HPLC(儀器圖)

1、2022-3-16 高效液相色譜法高效液相色譜法( (HPLC) )high performance liquid chromatograph2022-3-16 高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLCHPLC）是）是2020世紀(jì)世紀(jì)6060年代末年代末7070年代年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，它是在經(jīng)典液初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了用了高壓驅(qū)動流動相高壓驅(qū)動流動相 、高效固定相和高靈敏度、高效固定相和高靈敏度檢測檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動器，因而具

2、備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點?；奶攸c。概述概述2022-3-16發(fā)展：發(fā)展： 1960 1960年代，由于氣相色譜對高年代，由于氣相色譜對高沸點沸點有機物分析的局限性，有機物分析的局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。2020世紀(jì)世紀(jì)6060年代末科克蘭（年代末科克蘭（KirklandKirkland）、荷瓦斯）、荷瓦斯(Horvath)(Horvath)、莆黑斯、莆黑斯、哈伯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜哈伯、里普斯

3、克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。儀，開啟了高效液相色譜的時代。 2022-3-16高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動流動相，使得經(jīng)提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動流動相，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內(nèi)完成。在幾個小時甚至幾十分鐘內(nèi)完成。 19711971年科克蘭等人出版了年科克蘭等人出版了液相色譜的現(xiàn)代實踐液相色譜的現(xiàn)代實踐一書，標(biāo)志著高效液相色譜法一書，標(biāo)志著高效液相色譜法 (HPLC)(H

4、PLC)正式建立。正式建立。 2022-3-16 19701970年后，適合分離生物大分子的填料年后，適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點。又成為研究的熱點。19801980年后，改善分年后，改善分離的選擇性成為離的選擇性成為色譜色譜工作者的主要問題，工作者的主要問題，人們越來越認(rèn)識到改變流動相的組成提人們越來越認(rèn)識到改變流動相的組成提高選擇性的關(guān)鍵。高選擇性的關(guān)鍵。 2022-3-16主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測手段主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測手段1經(jīng)典經(jīng)典LCLC：僅做為一種分離手段僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑1-3cm1-3cm，固定相粒徑固定相粒徑100m 10

5、0m 且不均勻且不均勻 常壓輸送流動相常壓輸送流動相 柱效低（柱效低（HH，nn） 分析周期長分析周期長 無法在線檢測無法在線檢測2 2HPLCHPLC：分離和分析分離和分析 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑2-6mm2-6mm，固定相粒徑固定相粒徑10m10m（球形，勻漿裝柱）球形，勻漿裝柱） 高壓輸送流動相高壓輸送流動相 柱效高（柱效高（HH，nn） 分析時間大大縮短分析時間大大縮短 可以在線檢測可以在線檢測2022-3-162022-3-161 1分析對象分析對象 GCGC： 能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品， 高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高沸點、揮發(fā)性差

6、、熱穩(wěn)定性差、離子型及 高聚物的樣品不可檢測高聚物的樣品不可檢測 占有機物的占有機物的20%20% HPLC HPLC： 溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制穩(wěn)定性的限制 , ,分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測及高分子和離子型樣品均可檢測, ,用途廣泛，占有用途廣泛，占有機物的機物的80%80%2022-3-16相同：兼具分離和分析功能，均可以在相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測線檢測 主要差別：分析對象的差別和流動相的主要差別：分析對象的差別和流動相的差別差別2022-3-1

7、62 2流動相差別流動相差別vGCGC：流動相為惰性氣體流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用 vHPLCHPLC：流動相為液體流動相為液體流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、 改善分離度增加了因素，對分離起很大作用改善分離度增加了因素，對分離起很大作用流動相種類較多，選擇余地廣流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和流動相極性和pHpH值的選擇也對分離起到重要作用值的選擇也對分離起到重要作用 3 3操作條件差別操作條件差別 GCGC： 加溫操作加溫操作 HPLCHPLC：室溫；高壓

8、（液體粘度大，峰展寬?。┦覝?；高壓（液體粘度大，峰展寬?。?022-3-16 高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意圖：一般可分為五個主高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意圖：一般可分為五個主要部分：要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng), ,檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理及控制系統(tǒng)檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理及控制系統(tǒng)。此外還配有。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。第三節(jié)第三節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀2022-3-16第三節(jié)第三節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀2022-3-162022-3-162022-3-16 Agilent 120

9、0液相色譜系統(tǒng)液相色譜系統(tǒng) 2022-3-162022-3-16 高效液相色譜儀的儀器流程高效液相色譜儀的儀器流程(process and main assembly of HPLC)高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數(shù)高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集和控制系統(tǒng)據(jù)采集和控制系統(tǒng)2022-3-162022-3-161.1.高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液泵高壓輸液泵: :主要部件之一，壓力：主要部件之一，壓力：151535 35 MPaMPa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（1010mm），），液液體的流動相高速通過時，將

10、產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。速是高效液相色譜的特點之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性（動畫）（動畫）(二二).主要部件主要部件2022-3-16 流動相的預(yù)處理：流動相的預(yù)處理： 在使用前必須進行脫氣處理，以防止在洗脫過程在使用前必須進行脫氣處理，以防止在洗脫過程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡而產(chǎn)生氣泡 抽真空脫氣抽真空脫氣 吹氦脫氣吹氦脫氣 加熱回流脫氣加熱回流脫氣 超聲波脫氣超

11、聲波脫氣2022-3-16 等強度洗脫（等強度洗脫（isocratic):isocratic):樣品的組成較簡單，樣品的組成較簡單，各組分的分配系數(shù)值相差不大。在同一分析周各組分的分配系數(shù)值相差不大。在同一分析周期內(nèi)流動相的組成保持恒定。期內(nèi)流動相的組成保持恒定。 梯度洗脫（梯度洗脫（gradient)gradient)：樣品的組成較復(fù)雜，各：樣品的組成較復(fù)雜，各組分的分配系數(shù)值相差大，即寬分配比的組分組分的分配系數(shù)值相差大，即寬分配比的組分流動相的洗脫方式流動相的洗脫方式2022-3-16梯度洗脫的特點梯度洗脫的特點梯度洗脫的主要條件梯度洗脫的主要條件梯度洗脫的基本原理梯度洗脫的基本原理梯度

12、洗脫（溶劑程序）：在同一個分析周期內(nèi)按梯度洗脫（溶劑程序）：在同一個分析周期內(nèi)按一定的程序改變流動相的組成一定的程序改變流動相的組成, ,從而改變流動相從而改變流動相極性、離子強度、極性、離子強度、pHpH，來調(diào)整組分的，來調(diào)整組分的k k值，改變值，改變分離因子分離因子值，以達到最短時間內(nèi)得到最佳分離值，以達到最短時間內(nèi)得到最佳分離的目的。的目的。梯度洗脫（梯度洗脫（gradient)2022-3-161 1 1 1 1 1梯度洗脫的特點梯度洗脫的特點梯度洗脫的特點梯度洗脫的特點梯度洗脫的特點梯度洗脫的特點（1 1）提高分離度，加快分析速度；）提高分離度，加快分析速度；（2 2）改善峰形）改

13、善峰形, , 減少拖尾減少拖尾, ,（3 3）提高檢測的靈敏度，）提高檢測的靈敏度， 有利于痕有利于痕量組分的檢測；量組分的檢測；（4 4）增加峰容量；）增加峰容量；（5 5）強烈滯留的組分不容易殘留在柱）強烈滯留的組分不容易殘留在柱上上, , 保持柱性能長期良好；保持柱性能長期良好；梯度洗脫的作用梯度洗脫的作用2022-3-16(2)(2)(2)梯度淋洗裝置梯度淋洗裝置梯度淋洗裝置梯度淋洗裝置梯度淋洗裝置梯度淋洗裝置外梯度外梯度: : 利用兩臺高壓利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合送入梯度混合室，混合后進入色譜柱后

14、進入色譜柱。內(nèi)梯度內(nèi)梯度: :一臺高壓泵一臺高壓泵, , 通通過比例調(diào)節(jié)閥過比例調(diào)節(jié)閥, ,將兩種或?qū)煞N或多種不同極性的溶劑按多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵一定的比例抽入高壓泵中混合。中混合。2022-3-162 2 2梯度洗脫的主要條件梯度洗脫的主要條件梯度洗脫的主要條件梯度洗脫的主要條件梯度洗脫的主要條件梯度洗脫的主要條件 A A 流動相流動相/ /弱溶劑組成；弱溶劑組成； B B 流動相流動相/ /強溶劑組成；強溶劑組成； 梯度時間；梯度時間； 梯度曲線：線性、凸型或凹型等。梯度曲線：線性、凸型或凹型等。強溶劑 A%time1252022-3-16 流路中為高壓力工作狀態(tài)，通

15、常使用耐高壓的六通流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：2.2.進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)2022-3-162022-3-16六通閥定量環(huán)六通閥定量環(huán)LoadLoadLoadInjectInjectInjectInjectInjectInject通廢液口通廢液口進柱進柱定量環(huán)定量環(huán)手動進樣器、六通閥、定量環(huán)手動進樣器、六通閥、定量環(huán)2022-3-16儀器：自儀器：自儀器：自動進樣器動進樣器動進樣器機械手樣品盤自動進樣器自動進樣器自動進樣自動進樣100樣品盤、機器手、自動洗樣品盤、機器手、自動洗針針2022-3-16高效分離柱高效分離柱:柱體為

16、直型不銹鋼管，內(nèi)徑柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長柱長540 cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)2022-3-16柱溫箱外掛架色譜柱、柱溫箱、色譜柱外掛架色譜柱、柱溫箱、色譜柱外掛架2022-3-164.4.4.4.4.4. 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) a. a. 紫外檢測器紫外檢測器 應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。 特點：特點： 靈敏度高；靈敏度高； 線形范圍高；線形范圍高； 流通池可做的很小（流通池可做的很?。? 1mm

17、 mm 10mm 10mm ，容積容積 8 8LL）；）； 對流動相的流速和溫度變化不敏感；對流動相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作；波長可選，易于操作； 可用于梯度洗脫?？捎糜谔荻认疵摗?2022-3-16b. b. b. b. b. b. 光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器：光電二極管陣列檢測器：10241024個二極管陣列，各檢個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。圖所示。2022-3-16 光電

18、轉(zhuǎn)換元件是光電轉(zhuǎn)換元件是: :光電二極管光電二極管, ,即晶體硅即晶體硅( (體積體積僅僅50ul),50ul),如如Agilent 1100Agilent 1100型光電二極管陣列檢型光電二極管陣列檢測器測器, ,波長范圍為波長范圍為190-950nm190-950nm對應(yīng)對應(yīng)10241024個光電二個光電二極管極管, ,平均平均0.74nm0.74nm譜帶區(qū)間譜帶區(qū)間, ,由一個光電二極管由一個光電二極管接收接收. .光電二極管陣列檢測器構(gòu)造光電二極管陣列檢測器構(gòu)造2022-3-162022-3-16當(dāng)復(fù)合光透過流通池后當(dāng)復(fù)合光透過流通池后, ,被組分吸收被組分吸收, ,其透過光具有其透過

19、光具有了組分的光譜吸收特征了組分的光譜吸收特征. .此透過光被光柵分光后此透過光被光柵分光后, ,形形成組分的吸收光譜成組分的吸收光譜, ,照到光電二極管陣列裝置上照到光電二極管陣列裝置上, ,使使每個納米光波的光強轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電信號每個納米光波的光強轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電信號, ,給出組分給出組分的吸收光譜的吸收光譜. .本檢測器可以同時獲得樣品的色譜圖本檢測器可以同時獲得樣品的色譜圖(C-t)(C-t)及每個色及每個色譜峰的吸收光譜譜峰的吸收光譜(A-(A-入入),),得到三維光譜得到三維光譜- -色譜圖色譜圖, ,可以可以同時得到定性和定量及色譜峰是否單一組分的信息同時得到定性和定量及色譜峰是否

20、單一組分的信息. .2022-3-162022-3-16c. c. c. 示差折光檢測器示差折光檢測器示差折光檢測器示差折光檢測器示差折光檢測器示差折光檢測器（differential refractive index detectordifferential refractive index detectordifferential refractive index detector）除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值?？蛇B續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；差值與濃度呈正比；

21、通用型檢測器（每種物質(zhì)通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；具有不同的折光指數(shù)）； 靈敏度低、對溫度敏感靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；三種；2022-3-16示差折光檢測器示差折光檢測器示差折光檢測器示差折光檢測器示差折光檢測器示差折光檢測器2022-3-16 高靈敏度、高選擇性；高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素對多環(huán)芳烴，維生素B B、黃曲黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；物等有響應(yīng)；熒光檢測器熒光檢測器 （fluoresc

22、ence detector）2022-3-16 此類檢測器是上世紀(jì)此類檢測器是上世紀(jì)9090年代出現(xiàn)的最新型的泛年代出現(xiàn)的最新型的泛用檢測器用檢測器. .可用于揮發(fā)性低于流動相的任何樣可用于揮發(fā)性低于流動相的任何樣品組分的檢測品組分的檢測. .但靈敏度低于紫外光度型但靈敏度低于紫外光度型. .因而因而主要用于糖類主要用于糖類, ,高分子化合物高分子化合物, ,高級脂肪酸及甾高級脂肪酸及甾體類等幾十類化合物體類等幾十類化合物. . 構(gòu)造構(gòu)造 檢測機理檢測機理蒸發(fā)光散射檢測器（蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）evaporative light scattering detector2022-3-16步

23、驟一步驟一 ：霧化：霧化 柱洗脫液進入霧化器針管，在針的末端，洗脫液和氮氣混合形成均勻柱洗脫液進入霧化器針管，在針的末端，洗脫液和氮氣混合形成均勻的微小霧狀液滴的微小霧狀液滴 步驟二：流動相的蒸發(fā)步驟二：流動相的蒸發(fā) 液滴流經(jīng)加熱的漂移管時，流動相蒸發(fā)，樣品在溶劑蒸氣中液滴流經(jīng)加熱的漂移管時，流動相蒸發(fā)，樣品在溶劑蒸氣中形成霧狀微小顆粒，懸浮在溶劑蒸氣中形成霧狀微小顆粒，懸浮在溶劑蒸氣中步驟三：檢測步驟三：檢測 樣品小顆粒進入流動池時，經(jīng)過一束激光樣品小顆粒進入流動池時，經(jīng)過一束激光, ,顆粒散射激光顆粒散射激光, ,經(jīng)硅晶體光電經(jīng)硅晶體光電二極管檢測散射光，并產(chǎn)生電信號二極管檢測散射光，并產(chǎn)

24、生電信號。2022-3-16構(gòu)造構(gòu)造構(gòu)造lglglgbIkmIbmk構(gòu)造構(gòu)造2022-3-16檢測機理檢測機理檢測機理 1.1.霧化過程霧化過程: :形成細小均形成細小均勻的霧狀液滴勻的霧狀液滴 2.2.流動相蒸發(fā)過程流動相蒸發(fā)過程: :流動流動相蒸發(fā)相蒸發(fā), ,樣品分子形成霧樣品分子形成霧狀顆粒狀顆粒. . 3.3.檢測過程檢測過程:670nm:670nm激光激光束的照射束的照射, ,產(chǎn)生散射光產(chǎn)生散射光, ,其被硅晶體光電二極管其被硅晶體光電二極管產(chǎn)生電信號產(chǎn)生電信號工作原理工作原理lglglgbIkmIbmk2022-3-16五五五 色譜工作站色譜工作站計算機：控制顯示計算機：控制顯示五五.數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)和控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)和控制系統(tǒng)2022-3-16流 動 相流 動 相供 給 和