十二味液化散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究(一)

1、十二味液化散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究(一)    【摘要】 目的：建立十二味液化散的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對(duì)制劑中主要藥材赤芍、丹參、黃柏、陳皮進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC測(cè)定丹參中丹參酮A的含量。結(jié)果：鑒別方法專屬性強(qiáng)，定量方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。丹參酮A在5.440 g32.640 g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 966 3），平均回收率為99.99（n=5），RSD0.3。結(jié)論：本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所用方法準(zhǔn)確可靠，可行性及重現(xiàn)性良好，能有效地控制該制劑的質(zhì)量。 【關(guān)鍵詞】 十二味液化散；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；TLC；HPLC；丹參酮AKey words Shier

2、wei Yehua Powder，quality standard，TLC，HPLC，tanshinone A十二味液化散由深圳市中醫(yī)院提供，由黃柏、女貞子、知母、地黃、赤芍、丹參、炮山甲、三棱、莪術(shù)、海金沙、澤瀉、陳皮12味中藥組成。為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，保證臨床用藥安全有效，本文對(duì)十二味液化散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究。根據(jù)處方中藥材的理化性質(zhì)，采用薄層色譜法對(duì)制劑中黃柏、赤芍、丹參、陳皮4味藥材進(jìn)行了定性鑒別，采用HPLC法測(cè)定丹參中丹參酮A的含量。結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)便、快速、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，結(jié)果令人滿意，可作為該制劑質(zhì)量控制的方法。1 實(shí)驗(yàn)材料.1 實(shí)驗(yàn)儀器Diamonsil 鉆

3、石C18（250 mm×4.6 mm）色譜柱，SPD-10AVP檢測(cè)器，LC-10ADVP，CS-Light工作站，CTO-10ASVP柱溫箱，AG285電子分析天平，HS2060超聲波清洗機(jī)。1.2 藥品與試劑丹參對(duì)照藥材（批號(hào)：923-9001），黃柏對(duì)照藥材（批號(hào)：121510-200501），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-200527），鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：713-9003），丹參酮A對(duì)照品（批號(hào)：766-200112，HPLC用丹參酮A對(duì)照品批號(hào)：110766-200315），均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；水為樂百氏純凈水；甲醇為色譜純（天津科密歐）；其他試劑均為分

4、析純。2 方法與結(jié)果2.1 十二味液化散定性鑒別取本品粉末置顯微鏡下觀察：纖維束鮮黃色，周圍細(xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維。果皮表皮細(xì)胞黃棕色或紫棕色，表面呈類多角形，胞間層似細(xì)縫狀，垂周壁厚，胞腔由深入的外壁分隔成若干個(gè)不規(guī)則的小腔，胞腔內(nèi)含黃棕色或紫棕色物。草酸鈣針晶成束或散在，針晶長(zhǎng)36 m110 m，較細(xì)。薄壁細(xì)胞類圓形，內(nèi)含圓形細(xì)胞核。草酸鈣簇晶眾多，散在或存在于薄壁細(xì)胞中，常數(shù)個(gè)或數(shù)十個(gè)縱向排列成行。孢子黃色，圓錐體狀，表面有顆粒狀突起。薄壁細(xì)胞類圓形，有橢圓形紋孔集成紋孔域。2.2 赤芍的薄層鑒別取處方粉末10 g，加乙醇50 mL，超聲提取20 min，濾過，濾液蒸干，加水20

5、mL 使溶解，用水飽和的正丁醇提取3次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，用乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。取芍藥苷對(duì)照品適量，加乙醇制成2 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。除赤芍以外，其余各藥按處方比例投料，制成陰性對(duì)照品，再按供試品溶液的制備方法，制得缺赤芍的陰性對(duì)照品溶液。參照薄層色譜法（中國(guó)藥典2005年版一部 152附錄VIB）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照品溶液各5 L分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（455100.2）為展開劑，展開，取出，晾干。噴5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的

6、藍(lán)紫色斑點(diǎn)。陰性對(duì)照品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，無(wú)藍(lán)紫色斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。2.3 黃柏的薄層鑒別取處方粉末5 g，加甲醇50 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液濃縮至10 mL，作為供試品溶液。取黃柏對(duì)照藥材50 mg，加甲醇5 mL同法制成對(duì)照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成0.5 mg /mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。除黃柏以外，其余各藥按處方比例制成陰性對(duì)照品，再按供試品溶液的制備方法，制得缺黃柏的陰性對(duì)照品溶液。參照薄層色譜法（中國(guó)藥典2005年版一部 1109附錄VIB）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照藥品溶液、對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液各5 L分別點(diǎn)于同一硅膠

7、G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮 -甲酸-水（10611）為展開劑，置氨蒸氣預(yù)飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，無(wú)熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖2。2.4 丹參的薄層鑒別取處方粉末10 g，加乙醚10 mL，振搖，放置1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL溶解，作為供試品溶液。取丹參對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取丹參酮A對(duì)照品適量，加乙酸乙酯制成2 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。除丹參以外，其余各藥

8、按處方比例制成陰性對(duì)照品，再按供試品溶液的制備方法，制得缺丹參的陰性對(duì)照品溶液。參照薄層色譜法（中國(guó)藥典2005年版一部1132附錄VIB）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液各5 L分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯（191）為展開劑，展開，取出，晾干，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的暗紅色斑點(diǎn)。在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色斑點(diǎn)。陰性對(duì)照品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，無(wú)斑點(diǎn)。結(jié)果見圖3。2.5 陳皮的薄層鑒別取本品粉末適量，加甲醇20 mL，加熱回流20 min，濾過，濾液蒸干，加甲醇2 mL，作為供試品溶液。另取橙皮

9、苷對(duì)照品50 mg，加甲醇制成飽和溶液，作為對(duì)照品溶液。除陳皮以外，其余各藥按處方比例制成陰性對(duì)照品，再按供試品溶液的制備方法，制得缺陳皮的陰性對(duì)照品溶液。參照薄層色譜法（中國(guó)藥典2005年版一部 1214附錄VIB）試驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照品溶液各5 L分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（7211）為展開劑，展開，取出，晾干，噴2%三氯化鋁乙醇溶液，揮干后，置紫外燈（365 nm）下檢視。因?qū)φ掌贩胖脮r(shí)間過長(zhǎng)，不顯示斑點(diǎn)，故放棄。3 含量測(cè)定3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)用十八硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-水（8713）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm

10、。理論塔板數(shù)按丹參酮A峰計(jì)算不應(yīng)低于6 000。3.2 對(duì)照品溶液的制備取丹參酮A對(duì)照品適量，精密稱定0.006 8 g，置50 mL棕色的容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為初始液；精密量取3 mL，置25 mL棕色瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每毫升含丹參酮A 16.32 g）。3.3 供試品溶液的制備取本品粉末約4.0 g，精密稱定3.453 4 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，精密稱定，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，即得。3.4 陰性對(duì)照品溶液的制備除丹參以外，其余各藥按處方比例制成陰性對(duì)照品，再按供試品溶液的制備方法，制得缺丹參的陰

11、性對(duì)照品溶液。3.5 測(cè)定方法精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液各20 L，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。結(jié)果見圖4圖6。3.6 線性關(guān)系考察精密吸取3.2中初始液1 mL、2 mL、3 mL、5 mL、6 mL，分別置25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取3.2中對(duì)照品溶液20 L注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，丹參酮A進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸，得回歸方程為Y=136 019.8 X-1 843.088。結(jié)果表明：丹參酮A在 5.440 g32.640 g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。3.7 精密度試驗(yàn)取丹參酮A對(duì)照品，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，RSD

12、=0.648 578 2，結(jié)果表明精密度良好。3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液， 在1 h、2 h、4 h、6 h、8 h各進(jìn)樣20 L，重復(fù)5次， RSD=0.9，結(jié)果表明丹參酮A在8 h內(nèi)穩(wěn)定。3.9 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品，按3.3項(xiàng)下方法制備5份供試品溶液，測(cè)定含量，RSD=1.2，表明此法重復(fù)性良好。3.10 干擾試驗(yàn)分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液各20 L，按上述色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明陰性對(duì)照溶液對(duì)丹參酮A峰無(wú)干擾。3.11 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知丹參酮A含量同一批號(hào)的樣品5份，分別加入對(duì)照品溶液1.0 mL，按供試品溶液制備及含量測(cè)定的方法進(jìn)行測(cè)定

13、，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。結(jié)果表明本測(cè)定方法丹參酮A的平均回收率為99.97%，RSD為0.3，回收率良好。3.12 樣品含量測(cè)定取3個(gè)批號(hào)樣品，按3.3項(xiàng)下方法制備，分別精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20 L，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定丹參酮A含量，結(jié)果樣品1的濃度和含量分別為0.018 67 mg/mL和0.36%，樣品2的濃度和含量分別為0.018 71 mg/mL和0.36%，樣品3的濃度和含量分別為0.018 76 mg/mL和0.36%。4 討 論鹽酸小檗堿具有一定的極性，在黃柏的薄層鑒別中用氨飽和的展開劑，在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)Rf值過小的現(xiàn)象，分析原因可能為氨蒸氣飽和時(shí)間太短（15 min），將飽和時(shí)間延長(zhǎng)為25 min后，展開后鹽酸小檗堿的Rf值有顯著改善 2。流動(dòng)相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)很重要，甲醇體積分?jǐn)?shù)過低，樣品中各組分能完全分離，但保留時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，峰有不同程度的擴(kuò)散；甲醇體積分?jǐn)?shù)過高，保留時(shí)間相對(duì)縮短，但丹參酮A與其他峰有重疊，會(huì)給分析結(jié)果帶來(lái)誤差 3。流速的大小直接影響色譜柱系統(tǒng)的壓力、各組分分離度、洗脫時(shí)間等，流速太小，分析時(shí)間過長(zhǎng)；流速太大，系統(tǒng)的壓力過高 4。實(shí)驗(yàn)考察了流速為0.8 mL/min、0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min、1.2 mL/min、1.5