卵母細(xì)胞的冷凍技術(shù)

1、一、冷凍技術(shù)概述 隨著生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和低溫制冷技術(shù)的發(fā)展，低溫冷凍隨著生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和低溫制冷技術(shù)的發(fā)展，低溫冷凍技術(shù)已逐漸形成的一門邊緣學(xué)科低溫生物學(xué)，該領(lǐng)域主技術(shù)已逐漸形成的一門邊緣學(xué)科低溫生物學(xué)，該領(lǐng)域主要應(yīng)用是在保存各種細(xì)胞、組織、胚胎、器官甚至是活要應(yīng)用是在保存各種細(xì)胞、組織、胚胎、器官甚至是活體的冷凍保存。體的冷凍保存。 在超低溫條件下動(dòng)物種質(zhì)細(xì)胞之所以能長期保存，是在超低溫條件下動(dòng)物種質(zhì)細(xì)胞之所以能長期保存，是因?yàn)榉N質(zhì)細(xì)胞內(nèi)一切新陳代謝過程中的化學(xué)變化被超低因?yàn)榉N質(zhì)細(xì)胞內(nèi)一切新陳代謝過程中的化學(xué)變化被超低溫所抑制，當(dāng)溫度降到一定限度時(shí)，細(xì)胞內(nèi)所有的化學(xué)溫所抑制，當(dāng)溫度降到一定限度時(shí)，

2、細(xì)胞內(nèi)所有的化學(xué)變化也就處于一種變化也就處于一種“暫停暫?！睜顟B(tài)而使細(xì)胞得以長期保存；狀態(tài)而使細(xì)胞得以長期保存；低溫保存的細(xì)胞以一定的方式復(fù)蘇后，又具有存活的能低溫保存的細(xì)胞以一定的方式復(fù)蘇后，又具有存活的能力。力。一、冷凍技術(shù)概述1.影響動(dòng)物種質(zhì)細(xì)胞冷凍保存的兩個(gè)關(guān)鍵因素：影響動(dòng)物種質(zhì)細(xì)胞冷凍保存的兩個(gè)關(guān)鍵因素： 冷凍模式冷凍模式 防凍劑防凍劑 1.1常用的冷凍模式包括程序降溫法和玻璃化法常用的冷凍模式包括程序降溫法和玻璃化法 程序降溫法程序降溫法 利用程序降溫儀，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的利用程序降溫儀，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的降溫程序?qū)⒓?xì)胞降低至植冰溫度，再迅速降溫至零下降溫程序?qū)⒓?xì)胞降低至植冰溫度，再迅速降

3、溫至零下35度，然后保存在液氮中的過程。度，然后保存在液氮中的過程。 一、冷凍技術(shù)概述 玻璃化法玻璃化法 指將經(jīng)過不同防凍劑濃度平衡后的細(xì)胞指將經(jīng)過不同防凍劑濃度平衡后的細(xì)胞直接投入到液氮中保存。高濃度防凍劑在快速降溫過程中直接投入到液氮中保存。高濃度防凍劑在快速降溫過程中由液態(tài)轉(zhuǎn)化為一種類似于玻璃狀的形態(tài)，而不形成冰晶，由液態(tài)轉(zhuǎn)化為一種類似于玻璃狀的形態(tài)，而不形成冰晶，不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶形成所致的化學(xué)、物理損傷，使得冷不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶形成所致的化學(xué)、物理損傷，使得冷凍技術(shù)更加簡潔，迅速，廉價(jià)。凍技術(shù)更加簡潔，迅速，廉價(jià)。 一、冷凍技術(shù)概述 1.2冷凍保護(hù)劑分為滲透性和非滲透性兩種冷凍保護(hù)劑

4、分為滲透性和非滲透性兩種 滲透性冷凍保護(hù)劑主要有丙二醇（滲透性冷凍保護(hù)劑主要有丙二醇（PROH）、二甲）、二甲基亞砜（基亞砜（DMSO)、甘油和乙二醇、甘油和乙二醇(EG)等。等。 滲透性冷凍保護(hù)劑主要通過細(xì)胞膜，降低溶液的冰滲透性冷凍保護(hù)劑主要通過細(xì)胞膜，降低溶液的冰 點(diǎn)，增加溶液的粘性，稀釋溶液中的溶質(zhì)濃度。點(diǎn)，增加溶液的粘性，稀釋溶液中的溶質(zhì)濃度。一、冷凍技術(shù)概述 非滲透性冷凍保護(hù)劑主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。非滲透性冷凍保護(hù)劑主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。非滲透性冷凍保護(hù)劑不能透過細(xì)胞膜，但可以增加細(xì)胞外溶非滲透性冷凍保護(hù)劑不能透過細(xì)胞膜，但可以增加細(xì)胞外溶質(zhì)濃度，在細(xì)胞膜內(nèi)外形成滲

5、透梯度，吸引細(xì)胞內(nèi)水分外流，質(zhì)濃度，在細(xì)胞膜內(nèi)外形成滲透梯度，吸引細(xì)胞內(nèi)水分外流，使細(xì)胞脫水。使細(xì)胞脫水。 各種冷凍保護(hù)劑都各有千秋，需要按一定比例混合使用，各種冷凍保護(hù)劑都各有千秋，需要按一定比例混合使用，以加強(qiáng)效果。冷凍保護(hù)劑的濃度很重要，它決定了細(xì)胞脫水以加強(qiáng)效果。冷凍保護(hù)劑的濃度很重要，它決定了細(xì)胞脫水的速率。的速率。一、冷凍技術(shù)概述2.細(xì)胞損傷假說細(xì)胞損傷假說 冷凍損傷是卵母細(xì)胞冷凍保存的主要障礙，有報(bào)冷凍損傷是卵母細(xì)胞冷凍保存的主要障礙，有報(bào)道認(rèn)為冷凍常會(huì)使細(xì)胞膜，透明帶發(fā)生變化，細(xì)胞骨道認(rèn)為冷凍常會(huì)使細(xì)胞膜，透明帶發(fā)生變化，細(xì)胞骨架被破壞，染色體出現(xiàn)異常等。架被破壞，染色體出現(xiàn)異

6、常等。 現(xiàn)在關(guān)于冷凍損傷有兩個(gè)假說：現(xiàn)在關(guān)于冷凍損傷有兩個(gè)假說： 胞內(nèi)冰的形成，這是過快冷卻所產(chǎn)生的，冰晶胞內(nèi)冰的形成，這是過快冷卻所產(chǎn)生的，冰晶會(huì)刺破細(xì)胞器，破壞細(xì)胞膜，造成冷凍損傷，因而冷會(huì)刺破細(xì)胞器，破壞細(xì)胞膜，造成冷凍損傷，因而冷卻速率越快，此損傷越大；卻速率越快，此損傷越大；一、冷凍技術(shù)概述 “溶質(zhì)損傷溶質(zhì)損傷”，也叫，也叫“溶液損傷溶液損傷”，這，這是由過慢冷卻所產(chǎn)生的，它使細(xì)胞在高濃度的是由過慢冷卻所產(chǎn)生的，它使細(xì)胞在高濃度的溶液中存在的時(shí)間過長而發(fā)生細(xì)胞失水，造成溶液中存在的時(shí)間過長而發(fā)生細(xì)胞失水，造成了不可逆的的損傷，因而冷卻速率越慢，此損了不可逆的的損傷，因而冷卻速率越慢，

7、此損傷越大。傷越大。 二、卵母細(xì)胞的冷凍保存研究1.影響卵母細(xì)胞冷凍的因素影響卵母細(xì)胞冷凍的因素 1.1冷凍保護(hù)劑的影響冷凍保護(hù)劑的影響 有研究認(rèn)為有研究認(rèn)為PROH比甘油和比甘油和DMSO相比，解凍后形相比，解凍后形態(tài)正常率和受精率效果更好態(tài)正常率和受精率效果更好, ,PROH使細(xì)胞質(zhì)變?yōu)闊o定使細(xì)胞質(zhì)變?yōu)闊o定型狀態(tài)，提高了膜的滲透性。甘油廣泛用于牛胚胎的型狀態(tài)，提高了膜的滲透性。甘油廣泛用于牛胚胎的冷凍，因?yàn)樗拘缘?；還有相關(guān)報(bào)道認(rèn)為冷凍，因?yàn)樗拘缘停贿€有相關(guān)報(bào)道認(rèn)為DMSO對(duì)細(xì)對(duì)細(xì)胞骨架系統(tǒng)和糖酵解途徑有特殊的毒性。胞骨架系統(tǒng)和糖酵解途徑有特殊的毒性。二、卵母細(xì)胞的冷凍保存研究1.2冷凍

8、保存方法冷凍保存方法 由于慢速冷凍冷凍與超快速冷凍方法都需要昂貴的由于慢速冷凍冷凍與超快速冷凍方法都需要昂貴的程序化冷凍儀，推廣應(yīng)用并不廣泛。現(xiàn)在常用快速冷程序化冷凍儀，推廣應(yīng)用并不廣泛。現(xiàn)在常用快速冷凍方法即玻璃化法冷凍。朱士恩等應(yīng)用凍方法即玻璃化法冷凍。朱士恩等應(yīng)用OPS法玻璃化法玻璃化冷凍牛的卵母細(xì)胞，得到了很高的囊胚率，成功提高冷凍牛的卵母細(xì)胞，得到了很高的囊胚率，成功提高了冷凍效率。了冷凍效率。 Open pulled straw（OPS）：）： 用酒精燈將用酒精燈將025mi塑料塑料細(xì)管加熱拉成細(xì)管加熱拉成OPS管。保證管。保證OPS管壁內(nèi)徑管壁內(nèi)徑0810mm，管，管壁厚度約壁厚

9、度約008mm即可。冷卻后用刀片將其切開，細(xì)端長度即可。冷卻后用刀片將其切開，細(xì)端長度保持在保持在2cm左右。左右。二、卵母細(xì)胞的冷凍保存研究1.3卵母細(xì)胞成熟階段卵母細(xì)胞成熟階段 不成熟的卵母細(xì)胞在冷凍，解凍后受精率和卵裂不成熟的卵母細(xì)胞在冷凍，解凍后受精率和卵裂率都較低。未成熟卵母細(xì)胞的成熟率和受精率要比成率都較低。未成熟卵母細(xì)胞的成熟率和受精率要比成熟的卵母細(xì)胞的成熟率和受精率低很多，冷凍損傷對(duì)熟的卵母細(xì)胞的成熟率和受精率低很多，冷凍損傷對(duì)成熟的卵母細(xì)胞的影響更小。成熟卵母細(xì)胞比未成熟成熟的卵母細(xì)胞的影響更小。成熟卵母細(xì)胞比未成熟卵母細(xì)胞對(duì)冷凍的耐受性高。卵母細(xì)胞對(duì)冷凍的耐受性高。二、卵

10、母細(xì)胞的冷凍保存研究1.4 卵丘細(xì)胞的影響卵丘細(xì)胞的影響 研究發(fā)現(xiàn)包裹卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞層數(shù)越多，解凍研究發(fā)現(xiàn)包裹卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞層數(shù)越多，解凍后卵母細(xì)胞存活率越高。后卵母細(xì)胞存活率越高。Jack等比較冷凍等比較冷凍GV期卵母細(xì)期卵母細(xì)胞前后變化，發(fā)現(xiàn)致密的胞前后變化，發(fā)現(xiàn)致密的COC與裸卵相比具有較高的成與裸卵相比具有較高的成熟率?？赡苁锹亚鸺?xì)胞參與了卵母細(xì)胞的成熟，如果去熟率。可能是卵丘細(xì)胞參與了卵母細(xì)胞的成熟，如果去除卵丘細(xì)胞，成熟率則會(huì)大幅度降低。除卵丘細(xì)胞，成熟率則會(huì)大幅度降低。 三、實(shí)驗(yàn)冷凍方法與保護(hù)劑對(duì)牛卵母細(xì)胞解凍后細(xì)胞冷凍方法與保護(hù)劑對(duì)牛卵母細(xì)胞解凍后細(xì)胞發(fā)育的影響發(fā)育的影

11、響 1. 1.卵母細(xì)胞的采集與成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞的采集與成熟培養(yǎng) 用帶有用帶有1212號(hào)針頭的號(hào)針頭的5ml5ml注射器抽取卵巢表面直徑為注射器抽取卵巢表面直徑為28mm28mm間卵泡中的卵母細(xì)胞和卵泡液。然后用間卵泡中的卵母細(xì)胞和卵泡液。然后用PBS+5PBS+5FBSFBS稀釋后，在體式鏡下檢出卵母細(xì)胞。稀釋后，在體式鏡下檢出卵母細(xì)胞。挑選胞質(zhì)均勻或暗凝，卵丘細(xì)胞層部分脫落以及致密挑選胞質(zhì)均勻或暗凝，卵丘細(xì)胞層部分脫落以及致密的卵丘的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體進(jìn)行成熟培養(yǎng)。卵母細(xì)胞復(fù)合體進(jìn)行成熟培養(yǎng)。三、實(shí)驗(yàn)2.2.卵母細(xì)胞的冷凍：卵母細(xì)胞的冷凍： 麥管冷凍：常規(guī)玻璃化麥管冷凍：常規(guī)玻璃化(O(O2

12、5mL25mL細(xì)管細(xì)管) )冷凍，將冷凍，將室溫調(diào)至室溫調(diào)至2020280280，在恒溫臺(tái)上使試驗(yàn)用具及試劑得，在恒溫臺(tái)上使試驗(yàn)用具及試劑得到充分平衡。試驗(yàn)操作在到充分平衡。試驗(yàn)操作在3838恒溫臺(tái)上進(jìn)行，首先將恒溫臺(tái)上進(jìn)行，首先將培養(yǎng)培養(yǎng)2828小時(shí)的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到小時(shí)的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到383855的預(yù)處理液，的預(yù)處理液，預(yù)平衡液中平衡預(yù)平衡液中平衡25253030秒：然后再轉(zhuǎn)移到秒：然后再轉(zhuǎn)移到1010EG+10EG+10DMSODMSO組成的組成的EDFS30EDFS30、EDFS40EDFS40玻璃化溶液，平衡玻璃化溶液，平衡25253030秒。最后將卵母細(xì)胞保存在麥管中并在液氮中保存秒

13、。最后將卵母細(xì)胞保存在麥管中并在液氮中保存l l周。周。三、實(shí)驗(yàn) OPS OPS冷凍：將部分培養(yǎng)冷凍：將部分培養(yǎng)28h28h的卵母細(xì)胞用帶有的卵母細(xì)胞用帶有l(wèi)mllml塑料塑料注射針筒的口吸管連接的注射針筒的口吸管連接的OPSOPS管移入保護(hù)劑管移入保護(hù)劑1(EFS201(EFS20溶溶液中平衡液中平衡252530s30s，然后移入，然后移入EFS40EFS40，EFSS0EFSS0中平衡中平衡252530s)30s)；再將部分培養(yǎng)；再將部分培養(yǎng)28h28h的卵母細(xì)胞用帶有的卵母細(xì)胞用帶有l(wèi)mllml塑塑料注射針筒的口吸管連接的料注射針筒的口吸管連接的OPSOPS管移入保護(hù)劑管移入保護(hù)劑2(1

14、02(10EG+10EG+10D D溶液中平衡溶液中平衡252530s30s，然后移入，然后移入EDFS30EDFS30，EDFS40EDFS40玻璃化溶液中平衡玻璃化溶液中平衡252530s)30s)。將含有卵母細(xì)胞。將含有卵母細(xì)胞的的OPSOPS管放入至液氮中冷凍保存。每支管放入至液氮中冷凍保存。每支OPSOPS管最好裝入管最好裝入5-65-6枚卵母細(xì)胞。枚卵母細(xì)胞。三、實(shí)驗(yàn)3.3.卵母細(xì)胞解凍：卵母細(xì)胞解凍： 將含有卵母細(xì)胞部分直接浸入置于恒溫臺(tái)上的將含有卵母細(xì)胞部分直接浸入置于恒溫臺(tái)上的含有牛卵母細(xì)胞冷凍保存與體外孤雌培養(yǎng)技術(shù)研究含有牛卵母細(xì)胞冷凍保存與體外孤雌培養(yǎng)技術(shù)研究0.25mo

15、lL蔗糖解凍液的表面皿中，溶解后將卵母蔗糖解凍液的表面皿中，溶解后將卵母細(xì)胞用口吸管輕輕吹出并搖動(dòng)混勻，在此液中平衡細(xì)胞用口吸管輕輕吹出并搖動(dòng)混勻，在此液中平衡lmin，然后移入，然后移入0.15molL蔗糖解凍液中平衡蔗糖解凍液中平衡5min，以充分脫出卵母細(xì)胞內(nèi)部抗凍劑。以充分脫出卵母細(xì)胞內(nèi)部抗凍劑。 三、實(shí)驗(yàn)4.4.結(jié)果與討論結(jié)果與討論 4.1. 4.1.將成熟培養(yǎng)將成熟培養(yǎng)28h28h后的卵母細(xì)胞經(jīng)行麥管和后的卵母細(xì)胞經(jīng)行麥管和OPSOPS管冷凍，管冷凍，2 2種方法采用相同保護(hù)劑處理，相同方法解凍，然后經(jīng)行孤種方法采用相同保護(hù)劑處理，相同方法解凍，然后經(jīng)行孤雌激活培養(yǎng)，比較不同冷凍方

16、式對(duì)牛卵母細(xì)胞的體外成熟雌激活培養(yǎng)，比較不同冷凍方式對(duì)牛卵母細(xì)胞的體外成熟及孤雌胚發(fā)育的影響，結(jié)果見表及孤雌胚發(fā)育的影響，結(jié)果見表l l：三、實(shí)驗(yàn)4.2.本試驗(yàn)選用本試驗(yàn)選用2種不同的冷凍保護(hù)劑，對(duì)比兩種保護(hù)劑哪種更能有效種不同的冷凍保護(hù)劑，對(duì)比兩種保護(hù)劑哪種更能有效的保護(hù)牛卵母細(xì)胞。的保護(hù)牛卵母細(xì)胞。三、實(shí)驗(yàn)卵泡液對(duì)冷凍后牛卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育的卵泡液對(duì)冷凍后牛卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育的影響影響 1.1.卵母細(xì)胞的采集與成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞的采集與成熟培養(yǎng) 2. 2.卵母孤雌激活胚胎的培養(yǎng)卵母孤雌激活胚胎的培養(yǎng) 3. 3.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析三、實(shí)驗(yàn)4.結(jié)果結(jié)果本實(shí)驗(yàn)將檢出的卵母細(xì)胞分別放到含有本實(shí)驗(yàn)將檢出的卵母細(xì)胞分別放到含有0，5，10，20bFF成熟培養(yǎng)液中。比較不同濃度的卵泡液對(duì)冷凍后牛卵母成熟培養(yǎng)液中。比較不同濃度的卵泡液對(duì)冷凍后牛卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育的影響，結(jié)果見表細(xì)胞孤雌發(fā)育的影響，結(jié)果見表4。四、卵母細(xì)胞冷凍的前景及展望 隨