介質(zhì)的介電常數(shù)，二是與一是降低介質(zhì)的介電常數(shù)，二是與蛋白質(zhì)爭奪水化水。蛋白質(zhì)爭奪水化水。溫度沉淀：溫度沉淀：溫度對溶解度有影響，低溫穩(wěn)定，高溫不穩(wěn)溫度對溶解度有影響，低溫穩(wěn)定，高溫不穩(wěn)定。在定。在0-400-40，大部分的球狀蛋白質(zhì)溶解度隨溫度升高，大部分的球狀蛋白質(zhì)溶解度隨溫度升高而增加。而增加。蛋白質(zhì)分離純化方法蛋白質(zhì)分離純化方法電荷電荷電泳電泳（凈電荷、分子（凈電荷、分子大小、形狀）大小、形狀）區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳聚丙烯酰氨凝膠電泳（聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGEPAGE）毛細(xì)管電

8、泳毛細(xì)管電泳離子交換層析離子交換層析等電聚焦：等電聚焦：外加電場時，蛋白質(zhì)混合物在具有外加電場時，蛋白質(zhì)混合物在具有pHpH梯度的介質(zhì)中梯度的介質(zhì)中移向并聚焦（停留）在等于其等電點的移向并聚焦（停留）在等于其等電點的pHpH處，形成區(qū)帶。處，形成區(qū)帶。層析聚焦：層析聚焦：層析柱中建立連續(xù)的層析柱中建立連續(xù)的pHpH梯度，蛋白質(zhì)樣品由柱上端梯度，蛋白質(zhì)樣品由柱上端 隨緩沖液的展開而聚焦在各自的等電點隨緩沖液的展開而聚焦在各自的等電點pHpH處，形成區(qū)段。處，形成區(qū)段。吸附吸附：吸附層析，吸附劑（硅石、氧化鋁、活性碳）和疏水吸附劑，吸附層析，吸附劑（硅石、氧化鋁、活性碳）和疏水吸附劑， 與待分離分

9、子和雜質(zhì)分子的吸附與解吸能力不同。與待分離分子和雜質(zhì)分子的吸附與解吸能力不同。特異親和力：特異親和力：親和層析親和層析其它：其它：如高效液相層析（如高效液相層析（HPLCHPLC）, ,快速蛋白液相層析（快速蛋白液相層析（FPLCFPLC）（三）蛋白質(zhì)粗制品的獲得（三）蛋白質(zhì)粗制品的獲得 選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離。主要根據(jù)選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離。主要根據(jù)蛋白溶解度的差異。蛋白溶解度的差異。1. 1. 等電點沉淀法等電點沉淀法2. 2. 鹽析法鹽析法 分步鹽析分離不同蛋白質(zhì)。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其分步鹽析分離不同蛋白質(zhì)。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保

10、持其天然性質(zhì)，并能再度溶解而不變性。天然性質(zhì)，并能再度溶解而不變性。3. 3. 有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法 如乙醇、丙酮等，它們的介電常數(shù)比水低，能降低球狀蛋白質(zhì)如乙醇、丙酮等，它們的介電常數(shù)比水低，能降低球狀蛋白質(zhì)溶解度溶解度; ;有機(jī)溶劑會破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，促使蛋白質(zhì)分子變有機(jī)溶劑會破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出。得不穩(wěn)定而析出。 有機(jī)溶劑會使蛋白質(zhì)變性，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機(jī)溶劑會使蛋白質(zhì)變性，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機(jī)溶劑濃度。有機(jī)溶劑濃度。（四）樣品的進(jìn)一步分離純化（四）樣品的進(jìn)一步分離純化 用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)用等

11、電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，須進(jìn)一步分離提純一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，須進(jìn)一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。才能得到有一定純度的樣品。 常用的純化方法有：常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等交換纖維素層析、親和層析等。有時還需要這。有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。樣品。也稱凝膠過濾或分子排也稱凝膠過濾或分子排阻層析。這是根據(jù)分子大阻層析。這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物有效小分離蛋白質(zhì)混合物有效的方法之一。的方法之一。 凝膠過濾所用的介質(zhì)一凝膠過濾所用的介

12、質(zhì)一般是般是: :交聯(lián)葡聚糖凝膠交聯(lián)葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠SephacrylSephacryl 商品名商品名SephadexSephadex 它由線形它由線形1 1，6 6葡葡聚糖和聚糖和3-3-氯氯-1,2-1,2環(huán)氧丙烷環(huán)氧丙烷以醚鍵相互交聯(lián)而成的化以醚鍵相互交聯(lián)而成的化合物。合物。 通過控制葡聚糖和交鏈通過控制葡聚糖和交鏈劑的比例及反應(yīng)條件決定劑的比例及反應(yīng)條件決定其交聯(lián)度的大小，從而得其交聯(lián)度的大小，從而得到各種規(guī)格的葡聚糖凝膠。到各種規(guī)格的葡聚糖凝膠。用用G G表示交聯(lián)度，表示交聯(lián)度，G G越小，越小，交聯(lián)度越大，凝膠中網(wǎng)眼交聯(lián)度越大，凝膠中網(wǎng)眼越

13、小，吸水量就越小越小，吸水量就越小。 葡聚糖凝膠的外觀為白色珠狀顆粒，在顯微鏡下放大葡聚糖凝膠的外觀為白色珠狀顆粒，在顯微鏡下放大700700倍倍，可見其表面的網(wǎng)狀皺紋。它帶有大量的羥基，親水可見其表面的網(wǎng)狀皺紋。它帶有大量的羥基，親水性好，因此在水溶液或電解質(zhì)溶液中極易膨脹。性好，因此在水溶液或電解質(zhì)溶液中極易膨脹。 由于各種型號的葡聚糖凝的交聯(lián)度由于各種型號的葡聚糖凝的交聯(lián)度( (交聯(lián)劑在葡聚糖凝交聯(lián)劑在葡聚糖凝膠中占的百分?jǐn)?shù)膠中占的百分?jǐn)?shù)) )不同，致使其在水中的膨脹度不同，致使其在水中的膨脹度( (床體積床體積) )、吸水量吸水量( (每克干凝膠在水中充分膨脹所需的水量。但不包括每克干

14、凝膠在水中充分膨脹所需的水量。但不包括顆粒間所帶的水量顆粒間所帶的水量) )、篩孔的大小和分級范圍有明顯的差異。、篩孔的大小和分級范圍有明顯的差異。 例如，例如，Sephadex G25Sephadex G25比比G100G100交聯(lián)度大。而影脹度、交聯(lián)度大。而影脹度、吸水量和篩孔直徑前者小于后者。另外，前者對球形蛋白分吸水量和篩孔直徑前者小于后者。另外，前者對球形蛋白分級范圍較窄。即在級范圍較窄。即在1000(1000(下限下限) )一一5000(5000(上限上限) )之間，而后者范之間，而后者范圍較寬，即在圍較寬，即在40001500004000150000之間。之間。表表 Sephad

15、ex1的種類與特性的種類與特性型號型號分離范圍分離范圍（分子量）（分子量）最小溶脹時（最小溶脹時（h）2025 100G107001.00.13 123G151 5001.50.23 12.53.5G255 0002.50.23 146G50150020 0008.00.33 1911G753 00070 0007.50.524 11215G1004 000150 00010.01.072 11520G1505 000800 00015.01.5 72 12030G2005 0003000 00020.02.072 13040）床體積（床體積（ml）/干凝膠（干凝膠（mg吸水量吸水量（ml/g

16、）SephadexSephadex的穩(wěn)定性的穩(wěn)定性 葡聚糖凝膠在水、鹽、堿、弱酸溶液和有機(jī)溶葡聚糖凝膠在水、鹽、堿、弱酸溶液和有機(jī)溶劑中是穩(wěn)定的，不溶解的，而且很少產(chǎn)生化學(xué)降解。劑中是穩(wěn)定的，不溶解的，而且很少產(chǎn)生化學(xué)降解。在中性條件下，葡在在中性條件下，葡在0 01 1m01m01L HClL HCl溶液中浸泡溶液中浸泡1212小時，甚至在小時，甚至在0 00202m01m01L HClL HCl溶液中浸泡溶液中浸泡6 6個個月以上，對分離效果無明顯的影響。月以上，對分離效果無明顯的影響。 但是，當(dāng)暴露于強(qiáng)酸或氧化劑溶液時，則容易但是，當(dāng)暴露于強(qiáng)酸或氧化劑溶液時，則容易使糖苷鍵水解斷裂，因此

17、，要避免與其接觸。使糖苷鍵水解斷裂，因此，要避免與其接觸。 葡聚糖凝膠欲在室溫下長期保存時，應(yīng)加入適量葡聚糖凝膠欲在室溫下長期保存時，應(yīng)加入適量的防腐劑如氯仿、疊氮化鈉等。不然，微生物將生的防腐劑如氯仿、疊氮化鈉等。不然，微生物將生長。長。吸附性：吸附性： 葡聚糖凝膠系弱酸性物質(zhì)。這是由于其每葡聚糖凝膠系弱酸性物質(zhì)。這是由于其每克干膠中含克干膠中含10201020微克當(dāng)量的羧基基團(tuán)所致。微克當(dāng)量的羧基基團(tuán)所致。該基團(tuán)能與分離物中電荷基團(tuán)該基團(tuán)能與分離物中電荷基團(tuán)( (尤其是堿性蛋尤其是堿性蛋白質(zhì)白質(zhì)) )發(fā)生吸附作用。但是，這種吸附作用可發(fā)生吸附作用。但是，這種吸附作用可以借助提高洗脫液的離子

18、強(qiáng)度得以克服。當(dāng)以借助提高洗脫液的離子強(qiáng)度得以克服。當(dāng)離子強(qiáng)度大于離子強(qiáng)度大于0.050.05時，一般對弱堿性蛋白質(zhì)時，一般對弱堿性蛋白質(zhì)就無吸附力了。因此進(jìn)行葡聚糖凝膠層析時，就無吸附力了。因此進(jìn)行葡聚糖凝膠層析時，常用含有常用含有NaCLNaCL的緩沖液作洗脫液。的緩沖液作洗脫液。 新的葡聚糖凝膠對蛋白質(zhì)往往有不可逆新的葡聚糖凝膠對蛋白質(zhì)往往有不可逆的吸附性能，雖然吸附的數(shù)量較少，但是在的吸附性能，雖然吸附的數(shù)量較少，但是在制作測定蛋白質(zhì)分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線時，或者制作測定蛋白質(zhì)分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線時，或者分離純化極難得到的物質(zhì)時，需先用易得到分離純化極難得到的物質(zhì)時，需先用易得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)層

19、析，以便消除其影響。的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)層析，以便消除其影響。 此外，葡聚糖凝膠對芳香族化合物或雜此外，葡聚糖凝膠對芳香族化合物或雜環(huán)化合物以及某些凝集家具有較強(qiáng)的吸附作環(huán)化合物以及某些凝集家具有較強(qiáng)的吸附作用，若采用凝膠過濾層析分離它們時，往往用，若采用凝膠過濾層析分離它們時，往往利用的是吸附原理，而不是排阻原理。利用的是吸附原理，而不是排阻原理。 瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的。在制備過程瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的。在制備過程要盡可能將其中硫酸根和羧基基團(tuán)的瓊脂膠除去，要盡可能將其中硫酸根和羧基基團(tuán)的瓊脂膠除去，才能得到不帶電荷基團(tuán)的瓊脂糖。才能得到不帶電荷基團(tuán)的瓊脂糖。 瓊脂糖是由瓊脂糖是由DD半

20、乳糖和半乳糖和3 3、6 6脫水的脫水的LL半乳半乳糖連接構(gòu)成的多糖鏈。這種多糖鏈在糖連接構(gòu)成的多糖鏈。這種多糖鏈在100100左右時左右時呈液態(tài)，當(dāng)溫度下降到呈液態(tài)，當(dāng)溫度下降到4545以下時，它們之間以氫以下時，它們之間以氫鍵方式相互連接就成了線性的雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，鍵方式相互連接就成了線性的雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。經(jīng)凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。 瓊脂糖的商品名稱是因生產(chǎn)廠家不瓊脂糖的商品名稱是因生產(chǎn)廠家不同而異同而異 瑞典稱瑞典稱SepharoseSepharose 美國稱美國稱BioBiogel Agel A 英國稱英國稱SegavacSegavac 中國的同類產(chǎn)品

21、與瑞典相同。中國的同類產(chǎn)品與瑞典相同。 這些瓊脂糖中除這些瓊脂糖中除SegavacSegavac外，都是外，都是以珠狀瓊脂糖凝膠形式出售。以珠狀瓊脂糖凝膠形式出售。 瓊脂糖凝膠對尿素和鹽酸胍等破壞氫鍵的試劑有瓊脂糖凝膠對尿素和鹽酸胍等破壞氫鍵的試劑有較強(qiáng)的抵抗力較強(qiáng)的抵抗力；在；在pH4.4-9.0pH4.4-9.0的緩沖液中穩(wěn)定。的緩沖液中穩(wěn)定。室溫保存，其物理穩(wěn)定性超過了聚丙烯酰胺和葡室溫保存，其物理穩(wěn)定性超過了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝膠。聚糖凝膠。 瓊脂糖凝膠在干燥狀態(tài)下保存時易破裂，故放在瓊脂糖凝膠在干燥狀態(tài)下保存時易破裂，故放在含防腐劑的水溶液中，同時還要避免劇烈的攪動。含防腐劑的水溶液

22、中，同時還要避免劇烈的攪動。 脂糖凝膠按其濃度來分有脂糖凝膠按其濃度來分有Sepharose 2B(2Sepharose 2B(2濃濃度度) )、4 4B B和和6 6B(6B(6) )。Sepharose 6BSepharose 6B的機(jī)械強(qiáng)度大的機(jī)械強(qiáng)度大于于2 2B B，但是篩孔小于但是篩孔小于2 2B.B. SepharoseSepharose與與1 1，33二溴異丙醇在強(qiáng)堿性條件下反應(yīng)二溴異丙醇在強(qiáng)堿性條件下反應(yīng)后，即生成后，即生成CL-CL-型交聯(lián)瓊脂糖。這種瓊脂糖的篩孔與同濃型交聯(lián)瓊脂糖。這種瓊脂糖的篩孔與同濃度的未交聯(lián)的瓊脂糖相同，但熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性大度的未交聯(lián)的瓊脂糖相同

23、，但熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性大大提高。大提高。 CL-CL-型交聯(lián)瓊脂糖可在廣范圍的型交聯(lián)瓊脂糖可在廣范圍的pHpH溶液中使用溶液中使用( (pH3pH31313）, ,即使較強(qiáng)的堿溶液短時間處理，期性能也不即使較強(qiáng)的堿溶液短時間處理，期性能也不會改變。會改變。 但在氧化劑存在時，會有少量的多糖鏈發(fā)生解聚。但在氧化劑存在時，會有少量的多糖鏈發(fā)生解聚。 瓊脂按凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖瓊脂按凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠好。凝膠好。產(chǎn)品名稱產(chǎn)品名稱規(guī)格規(guī)格特性及應(yīng)用特性及應(yīng)用價格價格 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠FFFF100100mlml用于大分子蛋白、用于大分子蛋白、超螺旋超螺旋

24、DNADNA、病毒純病毒純化等生物大分的分化等生物大分的分離純化。包括這些離純化。包括這些樣品的除鹽等。樣品的除鹽等。分離范圍分離范圍1 1x10 x104 4- -41x1041x106 6￥600600瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠FFFF500500mlml￥20002000 聚丙烯酰胺凝膠的商品名稱為聚丙烯酰胺凝膠的商品名稱為Bioge1Bioge1。 它是以甲撐雙丙烯胺胺它是以甲撐雙丙烯胺胺( (雙體雙體) )作交聯(lián)劑，以過硫作交聯(lián)劑，以過硫酸銨作催化劑，在酸銨作催化劑，在N N、N N、NN、NN四甲基乙二四甲基乙二胺胺( (TEMED)TEMED)加速劑的作用下，將丙烯酰胺加速劑的作用下，

25、將丙烯酰胺( (單體單體) )聚聚合而成的。當(dāng)改變單體濃度時，就可得到吸水串合而成的。當(dāng)改變單體濃度時，就可得到吸水串不同的產(chǎn)物。不同的產(chǎn)物。 商品聚丙烯酰胺凝膠型號有商品聚丙烯酰胺凝膠型號有Bioge1P2Bioge1P2到到PP300300，其阿拉伯?dāng)?shù)字相當(dāng)于排阻限度的其阿拉伯?dāng)?shù)字相當(dāng)于排阻限度的102102。 一般聚丙烯酰胺凝膠均制成珠狀顆粒，并以干凝膠一般聚丙烯酰胺凝膠均制成珠狀顆粒，并以干凝膠形式出售，使用前必須溶脹。形式出售，使用前必須溶脹。 該凝膠不溶于水和普通有機(jī)溶劑，能忍受濃鹽、尿該凝膠不溶于水和普通有機(jī)溶劑，能忍受濃鹽、尿素和服鹽等溶液的浸泡；素和服鹽等溶液的浸泡； 在在p

26、Hl10pHl10或短時間超過此或短時間超過此pHpH范圍的溶液中較穩(wěn)定；范圍的溶液中較穩(wěn)定；要避免長期與強(qiáng)酸和強(qiáng)堿接觸，如果與其接觸，并要避免長期與強(qiáng)酸和強(qiáng)堿接觸，如果與其接觸，并在高溫條件下，酰胺基將迅速發(fā)生分解。在高溫條件下，酰胺基將迅速發(fā)生分解。 聚丙烯酰胺凝膠對芳香族的、酸性和堿性的化合物聚丙烯酰胺凝膠對芳香族的、酸性和堿性的化合物稍有吸附現(xiàn)象，如使用離子強(qiáng)度略高的洗脫液操作，稍有吸附現(xiàn)象，如使用離子強(qiáng)度略高的洗脫液操作，此弊病可以克服此弊病可以克服。 SephacrylSephacryl是由烷基葡聚糖與甲撐雙丙烯酰胺共價交聯(lián)制是由烷基葡聚糖與甲撐雙丙烯酰胺共價交聯(lián)制成的。成的。 此

27、凝膠屬硬性凝膠，它具有一定大小的篩孔和少量的羧基此凝膠屬硬性凝膠，它具有一定大小的篩孔和少量的羧基基團(tuán)。基團(tuán)。SephacrylSephacryl吸水時，其珠狀顆粒直徑平均值為吸水時，其珠狀顆粒直徑平均值為7070mm，通常是用于水相系統(tǒng)中。若在有機(jī)相系統(tǒng)使用時，其孔徑通常是用于水相系統(tǒng)中。若在有機(jī)相系統(tǒng)使用時，其孔徑大小略有變化。大小略有變化。 它在所有的溶劑中不溶解，化學(xué)降解也很少；它可在它在所有的溶劑中不溶解，化學(xué)降解也很少；它可在pH211pH211范圍內(nèi)使用，當(dāng)范圍內(nèi)使用，當(dāng)pHpH低時，葡聚糖鏈將發(fā)生少許水低時，葡聚糖鏈將發(fā)生少許水解作用；在解作用；在0.2 0.2 mol/L N

28、aOHmol/L NaOH溶液中溶液中( (室溫下室溫下) )處理處理100100小時，小時，對其低流速和多孔性沒有明顯影響。用清潔劑對其低流速和多孔性沒有明顯影響。用清潔劑( (如如SDS)SDS)、6 6 molmolL L鹽酸胍和鹽酸胍和8 8尿素溶液作洗脫劑，高溫消毒尿素溶液作洗脫劑，高溫消毒(120 (120 , pH7)pH7)處理后，層析性質(zhì)沒有明顯變化。處理后，層析性質(zhì)沒有明顯變化。分子篩效應(yīng)：分子篩效應(yīng)：大分子先洗脫下來大分子先洗脫下來小分子后洗脫下來小分子后洗脫下來 凝膠層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、凝膠層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)

29、。篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。 這種物質(zhì)可以完全或部分排阻某些大分子化這種物質(zhì)可以完全或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而對某些小分子化合物則不能合物于篩孔之外，而對某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴(kuò)散、滲透。排阻，但可讓其在篩孔中自由擴(kuò)散、滲透。 任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數(shù)度可用分配系數(shù)KavKav（被分離化合物在內(nèi)水和外水被分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系）表示。體積中的比例關(guān)系）表示。 KavKav值的大小與凝膠床的總體積（值的大小與凝膠床的總體積（VtVt）、）、外水外水體積（體積（Vo

30、Vo）及分離物本身的洗脫體積（及分離物本身的洗脫體積（VeVe）有有關(guān)，即：關(guān)，即：Kav= (Ve-Vo) / (Vt-Vo) 在限定的層析條件下，在限定的層析條件下，VtVt和和VoVo都是恒定值，都是恒定值，而而VeVe值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，分離物分子量大，KavKav值小；反之，則值?。环粗?，則KavKav值增值增大。大。 在同一凝膠柱上分離在同一凝膠柱上分離MrMr不同的物質(zhì)時，由于流動相不同的物質(zhì)時，由于流動相的作用，這些分離物質(zhì)將發(fā)生排阻和擴(kuò)散效應(yīng)。若的作用，這些分離物質(zhì)將發(fā)生排阻和擴(kuò)散效應(yīng)。若緩沖液連續(xù)地傾入

31、柱中，柱中物質(zhì)的排阻和擴(kuò)散效緩沖液連續(xù)地傾入柱中，柱中物質(zhì)的排阻和擴(kuò)散效應(yīng)也將連續(xù)地發(fā)生，其最終結(jié)果是分子量大的物質(zhì)應(yīng)也將連續(xù)地發(fā)生，其最終結(jié)果是分子量大的物質(zhì)先從柱中流出，分子量小的物質(zhì)則后從柱中流出。先從柱中流出，分子量小的物質(zhì)則后從柱中流出。 流出物用部分收集器分管等量或等時地收流出物用部分收集器分管等量或等時地收集起來，檢測后分段合并相同組分的各管集起來，檢測后分段合并相同組分的各管流出物，即等于把分子量不同的物質(zhì)相互流出物，即等于把分子量不同的物質(zhì)相互分離開了。分離開了。 其分離效果受操作條件（如基質(zhì)的顆粒大小、均勻度、其分離效果受操作條件（如基質(zhì)的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積

32、的大小、洗脫液的流速以及樣品的篩孔直徑和床體積的大小、洗脫液的流速以及樣品的種類等）的影響，而最直接的影響是種類等）的影響，而最直接的影響是KavKav值的差異性，值的差異性，KavKav值差異性大，分離效果好；值差異性大，分離效果好；KavKav值差異性小，則分值差異性小，則分離效果很差，或根本不能分開。離效果很差，或根本不能分開。分配系數(shù)分配系數(shù)KavKav既是判斷分離效果的一個參數(shù)，又是測定既是判斷分離效果的一個參數(shù)，又是測定蛋白質(zhì)分子量的一個依據(jù)。蛋白質(zhì)分子量的一個依據(jù)。 從公式從公式Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要測出床體積可

33、知，只要測出床體積Vt Vt 和外水體積和外水體積Vo Vo 以及洗脫體積以及洗脫體積VeVe，即可計算出即可計算出KavKav值。值。凝膠床總體積凝膠床總體積VtVt可用二種方法得到可用二種方法得到：計算法計算法：根據(jù)層析柱體積計算總體積，可用下列公式表示根據(jù)層析柱體積計算總體積，可用下列公式表示Vt= Vt= r r2 2h h 式中式中r r為層析柱半徑；為層析柱半徑；h h為凝膠床高度；為凝膠床高度； 為圓周率。在用此為圓周率。在用此公式計算凝膠床總體積時，須精確地分段測量，以防內(nèi)徑不勻公式計算凝膠床總體積時，須精確地分段測量，以防內(nèi)徑不勻造成誤差。另外還須注意到，在層析過程中，尤其是

34、軟膠的操造成誤差。另外還須注意到，在層析過程中，尤其是軟膠的操作壓力要小，以防凝膠床的高度降低。作壓力要小，以防凝膠床的高度降低。 測量法測量法：由凝膠床的組成可知，床體積由凝膠床的組成可知，床體積VtVt等于外水體積等于外水體積VoVo、 內(nèi)水體積內(nèi)水體積ViVi與凝膠顆粒實際占有體積與凝膠顆粒實際占有體積VgVg之和。即之和。即Vt= VVt= V0 0+Vi+Vg+Vi+Vg因因VgVg與與VtVt相比很小，可忽略不計，故相比很小，可忽略不計，故Vt= VVt= V0 0+Vi+ViVoVo和和ViVi可通過實驗測得可通過實驗測得： 當(dāng)把分子量不同的混合溶液鋪在凝膠床上時，其在當(dāng)把分子量

35、不同的混合溶液鋪在凝膠床上時，其在內(nèi)水體積和外水體積中的分布是不一樣的。溶液中的分內(nèi)水體積和外水體積中的分布是不一樣的。溶液中的分子大于凝膠孔徑上限者不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，而被排阻子大于凝膠孔徑上限者不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，而被排阻在外水體積的溶液中。凝膠床的洗脫體積在外水體積的溶液中。凝膠床的洗脫體積VeVe剛好等于外剛好等于外水體積。即水體積。即Ve=Vo (Kav=0)Ve=Vo (Kav=0)。 然而，溶液中的分子小于凝膠孔徑下限者能自由進(jìn)然而，溶液中的分子小于凝膠孔徑下限者能自由進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，凝膠床的洗脫體積入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，凝膠床的洗脫體積VeVe應(yīng)等于凝膠床總體應(yīng)等于凝膠床總體積，即積，

36、即Ve= Vt= Vo+Vi (Kav=1)Ve= Vt= Vo+Vi (Kav=1)。 而溶液中的分子大小介于凝膠孔徑上限和下限之間而溶液中的分子大小介于凝膠孔徑上限和下限之間者，則能進(jìn)入部分凝膠網(wǎng)孔中，故其洗脫體積者，則能進(jìn)入部分凝膠網(wǎng)孔中，故其洗脫體積VeVe是在是在VoVo和和VtVt之間（之間（KavKav在在0-10-1之間）。之間）。 測定外水體積的物質(zhì)測定外水體積的物質(zhì)通常選用藍(lán)色葡聚糖通常選用藍(lán)色葡聚糖20002000。該物質(zhì)分子量大（為。該物質(zhì)分子量大（為200200萬），呈藍(lán)色，它萬），呈藍(lán)色，它在各種型號的葡聚糖凝膠中都被完全排阻，并可借在各種型號的葡聚糖凝膠中都被完全

37、排阻，并可借助 其 本 身 顏 色 ， 采 用 肉 眼 或 分 光 光 度 儀 檢 測助 其 本 身 顏 色 ， 采 用 肉 眼 或 分 光 光 度 儀 檢 測（210210nmnm或或260260nmnm或或620620nmnm）洗脫體積（即洗脫體積（即VoVo）。）。但但是，在測定激酶等蛋白質(zhì)的分子量時，不宜用藍(lán)色是，在測定激酶等蛋白質(zhì)的分子量時，不宜用藍(lán)色葡聚糖葡聚糖20002000測定外水體積，因為它對激酶有吸附作測定外水體積，因為它對激酶有吸附作用，所以有時用巨球蛋白代替。用，所以有時用巨球蛋白代替。 測定內(nèi)水體積（測定內(nèi)水體積（ViVi）的物質(zhì)的物質(zhì)可選用硫酸銨、可選用硫酸銨、N-

38、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它與凝膠無吸附力的小乙酰酪氨酸乙酯，或者其它與凝膠無吸附力的小分子物質(zhì)。分子物質(zhì)。1. 1. 葡聚糖凝膠的預(yù)處理葡聚糖凝膠的預(yù)處理 取取3 3克葡聚糖凝膠（克葡聚糖凝膠（Sephadex-25Sephadex-25）干粉，浸泡于干粉，浸泡于5050mlml蒸餾水中充分溶脹（室溫，蒸餾水中充分溶脹（室溫，1212h h），），然后反復(fù)傾斜然后反復(fù)傾斜除去表面的懸浮微粒，再加入除去表面的懸浮微粒，再加入pH7.0pH7.0磷酸緩沖液沸水浴磷酸緩沖液沸水浴中中2-32-3h h去除顆粒內(nèi)部空氣，最后加入去除顆粒內(nèi)部空氣，最后加入pH7.0pH7.0磷酸緩沖液磷酸緩沖液浸泡過

39、夜備用。浸泡過夜備用。2.2.裝柱裝柱 (1) (1)將層析柱垂直固定在鐵架臺上將層析柱垂直固定在鐵架臺上, ,不要顛倒；不要顛倒； (2) (2)將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約1-1-2 2cmcm高的緩沖液，高的緩沖液， 把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊倒入柱把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊倒入柱中，最好一次連續(xù)裝完，若分次裝入，需用玻璃棒輕輕中，最好一次連續(xù)裝完，若分次裝入，需用玻璃棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面。最后放入略小于層攪動柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面。最后放入略小于層析柱內(nèi)徑的圓形濾紙片，以防將來加樣時凝膠被沖起。析柱內(nèi)徑的圓形濾紙片，以防將來加樣時凝膠被沖起。 3.3.平衡平衡 以恒流泵控制流速為以恒流泵控制流速為1 1滴滴/5/5秒，用磷酸緩沖液洗脫平衡秒，用磷酸緩沖液洗脫平衡10 10 minmin。