現代組織化學技術-組織化學--ppt課件

1、1現代組織化學技術現代組織化學技術組織化學與細胞化學組織化學與細胞化學21掌握組織化學技術的基本概念2熟悉組織化學和免疫組織化學標本的制備方法及過程3掌握酶組織化學的基本原理4熟悉高碘酸Schiff（PAS）反應、過氧化物酶、酸性磷酸酶鉛法的基本原理學習要求學習要求31. 什么是組織化學與細胞化學技術？什么是組織化學與細胞化學技術？-介于細胞生物學、組織學、化學、生物化介于細胞生物學、組織學、化學、生物化學、免疫學及分子生物學之間的邊緣科學學、免疫學及分子生物學之間的邊緣科學-對組織與細胞的化學成分或者酶活性進行對組織與細胞的化學成分或者酶活性進行定定性、定位和定量的研究性、定位和定量的研究。

2、常統(tǒng)稱為。常統(tǒng)稱為“組織化學組織化學”-在保持組織或細胞基本不改變其生活狀態(tài)時在保持組織或細胞基本不改變其生活狀態(tài)時的微細結構的條件下，利用某些特異性的反應，的微細結構的條件下，利用某些特異性的反應，采用顯微鏡技術觀察某些化學成分或酶活性在組采用顯微鏡技術觀察某些化學成分或酶活性在組織或細胞內的織或細胞內的定性、定位和定量及其變化規(guī)律定性、定位和定量及其變化規(guī)律Histochemistry and cytochemistry一、緒論一、緒論42. 組織化學與細胞化學技術的特點組織化學與細胞化學技術的特點H E染色染色H E染色染色普通組織學技術：普通組織學技術：組織原位，染色，顯微鏡觀察組織原

3、位，染色，顯微鏡觀察一、緒論一、緒論5組織原位，特異性的化學反應，顯微鏡觀察組織原位，特異性的化學反應，顯微鏡觀察對組織或者細胞內特定物質進行定性，對組織或者細胞內特定物質進行定性，定位，定位， 定量分析定量分析 組織化學與細胞化學技術組織化學與細胞化學技術鉛法（ATP酶）2. 組織化學與細胞化學技術的特點組織化學與細胞化學技術的特點一、緒論一、緒論PAS法顯示粘多糖63. 組織化學與細胞化學技術的主要類型組織化學與細胞化學技術的主要類型(1) (1) 一般組織化學與細胞化學一般組織化學與細胞化學(2) (2) 免疫組織化學與細胞化學免疫組織化學與細胞化學(3) (3) 原位雜交組織化學原位雜

4、交組織化學* 每種均有光鏡和電鏡之分和定性與定量之分一、緒論一、緒論化學方法，類化學方法，物理學方法，顯微燒灰方化學方法，類化學方法，物理學方法，顯微燒灰方法，免疫學方法，分子生物學方法等法，免疫學方法，分子生物學方法等常用分類：常用分類：74. 組織化學與細胞化學技術的基本要求組織化學與細胞化學技術的基本要求一、緒論一、緒論 保持組織和細胞的完整性 被檢物質具有不溶性和（或）可視性 反應具有特異性 反應具有靈敏性 可重復性81. 取材（取材（draw material）(1) 組織標本取材：組織標本取材：準備充分、麻醉或處死方法合適、操作迅速、刀應銳利、適當準備充分、麻醉或處死方法合適、操作

5、迅速、刀應銳利、適當清洗、離體即固定（或冷凍切片，或保存于清洗、離體即固定（或冷凍切片，或保存于-80冰箱）、冰箱）、大小適中（約大小適中（約2.5cm2.5cm0.2cm，寧可面積大，不能厚），寧可面積大，不能厚）(2) 細胞標本取材：細胞標本取材：涂片法：培養(yǎng)的懸浮細胞，人體液中的細胞等，細胞密度低涂片法：培養(yǎng)的懸浮細胞，人體液中的細胞等，細胞密度低時可先沉淀或者離心；時可先沉淀或者離心；爬片法：貼壁生長的培養(yǎng)細胞；爬片法：貼壁生長的培養(yǎng)細胞；印片法：活組織標本、尸檢標本及子宮頸外口等脫落細胞印片法：活組織標本、尸檢標本及子宮頸外口等脫落細胞二、標本的制備二、標本的制備92. 固定（固定（

6、fixation）(1) 固定的目的：固定的目的：保持組織細胞原有的形態(tài)結構；使組織硬化；對組織化保持組織細胞原有的形態(tài)結構；使組織硬化；對組織化學及細胞化學技術來說學及細胞化學技術來說-保存酶活性和蛋白質的抗原性保存酶活性和蛋白質的抗原性非常重要非常重要(2) 固定的優(yōu)、缺點：固定的優(yōu)、缺點：優(yōu)點：優(yōu)點：使組織細胞的形態(tài)結構得到保持使組織細胞的形態(tài)結構得到保持缺點：缺點：擬檢物質反應性減弱，酶的活性易受損擬檢物質反應性減弱，酶的活性易受損二、標本的制備二、標本的制備10二、標本的制備二、標本的制備2. 固定固定(3) 常用固定劑的種類及特點常用固定劑的種類及特點單一固定劑：單一固定劑：交聯固

7、定劑交聯固定劑甲醛、多聚甲醛、戊二醛甲醛、多聚甲醛、戊二醛等：與蛋白多肽鏈氨基酸側鏈的功能基團，如氨基、羥基、酰氨基等結合，使蛋白分子相互交聯，保存抗原于原位。其特點是特點是組織形態(tài)結構保存好，穿透性強，組織收縮少組織形態(tài)結構保存好，穿透性強，組織收縮少。但是，醛基與抗原蛋白氨基交聯形成羧甲基，使抗原決定簇的空間構象出現障礙，可能部分或完全遮蓋抗原可能部分或完全遮蓋抗原決定簇，決定簇，在免疫組織化學染色時產生假陰性結果。固定時縮短固定時間縮短固定時間（824小時），降低固定溫度降低固定溫度（4）、固定后充分水洗充分水洗、在免疫組織化學染色之前通過抗原修復抗原修復等可提高抗原反應性。常用的有：1

8、0%福爾馬林（即4%甲醛）、4%多聚甲醛（應用最為廣泛）多聚甲醛（應用最為廣泛）、2.5%戊二醛等戊二醛含兩個醛基，對膜結構固定更好，但是形成更多的交聯，對抗原活性有戊二醛含兩個醛基，對膜結構固定更好，但是形成更多的交聯，對抗原活性有影響影響11二、標本的制備二、標本的制備2. 固定固定(3) 常用固定劑的種類及特點常用固定劑的種類及特點單一固定劑：單一固定劑：凝固沉淀固定劑凝固沉淀固定劑丙酮、甲醇丙酮、甲醇/乙醇、苦味酸、乙酸、三氯乙酸和氯化汞等：乙醇、苦味酸、乙酸、三氯乙酸和氯化汞等：使組織細胞中的蛋白質、糖等物質凝固，優(yōu)點優(yōu)點是滲透力強，對抗原活性和酶活性保存較好；缺點缺點是固定快，易使

9、組織細胞收縮，小分子物質不容易保存，膜結構會破壞，因此對細胞結構保存不好。固定方法在4，3060 min 為宜。其他固定劑其他固定劑鉻酸、重鉻酸鉀、四氧化鋨等鉻酸、重鉻酸鉀、四氧化鋨等四氧化鋨：四氧化鋨：非電解質強氧化劑，與氨基酸、肽和蛋白質反應形成交聯，保存微細結構作用好，對組織收縮和膨脹的影響小，電鏡技術常用的固定劑12二、標本的制備二、標本的制備2. 固定固定(3) 常用固定劑的種類及特點常用固定劑的種類及特點混合固定劑：混合固定劑：Bouin固定液、固定液、Carnoy固定液、固定液、Zamboni固定液等固定液等Bouin固定液：固定液：甲醛、冰乙酸和飽和苦味酸按一定比例混合，是常用

10、的混合固定劑，特點是穿透力強、收縮作用小、固定均勻，缺點是該固定液偏酸性，對抗原活性有影響Carnoy固定液：固定液：冰乙酸、氯仿和無水乙醇組成，適于固定染色體、DNA、RNA、糖原和尼氏體等，組織化學技術常用Zamboni固定液：固定液：多聚甲醛、飽和苦味酸和Karasson-Schwilt磷酸鹽緩沖液組成，類似于Bouin固定液，對超微結構的保存優(yōu)于Bouin固定液132. 固定固定(4) 固定的方法固定的方法浸漬法、灌注法、滴片法、原位法、蒸汽法和微波法等，浸浸漬法、灌注法、滴片法、原位法、蒸汽法和微波法等，浸漬法和灌注法用的最多漬法和灌注法用的最多浸潤法：浸潤法：適用于臨床取材的標本和

11、小動物組織固定，做好適用于臨床取材的標本和小動物組織固定，做好標記，直接將組織塊修整為合適大小，投入到樣品體積的標記，直接將組織塊修整為合適大小，投入到樣品體積的40倍左右的固定劑中，固定劑的種類和固定時間的長短根據情倍左右的固定劑中，固定劑的種類和固定時間的長短根據情況而定況而定二、標本的制備二、標本的制備142. 固定固定(4) 固定的方法：固定的方法：灌流法：灌流法：適用于動物實驗中對缺氧敏感適用于動物實驗中對缺氧敏感的器官，如神經系統(tǒng)、胃腸等取材。的器官，如神經系統(tǒng)、胃腸等取材。二、標本的制備二、標本的制備包括推注，滴注滴注步驟(大鼠)：開胸- 暴露心臟- 自心尖剪開左心室-插入灌流針

12、至主動脈弓- 固定灌流針-快速注入沖洗液，剪開右心耳- 先快后慢注入固定液- 慢注畢，將動物裝入含少量固定液的塑料袋置4C冰箱內靜置2h后取材（或立即取材），放入固定液中進行后固定大動物多采用輸液方式，將固定液從一側頸總動脈或股動脈輸入，從另一側切開靜脈放血固定液的輸入量因個體不同而異，5002,000毫升不等沖洗液固定液動物152. 固定固定(5) 影響固定的因素：影響固定的因素：組織塊不宜過大：組織塊不宜過大： 組織塊過大會影響固定劑的滲透組織塊過大會影響固定劑的滲透固定液的量要合適：固定液的量要超過組織塊大小的固定液的量要合適：固定液的量要超過組織塊大小的20倍倍-30倍，可倍，可在固定

13、組織的瓶底墊上脫脂棉或幾層濾紙，保證組織塊各個方向都在固定組織的瓶底墊上脫脂棉或幾層濾紙，保證組織塊各個方向都有利于固定劑的滲入有利于固定劑的滲入選擇合適的固定劑：根據不同的組織以及后續(xù)研究方法的特點選擇選擇合適的固定劑：根據不同的組織以及后續(xù)研究方法的特點選擇合適的固定劑，滲透性強，又不使組織過度收縮或者膨脹合適的固定劑，滲透性強，又不使組織過度收縮或者膨脹固定時間的長短：根據固定劑的種類、組織塊的大小和性質、氣溫固定時間的長短：根據固定劑的種類、組織塊的大小和性質、氣溫等不同而確定，固定時間太短，不能保持組織塊的微細結構，固定等不同而確定，固定時間太短，不能保持組織塊的微細結構，固定時間過

14、長，會降低組織內物質的反應活性，如酶的活性，對抗原的時間過長，會降低組織內物質的反應活性，如酶的活性，對抗原的保存也不利保存也不利(5) 固定后的洗滌：固定后的洗滌：根據不同情況充分洗滌根據不同情況充分洗滌二、標本的制備二、標本的制備163. 包埋（包埋（embedding）(1) 包埋的目的：包埋的目的：將某種特殊的支持物質浸入到組織塊內部，利用支持物將某種特殊的支持物質浸入到組織塊內部，利用支持物（即包埋劑）的理化特性（如由固態(tài)變液態(tài)，液態(tài)變固（即包埋劑）的理化特性（如由固態(tài)變液態(tài)，液態(tài)變固態(tài)等），將整個組織加以包裹，最后凝固成均勻一致的態(tài)等），將整個組織加以包裹，最后凝固成均勻一致的固態(tài)

15、結構，用切片機切成極薄的切片固態(tài)結構，用切片機切成極薄的切片(2) 包埋劑的種類：包埋劑的種類：非水溶性：非水溶性：石蠟、樹脂、火棉膠等，包埋前必須脫水和石蠟、樹脂、火棉膠等，包埋前必須脫水和透明透明水溶性：水溶性：明膠、明膠、OCT（聚乙二醇和聚乙烯醇的混合物）（聚乙二醇和聚乙烯醇的混合物）等，包埋前不需要脫水和透明等，包埋前不需要脫水和透明二、標本的制備二、標本的制備173. 包埋包埋(3) 石蠟包埋：石蠟包埋：石蠟與水不相溶，包埋前必須脫水和透明，然后用熔化的液石蠟與水不相溶，包埋前必須脫水和透明，然后用熔化的液態(tài)石蠟對組織進行浸透，將浸透好的組織和石蠟放在室溫態(tài)石蠟對組織進行浸透，將浸

16、透好的組織和石蠟放在室溫條件下讓其凝固，方便切成極薄的切片條件下讓其凝固，方便切成極薄的切片脫水（脫水（dehydration）：）：用脫水劑置換組織中的水分，脫水會使組織收縮、變脆，因用脫水劑置換組織中的水分，脫水會使組織收縮、變脆，因此脫水劑的濃度由低到高，采用合適的脫水劑和脫水時間此脫水劑的濃度由低到高，采用合適的脫水劑和脫水時間（與組織塊大小和結構性質相關），最常用的為乙醇，組（與組織塊大小和結構性質相關），最常用的為乙醇，組織比較致密可用正丁醇織比較致密可用正丁醇二、標本的制備二、標本的制備* 柔軟的組織可從更低的濃度開始，脫水的容器密閉性要好，防止吸收空氣中的水分183. 包埋包埋

17、(3) 石蠟包埋：石蠟包埋：透明（透明（clearing）：）：脫水劑一般跟石蠟不互溶，用透明劑置換脫水劑，并使組織脫水劑一般跟石蠟不互溶，用透明劑置換脫水劑，并使組織呈現透明狀態(tài)，便于浸蠟和包埋呈現透明狀態(tài)，便于浸蠟和包埋常用透明劑為二甲苯、苯、甲苯、氯仿、正丁醇、香柏油等常用透明劑為二甲苯、苯、甲苯、氯仿、正丁醇、香柏油等二甲苯透明能力強，易使組織收縮變脆，因此時間不能太長。二甲苯透明能力強，易使組織收縮變脆，因此時間不能太長?？梢越洺Ｓ^察透明進展。如果脫水不徹底，會出現可以經常觀察透明進展。如果脫水不徹底，會出現“棗核棗核”樣的非透明區(qū)，必須返回到脫水劑中重新徹底脫水樣的非透明區(qū)，必須返

18、回到脫水劑中重新徹底脫水二、標本的制備二、標本的制備193. 包埋包埋(3) 石蠟包埋：石蠟包埋：浸蠟（浸蠟（paraffin infiltration）：）：使熔化的石蠟液浸入到已經透明的組織中，徹底置換掉透明使熔化的石蠟液浸入到已經透明的組織中，徹底置換掉透明劑。浸蠟選擇熔點為劑。浸蠟選擇熔點為5860C的石蠟，制備免疫組織化學的石蠟，制備免疫組織化學標本應該選用更低熔點的石蠟，更換標本應該選用更低熔點的石蠟，更換12次，每次次，每次0.51小小時時* 浸蠟和包埋所用的石蠟必須經過熔化后用濾紙過濾除去雜質浸蠟和包埋所用的石蠟必須經過熔化后用濾紙過濾除去雜質* 將組織塊從透明劑中移入到液態(tài)的

19、石蠟中時，動作要迅速，將組織塊從透明劑中移入到液態(tài)的石蠟中時，動作要迅速，否則液態(tài)的石蠟很容易凝固，影響到浸蠟的效果否則液態(tài)的石蠟很容易凝固，影響到浸蠟的效果二、標本的制備二、標本的制備203. 包埋包埋(3) 石蠟包埋：石蠟包埋：包埋（包埋（embedding）：）：將已浸蠟的組織塊置入裝有新熔化石蠟的包埋模具內，移出將已浸蠟的組織塊置入裝有新熔化石蠟的包埋模具內，移出烤箱，即會迅速冷卻凝固，包埋時注意將標本的切面向下，烤箱，即會迅速冷卻凝固，包埋時注意將標本的切面向下，即標本的切面接觸包埋模具的底面即標本的切面接觸包埋模具的底面* 將組織塊從浸蠟中移入到包埋模具中，動作要非常迅速，否將組織

20、塊從浸蠟中移入到包埋模具中，動作要非常迅速，否則石蠟很容易凝固，影響包埋效果則石蠟很容易凝固，影響包埋效果* 包埋的溫度不能過高或者過低，普通組織學染色可以在包埋的溫度不能過高或者過低，普通組織學染色可以在65C，免疫組織化學染色不能高于免疫組織化學染色不能高于60C二、標本的制備二、標本的制備213. 包埋包埋(3) 石蠟包埋：石蠟包埋：修塊：修塊：石蠟凝固后，組織便包封在石蠟內。切片前需把包有組織的石蠟凝固后，組織便包封在石蠟內。切片前需把包有組織的蠟塊修成一定形狀，并且把各個面修平，注意不能使蠟邊蠟塊修成一定形狀，并且把各個面修平，注意不能使蠟邊與組織邊靠得太近亦不能太遠，近則不易連片，

21、遠則廢切與組織邊靠得太近亦不能太遠，近則不易連片，遠則廢切片刀。在修塊時選適當的地方做標記，便于日后辨認片刀。在修塊時選適當的地方做標記，便于日后辨認二、標本的制備二、標本的制備223. 包埋包埋(4) 火棉膠包埋：火棉膠包埋：常用于較大組織和器官的包埋，如大小腦，以及容易塌陷的常用于較大組織和器官的包埋，如大小腦，以及容易塌陷的器官，如眼球和胚胎器官等，對器官，如眼球和胚胎器官等，對組織的收縮作用小組織的收縮作用小，保持，保持原有結構的效果好，但原有結構的效果好，但火棉膠包埋所需時間長，包埋的組火棉膠包埋所需時間長，包埋的組織塊不能做薄切片和連續(xù)切片織塊不能做薄切片和連續(xù)切片火棉膠溶液配制：

22、火棉膠溶液配制：稱取干燥的固態(tài)火棉膠，溶解于稱取干燥的固態(tài)火棉膠，溶解于100ml的乙醚的乙醚-無水乙醇（比無水乙醇（比例是例是1:1）配制成）配制成2%、4%、8%、16%的火棉膠液備用。的火棉膠液備用?；鹈弈z不易溶解，將其置入棕色瓶子內，經常搖動火棉膠不易溶解，將其置入棕色瓶子內，經常搖動* 固體狀態(tài)的火棉膠和配制成液體的火棉膠，均是易燃品，因此使固體狀態(tài)的火棉膠和配制成液體的火棉膠，均是易燃品，因此使用過程中要避開明火用過程中要避開明火*火棉膠容易吸收水分而成乳白狀，在貯存和使用過程中要注意防水火棉膠容易吸收水分而成乳白狀，在貯存和使用過程中要注意防水二、標本的制備二、標本的制備233.

23、 包埋包埋(4) 火棉膠包埋：火棉膠包埋：包埋：包埋：梯度酒精脫水，乙醚梯度酒精脫水，乙醚-無水乙醇浸泡無水乙醇浸泡24 h，（不需透明）在不同濃度的火棉，（不需透明）在不同濃度的火棉膠中分別浸泡膠中分別浸泡24 h到到1周，取出后放入含足量周，取出后放入含足量16%火棉膠的包埋盒中火棉膠的包埋盒中硬化：硬化：繼而放入干燥箱內放置繼而放入干燥箱內放置24 h，開啟盒蓋，使乙醇和乙醚揮發(fā)，包埋塊逐，開啟盒蓋，使乙醇和乙醚揮發(fā)，包埋塊逐漸硬化呈膠樣，去掉包埋盒，包埋好的組織塊放入漸硬化呈膠樣，去掉包埋盒，包埋好的組織塊放入70%乙醇或氯仿中乙醇或氯仿中24 h，最后放入，最后放入1:1的的95%乙

24、醇乙醇-甘油中保存?zhèn)溆酶视椭斜４鎮(zhèn)溆枚吮镜闹苽涠?、標本的制?43. 包埋包埋(5) 樹脂包埋：樹脂包埋：以樹脂作為包埋劑，包埋質地堅硬，易于制作很薄的切片。以樹脂作為包埋劑，包埋質地堅硬，易于制作很薄的切片。電鏡水平的標本包埋常用環(huán)氧樹脂，電鏡水平的標本包埋常用環(huán)氧樹脂，其包埋方法見其包埋方法見電子電子顯微鏡技術顯微鏡技術中中“超薄切片技術超薄切片技術”，光鏡水平的標本包埋，光鏡水平的標本包埋常用水性樹脂常用水性樹脂-甲基丙烯酸甲基丙烯酸-2-羥基乙基酯羥基乙基酯包埋劑配制：包埋劑配制：分別配制浸透劑和催化劑分別配制浸透劑和催化劑標本固定和脫水：標本固定和脫水：醛類固定劑常用，梯度酒精脫

25、水，但醛類固定劑常用，梯度酒精脫水，但是脫水可不徹底是脫水可不徹底包埋：包埋：先入浸透劑，后入浸透劑和催化劑混合液中進行先入浸透劑，后入浸透劑和催化劑混合液中進行聚合包埋聚合包埋二、標本的制備二、標本的制備254. 切片（切片（section）必須切成薄片才能染色必須切成薄片才能染色重點介紹石蠟切片、冰凍切片和振動切片重點介紹石蠟切片、冰凍切片和振動切片石蠟切片：石蠟切片：優(yōu)點：優(yōu)點：切片較薄，切片較薄，48m，組織結構保存好，抗原定位準確，連續(xù)切片，組織結構保存好，抗原定位準確，連續(xù)切片缺點：缺點：脫水透明及高溫包埋，處理時間長，抗原活性容易受損，脂類脫水透明及高溫包埋，處理時間長，抗原活性

26、容易受損，脂類物質等易被溶解物質等易被溶解過程：過程：固定蠟塊固定蠟塊-調整切面調整切面-修塊修塊-調整切片厚度調整切片厚度-切片切片-展片展片-貼片貼片-烤片烤片二、標本的制備二、標本的制備264. 切片（切片（section）(2) 冰凍切片（恒冷箱切片機）：冰凍切片（恒冷箱切片機）：優(yōu)點：優(yōu)點：不用脫水透明高溫包埋，處理時間大為縮短，抗原保存較好，不用脫水透明高溫包埋，處理時間大為縮短，抗原保存較好，可用于未固定的標本切片可用于未固定的標本切片缺點：缺點：容易形成冰晶，切片較厚，容易形成冰晶，切片較厚，1040m，結構清晰度不如石蠟切片，結構清晰度不如石蠟切片防止冰晶形成的方法：防止冰晶

27、形成的方法：高滲蔗糖溶液處理：高滲蔗糖溶液處理：20%-30%蔗糖蔗糖PB溶液浸泡溶液浸泡13天，組織塊沉天，組織塊沉底底速凍：放組織塊入速凍：放組織塊入-80C干冰或干冰或-196C液氮中速凍，或者將組織塊液氮中速凍，或者將組織塊固定在將溫度已經下降到固定在將溫度已經下降到-50C的凍頭上速凍的凍頭上速凍* 速凍前組織塊都經過高滲蔗糖浸泡過速凍前組織塊都經過高滲蔗糖浸泡過過程：過程：開機預冷開機預冷-組織包埋（用組織包埋（用OCT包埋組織于切片托上）包埋組織于切片托上）-切片切片-貼片貼片-干燥干燥-保存（如長期保存可存放于保存（如長期保存可存放于-20C，如短期可室溫放置，但防，如短期可室

28、溫放置，但防塵）塵）二、標本的制備二、標本的制備274. 切片（切片（section）二、標本的制備二、標本的制備(2) 冰凍切片（恒冷箱切片機）：冰凍切片（恒冷箱切片機）：28(3) 振動切片：振動切片：利用振動切片機的振動，使刀片橫向往復切割，將組織切成薄片利用振動切片機的振動，使刀片橫向往復切割，將組織切成薄片優(yōu)點：優(yōu)點：因組織不冷凍，無冰晶形成，染色前又避免了組織脫水、透明、因組織不冷凍，無冰晶形成，染色前又避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對抗原的損害，故能較好地保留組織內脂溶性物質和細胞包埋等步驟對抗原的損害，故能較好地保留組織內脂溶性物質和細胞膜抗原，標本可以是經過固定的或者新鮮的

29、（少數情況下）膜抗原，標本可以是經過固定的或者新鮮的（少數情況下）缺點：缺點：切片較前兩種方法厚，切片較前兩種方法厚，20400m，結構清晰度較差，結構清晰度較差二、標本的制備二、標本的制備4. 切片（切片（section）294. 切片切片(4) 防脫片處理：防脫片處理：A. 載玻片和蓋玻片的處理載玻片和蓋玻片的處理黏附劑的使用黏附劑的使用- 蛋白甘油蛋白甘油- 鉻礬明膠液鉻礬明膠液 ：鉻礬（：鉻礬（0.05%）、明膠（）、明膠（0.5%）和疊氮鈉）和疊氮鈉（0.01%）- 多聚賴氨酸：多聚賴氨酸：0.010.05%C. 直接購買已經制備好的防脫片載玻片直接購買已經制備好的防脫片載玻片二、標

30、本的制備二、標本的制備305. 非切片標本制備非切片標本制備無需切片即可制成標本的制備方法，包括細胞涂片、分離組織、無需切片即可制成標本的制備方法，包括細胞涂片、分離組織、組織磨片、整體封存、組織鋪片等組織磨片、整體封存、組織鋪片等細胞涂片：細胞涂片：如血涂片如血涂片組織分離標本：組織分離標本：化學溶解法或者酶消化法化學溶解法或者酶消化法組織磨片法：組織磨片法：骨磨片骨磨片整體封存標本：整體封存標本：早期雞胚、運動終板等早期雞胚、運動終板等(1) 組織鋪片：組織鋪片：結締組織鋪片結締組織鋪片二、標本的制備二、標本的制備316. 標本封固標本封固標本經過染色等系列處理后，需封固，即將蓋玻片和載玻

31、片粘在一起，標本經過染色等系列處理后，需封固，即將蓋玻片和載玻片粘在一起，方便照相和保存方便照相和保存含水封固劑：含水封固劑：甘油、甘油明膠、液體石蠟（用于整體標本的封甘油、甘油明膠、液體石蠟（用于整體標本的封固），固），Clear-Mount（不需蓋玻片）（不需蓋玻片）優(yōu)點：無需脫水，因此不導致組織收縮變形優(yōu)點：無需脫水，因此不導致組織收縮變形缺點：失水導致封固劑干縮，封固不牢缺點：失水導致封固劑干縮，封固不牢無水封固劑：無水封固劑：天然樹膠、人工合成樹膠（中性樹膠）天然樹膠、人工合成樹膠（中性樹膠）優(yōu)點：封固牢固，長期保存優(yōu)點：封固牢固，長期保存缺點：切片必須徹底脫水和透明，可能導致組織收

32、縮，二甲苯有毒，缺點：切片必須徹底脫水和透明，可能導致組織收縮，二甲苯有毒，必須在通風櫥內操作必須在通風櫥內操作二、標本的制備二、標本的制備327. 組織芯片（組織芯片（tissue chip）技術）技術又稱組織微陣列，是生物芯片的一種，將千百個組織標本整齊有序的排列在固又稱組織微陣列，是生物芯片的一種，將千百個組織標本整齊有序的排列在固相載體上，制成縮微的組織切片，結合免疫組織化學、原位雜交等技術，對多相載體上，制成縮微的組織切片，結合免疫組織化學、原位雜交等技術，對多種不同生物組織同時進行形態(tài)結構比較、基因和蛋白表達水平的定位檢測種不同生物組織同時進行形態(tài)結構比較、基因和蛋白表達水平的定位

33、檢測優(yōu)點：優(yōu)點：大樣本高通量，高效性，平行性和實驗誤差小大樣本高通量，高效性，平行性和實驗誤差小問題：問題：人體標本石蠟組織庫的建立，組織芯片制備的標準化，組織芯片的自動人體標本石蠟組織庫的建立，組織芯片制備的標準化，組織芯片的自動化分析化分析二、標本的制備二、標本的制備338. 顯微切割顯微切割 技術（技術（microdissection）在顯微狀態(tài)或顯微鏡直視下，通過顯微操作系統(tǒng)，從組織切片或者細在顯微狀態(tài)或顯微鏡直視下，通過顯微操作系統(tǒng)，從組織切片或者細胞涂片中切割分離欲研究的材料，如組織、細胞群、單個細胞及細胞胞涂片中切割分離欲研究的材料，如組織、細胞群、單個細胞及細胞內組分或者染色體

34、等內組分或者染色體等二、標本的制備二、標本的制備激光捕獲顯微切割系統(tǒng)操作步驟A，準備組織；B，定位細胞；C，放置帶有EVA膜的收集蓋；D，激發(fā)激光；E，分離目的組織；F，下游實驗分析非接觸式激光顯微切割方法- Leica Laser MicrodissectionA，劃定目標區(qū)域；B，控制激光沿切割線移動；C，目的樣品通過重力收集34生物燃料將無色的組織和細胞染上不同的顏色，便于顯微鏡觀察，廣生物燃料將無色的組織和細胞染上不同的顏色，便于顯微鏡觀察，廣泛應用于組織學和病理學等學科泛應用于組織學和病理學等學科蘇木精蘇木精-伊紅（伊紅（HE）染色（）染色（hematoxylin-eosin sta

35、ining）染色原理：染色原理：蘇木精為堿性染料，使細胞核和胞質內的嗜堿性物質染蘇木精為堿性染料，使細胞核和胞質內的嗜堿性物質染成紫藍色，伊紅為酸性染料，使胞質中的嗜酸性物質染成紅色或粉成紫藍色，伊紅為酸性染料，使胞質中的嗜酸性物質染成紅色或粉紅色紅色石蠟切片石蠟切片HE染色步驟：染色步驟：脫蠟（二甲苯）：充分徹底脫蠟（二甲苯）：充分徹底梯度酒精水化梯度酒精水化100%I-100%II-95%-80%-70%-水水蘇木精染色蘇木精染色1.時間根據情況而變化時間根據情況而變化三、常用組織學染色技術三、常用組織學染色技術35蘇木精蘇木精-伊紅（伊紅（HE）染色（）染色（hematoxylin-eo

36、sin staining）(2) 石蠟切片石蠟切片HE染色步驟：染色步驟：水洗：水洗：用自來水洗，弱堿性，加強蘇木精的著色用自來水洗，弱堿性，加強蘇木精的著色分色：分色：將過度染色和無需染色的部分去掉，將過度染色和無需染色的部分去掉，70%酒精配制的酒精配制的0.5%1%鹽鹽酸處理數秒，使細胞核和細胞質顯示清晰，對比明顯酸處理數秒，使細胞核和細胞質顯示清晰，對比明顯藍化：藍化：如果分色后染色較弱，可入如果分色后染色較弱，可入0.5%1%氨水中藍化氨水中藍化伊紅染色：伊紅染色：切片在切片在0.5%1%伊紅中染色伊紅中染色23分鐘，自來水洗去多余的染液。伊分鐘，自來水洗去多余的染液。伊紅染色切忌過

37、強，水洗要快速紅染色切忌過強，水洗要快速三、常用組織學染色技術三、常用組織學染色技術36蘇木精蘇木精-伊紅（伊紅（HE）染色（）染色（hematoxylin-eosin staining）(2) 石蠟切片石蠟切片HE染色步驟：染色步驟：脫水：脫水：用梯度酒精脫水，用梯度酒精脫水，70%-80%-95%-100%I-100%II，濃度低的酒精有脫，濃度低的酒精有脫色作用，時間不能長，高濃度酒精中時間要足夠，脫水要徹底色作用，時間不能長，高濃度酒精中時間要足夠，脫水要徹底透明：透明：切片入二甲苯切片入二甲苯I、II中各中各10分鐘，將酒精置換出，并且使切片清澈分鐘，將酒精置換出，并且使切片清澈透明

38、，切記在通風櫥中操作透明，切記在通風櫥中操作封片及鏡檢：封片及鏡檢：濾紙吸干組織周圍的二甲苯，滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，防止形成濾紙吸干組織周圍的二甲苯，滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，防止形成氣泡，顯微鏡觀察，切片平放，自然干燥氣泡，顯微鏡觀察，切片平放，自然干燥三、常用組織學染色技術三、常用組織學染色技術37蘇木精蘇木精-伊紅（伊紅（HE）染色（）染色（hematoxylin-eosin staining）三、常用組織學染色技術三、常用組織學染色技術結果觀察結果觀察382. 神經組織鍍銀染色神經組織鍍銀染色將固定后的組織或切片浸于銀溶液中，再用還原劑出來，使銀顆粒附將固定后的組織或切片浸于銀溶液

39、中，再用還原劑出來，使銀顆粒附著在組織結構上，使之呈現出深棕色或者黑色著在組織結構上，使之呈現出深棕色或者黑色親銀性：親銀性：某些組織（如神經組織）經硝酸銀處理后可使硝酸銀還原，某些組織（如神經組織）經硝酸銀處理后可使硝酸銀還原，這種性質即親銀性這種性質即親銀性嗜銀性：嗜銀性：有些結構（如網狀纖維）不直接還原銀，需加入還原劑才能有些結構（如網狀纖維）不直接還原銀，需加入還原劑才能顯示銀顆粒，為嗜銀性顯示銀顆粒，為嗜銀性神經纖維鍍銀改良法染色：神經纖維鍍銀改良法染色：(1) 試劑：試劑：20%硝酸銀，氨銀液（硝酸銀硝酸銀，氨銀液（硝酸銀-無水乙醇無水乙醇-氫氧化銨），氫氧化銨），0.2%氯化金，

40、氯化金，5%硫代硫酸鈉，麗春紅酸性品紅溶液，硫代硫酸鈉，麗春紅酸性品紅溶液，1%磷鉬酸，淡綠液磷鉬酸，淡綠液（淡綠和冰乙酸）（淡綠和冰乙酸）三、常用組織學染色技術三、常用組織學染色技術392. 神經組織鍍銀染色神經組織鍍銀染色神經纖維鍍銀改良法染色：神經纖維鍍銀改良法染色：(2) 染色步驟：略染色步驟：略(3) 結果觀察結果觀察三、常用組織學染色技術三、常用組織學染色技術40四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術 化學反應化學試劑化學試劑 + 擬檢物質擬檢物質 反應產物沉淀反應產物沉淀（有色）（有色） （組織切片或細胞涂片） （擬檢物質所在處） 組織化學的基本原理組織化學的基本原理組

41、織原位，特異性的化學反應，顯微鏡觀察組織原位，特異性的化學反應，顯微鏡觀察對組織或者細胞內特定物質進行定性，對組織或者細胞內特定物質進行定性，定位，定位， 定量分析定量分析 組織化學的基本特點組織化學的基本特點41碳水化合物組織化學技術（以碳水化合物組織化學技術（以PAS反應為例）反應為例）碳水化合物也稱為糖類化合物，常含有一個醛基或者水解后產生醛基，組織結碳水化合物也稱為糖類化合物，常含有一個醛基或者水解后產生醛基，組織結構內以黏多糖最常見，中性黏多糖可用過碘酸構內以黏多糖最常見，中性黏多糖可用過碘酸-雪夫（雪夫（periodic acid-Schiff，PAS）反應顯示，酸性黏多糖可用阿利

42、新藍（）反應顯示，酸性黏多糖可用阿利新藍（alician blue，AB）反應顯示）反應顯示原理：原理：過碘酸為強氧化劑，可氧化黏多糖產生游離醛基，與過碘酸為強氧化劑，可氧化黏多糖產生游離醛基，與Schiff試劑中試劑中無色的亞硫酸品紅反應，生成紫紅色沉淀物，根據沉淀物的位置和顏色的無色的亞硫酸品紅反應，生成紫紅色沉淀物，根據沉淀物的位置和顏色的強度判斷黏多糖的分布部位和含量的多少，但是要注意控制好氧化時間，強度判斷黏多糖的分布部位和含量的多少，但是要注意控制好氧化時間，過碘酸的過碘酸的pH值以值以3.05.0為佳為佳* 固定劑不能選用醛類固定劑（尤其不能選用含兩個醛基的固定劑），常用固定劑不

43、能選用醛類固定劑（尤其不能選用含兩個醛基的固定劑），常用Carnoy固定液（無水乙醇固定液（無水乙醇-氯仿氯仿-冰乙酸）冰乙酸）四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術422. 脂類組織化學技術（以油紅脂類組織化學技術（以油紅O染色法為例）染色法為例）脂類是構成細胞結構的重要化合物，酸性脂類包括脂肪酸和磷脂等，中心脂類包脂類是構成細胞結構的重要化合物，酸性脂類包括脂肪酸和磷脂等，中心脂類包括甘油三酯、膽固醇及固醇脂、類固醇及糖脂等。括甘油三酯、膽固醇及固醇脂、類固醇及糖脂等。常用甲醛鈣固定，甲醛不能直接固定脂類，但是可固定脂類周邊的蛋白質，鈣離常用甲醛鈣固定，甲醛不能直接固定脂類，但是

44、可固定脂類周邊的蛋白質，鈣離子有利于保存磷脂，固定時間不宜超過子有利于保存磷脂，固定時間不宜超過10 min；常用冰凍切片（常用冰凍切片（為什么不能使用石蠟切片？為什么不能使用石蠟切片？）；）；油紅油紅O染色法（物理顯色法中的一種）：染色法（物理顯色法中的一種）：原理：原理：油紅油紅O屬于偶氮染料，是很強的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結合形成小屬于偶氮染料，是很強的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結合形成小脂滴。染液入組織中，染料（染料在溶劑中的溶解度小于在脂類物質中的溶解度）脂滴。染液入組織中，染料（染料在溶劑中的溶解度小于在脂類物質中的溶解度）可溶解于組織中的脂類中，使組織中的脂滴染成紅色可溶解于

45、組織中的脂類中，使組織中的脂滴染成紅色四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術433. 酶組織化學技術酶組織化學技術酶是體內特殊的蛋白質，每種酶可以催化特定的化學反應。用組織化酶是體內特殊的蛋白質，每種酶可以催化特定的化學反應。用組織化學的方法在一定條件下加入酶的底物，底物在酶的催化作用下產生了學的方法在一定條件下加入酶的底物，底物在酶的催化作用下產生了反應產物，根據反應產物的分布及量可檢測酶的分布和活性。反應產物，根據反應產物的分布及量可檢測酶的分布和活性。為了不為了不損失酶活性，審慎選擇固定方法損失酶活性，審慎選擇固定方法四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術酶特異性底物

46、酶特異性底物 + + 相關捕獲劑相關捕獲劑 酶酶（孵育液內）（孵育液內）（組織細胞內）（組織細胞內）鏡下觀察鏡下觀察有色沉淀有色沉淀反應產物沉淀反應產物沉淀（有色有色）反應產物沉淀反應產物沉淀（無色無色）+ + 置換劑置換劑（1）基本原理）基本原理443. 酶組織化學技術酶組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術（2）常用顯示方法）常用顯示方法偶聯偶氮色素法：偶聯偶氮色素法：又稱偶氮色素法，用某種人工合成底物在酶作用下產生分解產物，后者與重氮鹽結合，引起偶聯偶氮反應，形成不溶性偶氮色素A. 同時偶聯法：同時偶聯法：該法是孵育液中的底物被酶分解后所產生的反應物沉淀立即與重氮鹽

47、形成重氮化合物的偶氮色素而顯色B. 后偶聯法：后偶聯法：該法是為了防止重氮鹽對酶的抑制作用，而先使酶作用于底物，使其分解產生反應物沉淀，然后將其浸漬于重氮鹽溶液中，使其形成偶氮色素而顯色45+OPO2CaOHOH-磷酸萘酚磷酸萘酚-萘基氯化重氮鹽萘基氯化重氮鹽不溶性不溶性偶氮色素偶氮色素N=NOH酶作用酶作用NNCl偶聯偶氮色素法：偶聯偶氮色素法：463. 酶組織化學技術酶組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術（2）常用顯示方法）常用顯示方法金屬金屬-金屬鹽顯示法金屬鹽顯示法 : 金、銀、銅、鐵、鉛、鈷等金屬本身或其鹽和化合物具有顏色，容易發(fā)生呈色反應，酶的分解產物與這些

48、金屬結合，呈現顏色A. 鈣鈣-鈷法：鈷法： R-PO4Na2 + H2O R-OH + CaHPO4CaHPO4 Co3(PO4) 2Co3(PO4) 2 CoS （顯色）（顯色）CaCl2酶作用酶作用Co(NO3)2(NH4)2S（無色沉淀）（無色沉淀）473. 酶組織化學技術酶組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術（2）常用顯示方法）常用顯示方法金屬金屬-金屬鹽顯示法金屬鹽顯示法 : 金、銀、銅、鐵、鉛、鈷等金屬本身或其鹽和化合物具有顏色，容易發(fā)生呈色反應，酶的分解產物與這些金屬結合，呈現顏色B. 鉛法：鉛法：R-PO4Na2 + H2O R-OH + PbHPO4P

49、bHPO4 PbS （顯色）（顯色）酶作用酶作用Pb2+(NH4)2S483. 酶組織化學技術酶組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術（2）常用顯示方法）常用顯示方法色素形成法色素形成法 : 在酶的作用下，無色的化學物質在局部形成有色的色素沉著。有四種類型A. 四唑鹽法：四唑鹽法：顯示脫氫酶C6H5CNNC6H5NNC6H5酶作用酶作用+2HC6H5CNNHC6H5NNC6H5+ HCl四唑鹽四唑鹽(無色無色)甲甲月朁月朁 （紅色紅色）493. 酶組織化學技術酶組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術（2）常用顯示方法）常用顯示方法色素形成法色素形成法

50、 : 在酶的作用下，無色的化學物質在局部形成有色的色素沉著。有四種類型，B. 靛酚藍法：靛酚藍法：檢測氧化酶C. 靛藍形成法：靛藍形成法：顯示磷酸酶和酯酶等D. 聯苯胺色素法：聯苯胺色素法：主要用于證明過氧化物酶，過氧化物酶作用于過氧化氫，釋放出原子氧，后者將無色的聯苯胺氧化成有色的多聚體沉淀物，沉淀于酶所在的部位免疫組織化學法：免疫組織化學法：酶是蛋白質，可用相應的抗體檢測，檢測的主要是酶的表達，而不能等同于酶的活性（詳見免疫組織化學技術）503. 酶組織化學技術酶組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術（3）過氧化物酶組織化學技術）過氧化物酶組織化學技術原理：原理：過氧

51、化物酶作用于過氧化氫（底物），釋放出原子氧，后者將無色的聯苯胺（二氨基聯苯胺DAB或者四甲基聯苯胺TMB）氧化成多聚體有色沉淀，DAB被氧化成棕色沉淀，TMB被氧化成深藍色沉淀，位于酶所在的部位孵育液：孵育液：含DAB、Tris-HCl緩沖液及H2O2* 孵育液使用前混合對照實驗：對照實驗：加入酶的抑制劑氰化鉀或者疊氮鈉513. 酶組織化學技術酶組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術（4）琥珀酸脫氫酶（）琥珀酸脫氫酶（SDH）組織化學技術組織化學技術原理：原理：SDH是線粒體呼吸鏈的第一個酶，是三羧酸循環(huán)的標志酶，也是線粒體的標志酶，可用硝基藍四唑鹽法顯示，SDH以黃素蛋

52、白為輔基，將琥珀酸氧化為延胡索酸并釋放出氫，后者將淡藍四唑（NBT）還原為藍色的甲月朁孵育液：孵育液：含NBT，二甲基亞砜（DMSO），琥珀酸和0.1MPB緩沖液*SDH對固定敏感，最好新鮮標本經冰凍切片后，2%甲醛固定5min，如果是必須固定的組織，建議降低固定液濃度，縮短固定時間*先用DMSO溶解NBT，再加入琥珀酸和磷酸緩沖液對照實驗：對照實驗：不加底物或者加入酶的抑制劑丙二酸鹽523. 酶組織化學技術酶組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術（5）酸性磷酸酶（）酸性磷酸酶（ACP）組織化學技術）組織化學技術原理：原理：ACP是溶酶體的標志酶，顯示方法多采用金屬法中的

53、鉛法。孵育液：孵育液：含乙酸鹽緩沖液，蔗糖，硝酸鉛，-甘油磷酸鈉* ACP對固定敏感，新鮮標本經冰凍切片后，4%甲醛固定10min*先將-甘油磷酸鈉溶解于緩沖液，后緩慢滴加硝酸鉛，不停攪拌，或者將前面三項物質混合溶解，少量多次逐漸加入-甘油磷酸鈉，孵育液過濾后使用，注意注意pH值值對照實驗：對照實驗：孵育液中加入酶的抑制劑氟化鈉 R-O-PO3Na2 R-OH + H3PO4 (-甘油磷酸鈉甘油磷酸鈉) H3PO4 + Pb2+ Pb3(PO4)2 Pb3(PO4)2 + (NH4)2S PbS(棕黑色棕黑色)ACPpH 5.0533. 酶組織化學技術酶組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、

54、常用一般組織化學技術（6）堿性磷酸酶（）堿性磷酸酶（ALP）組織化學技術）組織化學技術原理：原理：ALP在堿性環(huán)境下（pH9.29.4）可催化酚和醇的磷酸酯水解，并轉移磷酸，多分布于細胞膜運輸活躍的細胞。顯示方法有鈣-鈷法和偶聯-偶氮色素法兩種。鈣-鈷法的原理為，堿性環(huán)境下，底物-甘油磷酸鈉在ALP作用下產生磷酸，與鈣形成無色的磷酸鈣沉淀，加入硝酸鈷，形成仍然無色的磷酸鈷沉淀，最后用硫化銨處理，形成棕黑色的硫化鈷沉淀孵育液：孵育液：含氯化鈣，巴比妥鈉，-甘油磷酸鈉，硫酸鎂* ALP對固定敏感，新鮮標本經冰凍切片后，4%甲醛固定10min，* 注意注意pH值對照實驗：對照實驗：不加底物或者加入酶

55、的抑制劑L-四唑咪543. 酶組織化學技術酶組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術（7）乙酰膽堿酯酶（）乙酰膽堿酯酶（AchE）組織化學技術）組織化學技術原理：原理：將乙酰膽堿鹽水解產生硫膽堿，進而還原鐵氰化物為亞鐵氰化物，后者與銅離子結合成亞鐵氰化銅棕色沉淀孵育液：孵育液：含乙酰硫代膽堿碘鹽，乙酸緩沖液，檸檬酸鈉，硫酸銅，鐵氰化鉀* 對固定敏感，新鮮標本經冰凍切片后，4%甲醛固定20min對照實驗：對照實驗：不加底物或者加入酶的抑制劑毒扁豆堿硫酸酯 碘化乙酰硫代膽堿碘化乙酰硫代膽堿 + H2O 硫代膽堿硫代膽堿 + 醋酸醋酸 硫代膽堿硫代膽堿 + 鐵氰化物鐵氰化物 亞鐵

56、氰化物亞鐵氰化物 亞鐵氰化物亞鐵氰化物 + Cu2+ 亞鐵氰化銅亞鐵氰化銅 (棕褐色棕褐色）AchEpH 5.555L-精氨酸精氨酸NADPH（介導介導）NOSL-瓜氨酸瓜氨酸 + NO + 電子電子電子電子NADPH（傳遞傳遞）硝基四唑藍（硝基四唑藍（N-BT）甲甲月替月替3. 酶組織化學技術酶組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術（8）一氧化氮合酶（）一氧化氮合酶（NOS）組織化學技術）組織化學技術對照實驗：對照實驗：不加底物或者加入酶的抑制劑N-亞硝基精氨酸預孵育NOS是一種重要的連接酶，NO是一種神經遞質、細胞間信使、內皮源性的松弛血管的介質，但是極不穩(wěn)定，常用N

57、OS的活性來判斷NO的分布和量，而NOS與還原型輔酶II-黃遞酶（NADPH-d）的化學結構和組織定位高度一致，常用NADPH-黃遞酶法顯示NOS563. 酶組織化學技術酶組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術（9）酶組織化學染色注意事項）酶組織化學染色注意事項標本制備：標本制備：組織的準備和切片的制作不能影響酶的活性和分布溫度：溫度：任何酶促反應都有相應的最適溫度pH值：值：各種酶促反應具有各自合適的pH值范圍孵育液各成分的濃度：孵育液各成分的濃度：酶反應速度受孵育液內參與反應的各種成分（底物、捕捉劑、激活劑、抑制劑等）濃度的影響激活劑：激活劑：激活劑是能使酶活性增強的

58、物質。檢測某些活性較低的酶時，應使用激活劑增強酶的活力抑制劑：抑制劑：抑制劑系指某些物質在不引起酶蛋白變性情況下，使酶活性減弱，抑制酶的活力，甚至使酶活性消失的物質。抑制劑主要分為非特異性、特異性和競爭性三類對照實驗：對照實驗：酶的抑制劑；不加底物；陽性對照574. 核酸組織化學技術核酸組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術（1）Feulgen反應反應原理：原理：DNA在酸性環(huán)境下水解，嘌呤-脫氧核糖間的糖苷鍵打開，形成醛基，與無色的Schiff試劑反應，形成紫紅色反應沉淀產物* 不能用新鮮標本（含有縮醛磷脂，導致非特異反應），需經Carnoy固定液固定后石蠟切片；* 處

59、理時間不能過長，會導致DNA完全水解，反而不能顯示* Schiff試劑中的SO2易逸出，要用棕色瓶并塞緊瓶蓋低溫保存對照實驗：對照實驗：不加底物或者加入酶的抑制劑毒扁豆堿硫酸酯核酸（nucleic acid）是生物遺傳物質基礎，包括DNA、RNA，前者分布于細胞核，后者分布于核仁和胞質的核糖體內。主要介紹Feulgen反應和三種常用的熒光素染色法584. 核酸組織化學技術核酸組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術（2）DAPI染色染色原理、特征及應用：原理、特征及應用：特異性熒光染料DAPI（4,6-二氨基-2-苯基吲哚）對DNA雙鏈具有很強親和力，能與雙鏈DNA小溝結合，結合后熒光增強20倍，而與單鏈DNA結合無熒光增強，與RNA結合熒光增強也不如雙鏈DNA；DAPI具有膜通透性，可區(qū)別未經固定的活細胞（較弱的藍色熒光）和凋亡細胞（產生很強的藍光染色），DAPI的熒光強度較Hoechst低，但熒光穩(wěn)定性優(yōu)于Hoechst；廣泛用于流式細胞術、熒光顯微鏡和微孔板高通量熒光分析；因為是藍光，可以與FITC、GFP或Texas Red等熒光染料合用進行多參數分析，DAPI也用于檢測細胞培養(yǎng)體系中的支原體或病毒DNA594. 核酸組織化學技術核酸組織化學技術四、常用一般組織化學技術四、常用一般組織化學技術（2）DAPI染色染色