柴胡龍牡湯對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

1、LOGO柴胡龍牡湯柴胡龍牡湯對(duì)對(duì)小鼠小鼠LewisLewis肺癌細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究凋亡的影響及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科腫瘤科 潘玉真潘玉真 研 究 背 景 臨床運(yùn)用柴胡龍牡湯治療存在咳嗽、咳痰等肺 經(jīng)癥狀的肺癌患者 43例，顯效 5例（12%），有效 31例（72%），無(wú)效 7例（16%），總有效率（顯效有效）達(dá) 84% 1 。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)，該藥具有抑制 Lewis 肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤率可達(dá) 31.4% 2 。1調(diào)整氣機(jī)治療肺癌肺經(jīng)癥狀43例臨床研究. 秦海運(yùn)，殷東風(fēng);實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志, 2009,23

2、(4)80-82 .2肺積寧方對(duì)C57小鼠肺癌VEGF蛋白表達(dá)和生存質(zhì)量的影響現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009, 17（6）：1042-1045.柴胡龍牡湯前期研究中藥與細(xì)胞凋亡的研究腫瘤的發(fā)生不僅因細(xì)胞過(guò)度增殖，還與細(xì)胞凋亡機(jī)制受到抑制不能正常進(jìn)行細(xì)胞死亡清除有關(guān)細(xì)胞凋亡過(guò)程多因素、多基因聯(lián)合作用結(jié)果。中藥復(fù)方成分更為復(fù)雜，其作用多環(huán)節(jié)、影響細(xì)胞凋亡方面可能更為有效遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥與細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡與腫瘤研 究 背 景 實(shí) 驗(yàn) 動(dòng) 物C57BL/6J 近交系小鼠，共 60 只，4 - 6 周齡，清潔級(jí)，體重 18-20 g，雌雄各半。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)

3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí) 驗(yàn) 材 料瘤 株 Lewis 肺癌瘤株 ( Lewis Lung carcinoma LLC ) ，為小鼠來(lái)源的上皮樣肺腺癌細(xì)胞。 由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫教研室提供。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí) 驗(yàn) 材 料柴胡龍牡湯 藥物組成：由柴胡、龍骨、牡蠣、黃芩、半夏、太子參、桔梗、炙甘草等11味中藥組成。 藥物煎煮方法：先后用 10 倍水煎 60 min 、8倍水煎煮 40 min ，合并煎煮液，過(guò)濾后，濃縮至 1.0 g 生藥生藥 / ml，置于 4 冰箱保存?zhèn)溆?。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí) 驗(yàn) 藥 品順 鉑 順鉑(DDP)：齊

4、魯制藥有限公司產(chǎn)品, 制劑規(guī)格為10 mg / ml 。 每次給藥前用 0.9% 生理鹽水，把10mg 順鉑稀釋成1mg / ml 順鉑注射液備用。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí) 驗(yàn) 藥 品動(dòng) 物 造 模 細(xì)胞株的復(fù)蘇及C57BL/6J 小鼠體內(nèi)傳代 注入小鼠腹腔中，注入小鼠腹腔中，每只小鼠注射每只小鼠注射0.2ml0.2ml。加入加入2ml2ml生理鹽水生理鹽水吹打混勻吹打混勻離心兩次離心兩次每次每次5min5min3737水浴箱水浴箱-8080冰箱冰箱遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng) 物 造 模 模型制備遼寧中醫(yī)藥大學(xué)鏡下調(diào)整細(xì)胞濃度鏡下調(diào)整細(xì)胞濃度為為1 110107 7/

5、ml/ml無(wú)菌抽取無(wú)菌抽取小鼠腹腔積液小鼠腹腔積液腹部隆起腹部隆起明顯的小鼠明顯的小鼠0.2ml/只只，接種于，接種于小鼠右側(cè)腋部皮下小鼠右側(cè)腋部皮下 遼寧中醫(yī)藥大附屬醫(yī)院動(dòng) 物 分 組-模型組中藥組化療組綜合組正常組肺癌模型組接種肺癌瘤株，不做治療處理。中藥柴胡龍牡湯組接種肺癌瘤株，并中藥治療。單純順鉑化療組接種肺癌瘤株，并化療。柴胡龍牡湯順鉑綜合組接種肺癌瘤株，中藥聯(lián)合化療處理。正常對(duì)照組不做造模及治療處理。共分 5 組遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí) 驗(yàn) 給 藥 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)化療組順鉑注射液0.1ml /只只/ d （DDP 0.1mg） 腹腔注射化療，共3 次，于第1、3、5天

6、給藥。 同時(shí)生理鹽水0.4ml/只只/d灌胃，共12天中藥組柴胡龍牡湯0.4ml /只只/ d （含生藥0.4g） 灌胃，共連續(xù)12天。 第1、3、5天，生理鹽水0.1ml /只只/ d ，腹腔注射。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí) 驗(yàn) 給 藥 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)綜合組順鉑注射液給藥劑量、方法同化療組，柴胡龍牡湯用法同中藥組 。模型組正常組0.9%生理鹽水0.4ml /只只/ d 灌胃，共連續(xù)12天。 并于第1、3、5天， 0.9%生理鹽水0.1ml /只只/ d ，腹腔注射。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí) 驗(yàn) 取 材 各組小鼠均于末次給藥后24小時(shí)進(jìn)行取材完整剝離出瘤體，稱(chēng)重后于冰盒上，將瘤塊切開(kāi)在無(wú)壞死區(qū)共

7、取材 3 份，標(biāo)本塊大小約為1 mm3 。 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)Text蛋白測(cè)定 電鏡檢測(cè) 免疫組化檢測(cè) 立即置于-20冰箱中凍存?zhèn)溆谩?于戊二醛固定液中，4冷藏備用。 置于甲醛固定液中備用。 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院統(tǒng) 計(jì) 分 析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.0軟件包。計(jì)量資料 進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），），組間比較采用最小顯著差法（LSD）方法。等級(jí)資料 采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法-秩和檢驗(yàn)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí) 驗(yàn) 指 標(biāo)透射電鏡下觀(guān)察腫瘤組織超微結(jié)構(gòu)變化檢測(cè)腫瘤組織中 TNF 的蛋白表達(dá)，采用免疫組織化學(xué)法凋亡相關(guān)基因 Bax、 Bcl-2、Caspase3蛋白

8、表達(dá)，用 Western blot方法探討柴胡龍牡湯誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的分子作用機(jī)制 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤細(xì)胞透射電鏡觀(guān)察呈現(xiàn)出惡性腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出惡性腫瘤細(xì)胞特征。細(xì)胞核明顯增特征。細(xì)胞核明顯增大，核漿比例失調(diào)，大，核漿比例失調(diào)，核膜完整，雙層核膜核膜完整，雙層核膜清晰，核異形性明顯，清晰，核異形性明顯，細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)內(nèi)線(xiàn)粒體腫脹線(xiàn)粒體腫脹 嵴斷裂嵴斷裂消失，偶見(jiàn)粗面內(nèi)質(zhì)消失，偶見(jiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，散在核糖體顆粒。網(wǎng)，散在核糖體顆粒。模型組模型組- Lewis肺癌細(xì)胞肺癌細(xì)胞 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院結(jié) 果線(xiàn)粒體線(xiàn)粒體粗粗面面內(nèi)內(nèi)質(zhì)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)中

9、藥組中藥組- 凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞 呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡早期呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡早期的特點(diǎn)。的特點(diǎn)。細(xì)胞體積明細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)顯縮小，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，核膜稍擴(kuò)張，完整，核膜稍擴(kuò)張，核形不規(guī)整，核內(nèi)異核形不規(guī)整，核內(nèi)異染色質(zhì)增多、邊集，染色質(zhì)增多、邊集，濃縮成團(tuán)塊狀或新月濃縮成團(tuán)塊狀或新月?tīng)睿植荚诤四さ膬?nèi)狀，分布在核膜的內(nèi)側(cè)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器側(cè)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器基本正常。基本正常。H H異染色質(zhì)異染色質(zhì)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤細(xì)胞透射電鏡觀(guān)察結(jié) 果異染色質(zhì)異染色質(zhì)化療組化療組 - 壞死細(xì)胞壞死細(xì)胞 細(xì)胞體積異常細(xì)胞體積異常增大，核大畸增大，核大畸變，胞質(zhì)內(nèi)線(xiàn)變，胞質(zhì)內(nèi)線(xiàn)粒體、粗面內(nèi)粒體

10、、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核糖體顆粒脫落。糖體顆粒脫落。說(shuō)明存在重度說(shuō)明存在重度的炎性反應(yīng)的炎性反應(yīng)。 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤細(xì)胞透射電鏡觀(guān)察結(jié) 果中藥組中藥組 - 凋亡小體凋亡小體 化療組化療組 - 凋亡小體凋亡小體 綜合組綜合組 - 凋亡小體凋亡小體 凋亡小體：由膜包繞，小體內(nèi)可見(jiàn)核的殘片及胞質(zhì)。凋亡小體：由膜包繞，小體內(nèi)可見(jiàn)核的殘片及胞質(zhì)。 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤細(xì)胞透射電鏡觀(guān)察結(jié) 果凋亡小體凋亡小體凋亡小體凋亡小體凋亡小體凋亡小體瘤組織中TNF的免疫組化染色TNF 陰性陰性 (400) TNF 陽(yáng)性陽(yáng)性 (400) 細(xì)胞漿無(wú)棕色與背景著色一致細(xì)胞

11、漿無(wú)棕色與背景著色一致細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)均一的棕黃色細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)均一的棕黃色和深棕褐色顆粒狀染色和深棕褐色顆粒狀染色遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院結(jié) 果結(jié) 果瘤組織中TNF 的免疫組化染色結(jié)果結(jié)果分為結(jié)果分為4 4級(jí)級(jí): : 未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞為未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞為(-)(-)； 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 25% 25% 為為(+)(+)；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在 25% 25% 50% 50% 之間為之間為(+)(+)；陽(yáng)性細(xì)胞；陽(yáng)性細(xì)胞 50%50%為為(+)(+)。 組別組別 N TNF染色結(jié)果染色結(jié)果 模模 型型 組組 10 - 中中 藥藥 組組 10 + 化化 療療 組組 8 - 綜綜 合合 組組

12、 9 + 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院1 2 3 4模型組模型組 中藥組中藥組 化療組化療組 綜合組綜合組Bcl-2、Bax、Caspase3 蛋白表達(dá)電泳圖蛋白表達(dá)電泳圖遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院結(jié) 果結(jié) 果瘤組織中 Bcl-2、Bax 及Caspase3 蛋白表達(dá)結(jié)果( x S ) 組別組別 N Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax Caspase3 模 型 組 10 189.6219.19 78.459.55 2.41 31.124.60 中 藥 組 10 178.3418.28 114.4013.59 1.56 47.205.80 化 療 組 8 158.4516.

13、9 121.6013.381.30 60.657.35 綜 合 組 9 145.2214.63 133.614.63 1.08 81.0310.3 與模型組比較： p 0.01， p0.05； 與中藥組比較： p0.01， p0.05；與化療組比較： p0.01， p0.05。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院結(jié) 果瘤組織中 Bcl-2、Bax 及Caspase3 蛋白表達(dá)結(jié)果與與中藥組比較：中藥組比較： p 0.01； p 0.05。 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院正氣正氣內(nèi)虛內(nèi)虛 邪毒邪毒血瘀血瘀 痰濕痰濕 討 論遼寧中醫(yī)藥大學(xué)肺的宣發(fā)肅降功能失肺的宣發(fā)肅降功能失司，司，氣機(jī)紊亂氣機(jī)紊亂而發(fā)病而發(fā)病 肺積的病因病機(jī)病因病因?qū)е挛迮K六腑、陰陽(yáng)氣血的功能活動(dòng)紊亂、障礙, 從而產(chǎn)生相應(yīng)的種種病理變化。升降出入升降出入動(dòng)態(tài)失衡動(dòng)態(tài)失衡柴胡龍牡湯的理、法、方、藥升降平升降平衡理論衡理論 丹溪局方發(fā)揮“ 一升一降, 無(wú)有偏性, 是謂平人?！庇?論調(diào)暢氣機(jī)調(diào)暢氣機(jī)遼寧中醫(yī)藥大學(xué), 素問(wèn)六微旨大論“非出入則無(wú)以生長(zhǎng)壯老已,非升降則無(wú)以生長(zhǎng)化收藏”氣機(jī)氣機(jī)升降升降柴胡龍牡湯的理、法、方、藥討 論柴胡龍牡湯軟堅(jiān)散結(jié)重鎮(zhèn)降逆 升散之力 升降相宜，氣機(jī)暢達(dá) 通利三焦、開(kāi)三焦之結(jié)氣。 化痰止咳，可引藥于肺經(jīng)可行氣化痰，鎮(zhèn)咳止吐一升一降以開(kāi)宣肺氣入肺經(jīng)，可清肅肺熱柴胡 龍骨牡蠣桔梗